CN113862282B - 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 - Google Patents
大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113862282B CN113862282B CN202111139430.8A CN202111139430A CN113862282B CN 113862282 B CN113862282 B CN 113862282B CN 202111139430 A CN202111139430 A CN 202111139430A CN 113862282 B CN113862282 B CN 113862282B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcl
- seq
- sgrna
- soybean
- homologous gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 50
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 50
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 43
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 41
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 abstract description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 abstract description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 7
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 6
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 3
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 101000869488 Rhizobium radiobacter Aminoglycoside (3'') (9) adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012877 elongation medium Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 101150085507 AP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101000687561 Arabidopsis thaliana Pathogenesis-related homeodomain protein Proteins 0.000 description 1
- 101100428552 Arabidopsis thaliana VIL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100263704 Arabidopsis thaliana VIN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000005971 DNA damage repair Effects 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100284397 Oryza sativa subsp. japonica HAZ1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026786 pollen maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000018322 upland cotton Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，发明公开了一种大豆PCL同源基因编辑位点及其应用。本发明的大豆PCL同源基因编辑位点为两段各23个脱氧核糖核苷酸序列：5’‑AGGTGCGTAAGAAGGGCCAAGGG‑3’和5’‑GGGGAATGATGTTGATG GGGAGG‑3’。这两个编辑位点是对四个PCL同源基因第一个外显子进行编辑的有效靶标，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得四个PCL同源基因不同的等位基因突变体；为理解PCL四个同源基因对大豆生长发育和产量的调控提供了材料，也为培育大豆新品种提供了可靠的手段和素材。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆PCL同源基因编辑位点及其应用。
背景技术
为了保护自身免受外源遗传物质(如噬菌体、质粒)的侵袭，细菌和古细菌进化出了一种RNA分子介导的获得性免疫***，称为CRISPR(Mojica,et al.)。2013年，研究者利用化脓性链球菌的Cas9蛋白首次在哺乳动物细胞中实现了RNA引导下的精确靶向和基因组序列修饰，为CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因组编辑工具奠定了基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体***(Ma et al.,2016)，在该***中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。例如，Hendelman等通过对SlWOX9基因的启动子进行编辑产生不同的等位基因，发现SlWOX9在营养和生殖发育中的多效性作用；通过CRISPR/Cas9技术同时敲除了大豆AP1基因的四个同源基因(AP1a、AP1b、AP1c和AP1d)，获得了纯合的ap1a ap1b ap1c ap1d四突变体。ap1突变后主茎节数增加(Chen etal.,2020)；这对基因组编辑在农业中的应用具有重要意义(Hendelman et al.,2021)。
PHD(Plant Homedomain)结构是真核生物中进化保守的锌指结构域，在基因转录和染色质状态调控方面起重要作用。植物PHD转录因子家族参与生长及发育的调控，同时在植物非生物胁迫途径中发挥作用。Thomas等人发现拟南芥中的VIN3和VRN5在春化作用中发挥功能(Thomas et al.,2007)；PRHA基因能够参与调控抗病相关基因的表达(Yoshimochiet al.,2009)。在水稻中过量表达OsPHD1基因，能够增强抗逆性能，使转基因植株对低温、高盐和干旱胁迫的耐受性分别提高43.3％、60％和25％(刘雨，等2011)；MS1是参与花粉成熟的核信号分子(Korfhage et al.,1994)；HAZ1能够标识球形胚径向轴分化(Yukihiro etal.,2004)。杨雷等分析棉花在干旱、高盐(150mmol/L NaCl)、低温(4℃)非生物胁迫下PHD转录因子的表达，结果表明，部分PHD转录因子在陆地棉应答和适应非生物胁迫过程中可能发挥重要作用。
目前，对大豆中PHD转录因子的功能研究较少。本发明中四个大豆PCL(polycomb-like)同源蛋白均含有PHD结构，通过CRISPR/Cas9技术同时敲除四个大豆PCL同源基因，将为PCL基因的功能研究提供遗传材料，为提高大豆适应性和产量奠定理论基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大豆PCL同源基因编辑位点。
本发明的另一目的在于提供上述大豆PCL同源基因编辑位点的应用。
本发明的再一目的在于提供一种构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆PCL同源基因编辑位点，为两段各23bp的脱氧核糖核苷酸序列：5’-AGGTGCGTAAGAAGGGCCAAGGG-3’(SEQ ID NO.1)和5’-GGGGAATGATGTTGATGGGGAGG-3’(SEQ ID NO.2)。每个序列能够同时编辑2个PCL同源基因：SEQ ID NO.1编辑两个同源基因pcl-13G和pcl-17G，SEQ ID NO.2编辑两个PCL同源基因pcl-09G和pcl-15G。因此，这两个序列能够有效编辑四个PCL同源基因。编辑位点在四个PCL同源基因上的位置见图1。
所述pcl-13G、pcl-17G、pcl-09G、pcl-15G的登录号分别为：Glyma.13G100500、Glyma.17G059400、Glyma.0900G0597、Glyma.15G166200。
基因ID可以从https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax网址获取。
含有上述大豆PCL同源基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。
所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9。
所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。
所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆PCL同源基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过Bsa I酶切后连接得到。
所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种。
上述大豆PCL同源基因编辑位点、重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌在调节大豆生长发育状态和产量中的应用。
一种构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法，具体包括以下步骤：
(1)按照如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示大豆PCL同源基因编辑位点的序列合成sgRNA；
(2)在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；分别将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ IDNO.6退火，形成双链DNA；
(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA分别连接至两个sgRNA载体前，得到两个sgRNA表达盒；
(4)将步骤(3)中所述sgRNA表达盒串联，并与表达载体连接，得到Cas9sgRNA重组表达载体；
(5)将步骤(4)中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；
(6)除草剂筛选，得到转基因植株。
步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种；
步骤(4)中，当NGG第20位碱基为A时，sgRNA的5’端添加碱基为GTC。
步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9；
步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切；
步骤(5)中所述发根农杆菌优选为K599。
步骤(6)中所述筛选转基因阳性植株采用的除草剂为Basta。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的PCL同源基因编辑位点是对基因外显子区进行编辑的有效靶标，可对四个PCL基因的外显子区进行编辑，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得四个PCL基因的不同突变体。本发明的编辑位点对四个PCL同源基因外显子区进行编辑，以改变PCL编码蛋白的结构，从而改变PCL蛋白的功能，进而改变大豆的生长发育状态。为理解PCL四个同源基因对大豆生长发育和产量的调控提供了材料，也为培育大豆新品种提供了可靠的手段和素材。
2、大豆PCL同源基因编辑位点3’端含有GGG或AGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或***，造成目标靶点附近的突变。
附图说明
图1为编辑位点在大豆基因组四个PCL同源基因上的位置示意图。
图2为***有编辑位点T1和T2的Cas9 sgRNA表达载体示意图；其中，Cas9 sgRNA表达载体以pYLCRISPR/Cas9载体为骨架，带有除草剂基因(Bar)，Cas9基因，AtU3d和AtU3b启动子，靶点T1、T2和sgRNA表达载体。
图3为检测转基因毛状根靶点的编辑效果图；其中，A为农杆菌K599感染大豆子叶，培养15天后长出的毛状根，B为毛状根DNA扩增Cas9产物的电泳图，C为靶点的编辑结果。
图4为pcl四突变体在每个基因上的突变类型及测序结果；其中，A为pcl-13G(Glyma.13G100500)在靶点处***单碱基C；B为pcl-17G(Glyma.17G05940)在靶点处缺失7bp GGGCCAA；C为pcl-09G(Glyma.0900G0597)在靶点处***单碱基G；D为pcl-15G(Glyma.15G166200)在靶点处缺失单碱基G。
图5为野生型材料和pcl-qm突变体种植于不同环境下形态特征；其中，A为短日照种植条件下植株形态和B为长日照种植条件下野生型植株形态；W82为对照植株威廉姆斯82；#3-15-6为pcl-qm突变体，
图6为短日照条件下的成熟期突变体和野生型的节数、荚数、粒数统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
除非特别指出或是单独定义，本申请中所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。
实施例1***有PCL四个同源基因外显子区编辑靶位点T1、T2的Cas9sgRNA表达载体的构建
(1)主要试剂和来源
大肠杆菌感受态细胞DH5α、发根农杆菌菌株K599，均购自全式金公司；sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29和pYLCRISPR/Cas9载体(均在“A robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency MultiplexGenome Editing in Monocot and Dicot Plants”中公开)由华南农业大学刘耀光教授实验室提供。BsaⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Master Taq mix均购自TaKaRa公司；PCR产物回收、质粒提取试剂盒购自全式金公司；胰蛋白胨、琼脂粉、酵母提取物、氯化钠、卡那霉素、壮观霉素、利福平等化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由擎科生物公司完成。
靶点引物：
T1F:5’-gtcAGGTGCGTAAGAAGGGCCAA-3’(SEQ ID NO.3)；
T1R:5’-aaacTTGGCCCTTCTTACGCACC-3’(SEQ ID NO.4)。
T2F:5’-gtcaGGGGAATGATGTTGATGGGG-3’(SEQ ID NO.5)；
T2R:5’-aaacCCCCATCAACATCATTCCCC-3’(SEQ ID NO.6)。
第一轮PCR的引物：
U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO.7)；
gRNA-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.8)。
第二轮PCR的引物：
B1’:5’-TTCAGAGGTCTCTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.9)；
B2:5’-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO.10)；
B2’:5’-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.11)；
BL:5’-AGCGTGGGTCTCGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO.12)。
载体测序引物：
SP3F:5’-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3’(SEQ ID NO.13)；
SP1R:5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACC-3’(SEQ ID NO.14)。
(2)操作步骤
第一步：靶点引物退火成双链。
分别将两个靶点的正向和反向引物加入0.5×TE中混合成100μmol/L，分别取正、反向引物1μL加入PCR管中，补加98μL无菌水至100μL，PCR程序设置为90℃30s，室温冷却退火，分别得到两个靶点的双链DNA。
第二步：双链DNA与sgRNA载体酶切连接。
将采用引物T1F、T1R退火后的双链DNA与sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d相连，得到T1靶点与AtU3d的连接片段。采用引物T2F、T2R退火后的双链DNA与sgRNA载体pYLgRNA-AtU3b相连，得到T2靶点与AtU3b的连接片段。
表1 10μL酶切连接反应体系
PCR程序设置为：5个循环：37℃5min，20℃5min。
第三步：2轮PCR。
第一轮PCR，扩增gRNA表达盒：
表2 15μL PCR反应体系
PCR程序设置为：95℃2min；10个循环：95℃15s，55℃15s，72℃10s；25个循环：95℃15s，60℃15s，72℃10s。取3μL PCR产物，补加6μL无菌水和1μL 10×loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，查看是否出现500bp左右目的条带。
第二轮PCR，使用特定位置的通用引物B1’/B2和B2’/BL扩增获得带有特异性接头的包含T1、T2两个靶点和sgRNA的完整sgRNA表达盒。20μL的反应体系：10μL Master Taqmix，前后引物各1.5μL，第一轮PCR产物稀释10倍后的溶液1μL，无菌水补足到20μL。PCR反应程序设置为：95℃2min，35个循环：95℃10s，58℃15s，72℃20s。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪查看是否有500bp的条带。如果成功，进行胶回收纯化，并检测回收DNA片段的浓度。
第四步：两段sgRNA表达盒串联并与pYLCRISPR/Cas9载体连接，得到Cas9sgRNA表达载体(图2)
表3 15μL反应体系
PCR程序设置为：37℃5min，10℃5min，20℃5min，37℃5min，15cycles。
第五步：连接产物的转化
E.coli DH5α感受态细胞冰上解冻后加入10μL上一步得到的表达载体，轻轻弹动混合均匀。冰浴30min，42℃金属浴中热激1min，然后立刻冰浴2min。加500μL不含抗生素的LB培养液，37℃220rpm振荡培育1小时，5000rpm离心1min，倒掉部分上清液，重悬菌液后均匀涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单克隆，使用引物SP3F、SP1R进行PCR检测，阳性克隆送瑞博兴科公司测序。
实施例2大豆转基因毛根靶点编辑效果检测
(1)主要试剂和来源
本实验提取毛根DNA来自栽培大豆W82(Glycine max Wm82.a2.v1)。发根农杆菌感受态细胞K599、质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8；毛根诱导培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，2％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂Basta，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素、壮观霉素、利福平等化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
Cas9的引物：
Cas9-F:5’-CAACACCGACCGCCACTC-3’(SEQ ID NO.15)；
Cas9-R:5’-TGCCGCTCTGCTTATCCC-3’(SEQ ID NO.16)。
检测靶点的引物：
pcl-09-F:5’-GTTAGCAGAGGGGATCAAACC-3’(SEQ ID NO.17)；
pcl-09-R:5’-GACAAAGTAAGTTTCCCTCAAATTGTC-3’(SEQ ID NO.18)；
pcl-13-F:5’-GTCCGATCGTTGTCCTATTTATACAG-3’(SEQ ID NO.19)；
pcl-13-R:5’-GGTTTATAATCAACCATATAGCATATCC-3’(SEQ ID NO.20)；
pcl-17-F:5’-TGTCGTGCTCATTTCTTTACGGG-3’(SEQ ID NO.21)；
pcl-17-R:5’-CCATATAGCAGCATACTATACCA-3’(SEQ ID NO.22)；
pc-15-F:5’-GAGGGGATTGAACTTGTGACCTTCCCCC-3’(SEQ ID NO.23)；
pcl-15-R:5’-CTATTGATGGAGAAATTATGCATTATACACG-3’(SEQ ID NO.24)。
(2)操作步骤
第一步：K599农杆菌转化。
实施例1测序正确的阳性克隆进行质粒提取。取50μL K599感受态细胞，加入0.1μg阳性质粒，轻轻混匀，冰浴30min，液氮冷冻1min，37℃水浴热激5min，冰上冷却2min。菌液接种于500μL YEP培养基，28℃220rpm震荡培养2.5h，离心1min，悬浮细胞均匀涂布在加有卡那霉素，壮观霉素，利福平抗生素的YEP培养基上，28℃倒置培养36h。用引物SP3F、SP1R进行菌落PCR，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否出现1000bp左右的目的条带。阳性菌株放于培养箱，28℃培养菌液至OD＝0.6左右。
第二步：侵染大豆子叶。
选取颗粒饱满均匀的Willam82品种大豆种子，10％H2O2对种子表面进行消毒1min，然后用无菌去离子水冲洗干净。将消毒的种子播种在萌发培养基中，在大豆人工气候室中培养5天左右。用解剖刀在大豆子叶的正面挖个小洞，每个洞中加入10μL菌液将处理好的子叶摆放到毛根诱导培养基上，25℃光照培养15天左右，毛状根长出(图3A)。
第三步：靶点编辑效果检测。
根据DNA提取试剂盒上的步骤，将第二步得到的转基因毛状根样品进行DNA提取。以提取的毛状根DNA为模板，用CAS9引物和靶点检测引物分别扩增靶点所在区域的片段。PCR反应体系：5μL Master Taq mix，正向引物和反向引物各0.2μL，0.5μL DNA模板，ddH2O补足到10μL。PCR程序为：94℃2min；35个循环：95℃30s，59℃30s，72℃1min；最后72℃5min。CAS9 PCR有带(图3B)的毛根对应的靶点检测引物扩增产物送到天一辉远公司测序，利用BioEdit软件查看测序数据，由靶位点的测序结果查看靶点的编辑效果(图3C)，测序结果显示，从靶点处往后都是双峰，说明该靶点可以有效编辑。
实施例3大豆转基因纯合突变体的获得
(1)主要试剂和来源
本实验转化外植体是栽培大豆威廉姆斯82(W82，Glycine max Wm82.a2.v1)。根癌农杆菌菌株EHA101、质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8。共培养营养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.5％BBL琼脂，3％蔗糖，1mg/mL BAP，1mg/mL GA3，0.4mg/mL半胱氨酸胺，0.154mg/mL二硫苏糖醇，pH＝5.8。芽诱导培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，1mg/mL BAP，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8。茎伸长培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8，1mg/mL IAA，1mg/mL GA3，1mg/mL玉米素Zeatin-R。生根培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，0.5mg/mL NAA，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
(2)操作步骤
1)种子萌发：将大豆种子在氯气中进行干燥表面消毒16小时后取出，置于超净工作台内吹30min除去氯气，播种于萌发培养基上，28℃光照培养3天。
2)农杆菌菌液准备：从新鲜YEP板上挑取单克隆(经实施例2验证基因编辑效果后的质粒转化农杆菌EHA101得到)放入2mL添加了卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的YEP液体培养基中，摇过夜培养，从中取2mL饱和菌液于加有卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的250mL的YEP液体中，于28℃摇至过夜，离心收集菌落，用完全培养基(complete medium,CM)悬浮EHA101菌液至OD650为1.0。
3)共培养：将菌液倒入培养皿中，用解剖刀切下发芽的种子，沿子叶下胚轴垂直剖开豆子，除去胚轴上的幼芽，在子叶节区域内垂直于轴切出7-8个切口；将切好的外植体放到有悬浮菌液的培养皿中侵染30分钟，用镊子将外植体转移到共培养营养基上，切口向下，封好后于培养箱中暗培养3天。
4)幼芽诱导：共培养3天后，将外植体置于芽诱导培养基上生长14天后，在子叶节部位齐平切取子叶节下胚轴，将新露出的伤口***新的芽诱导培养基中，继续培养14天。
5)幼芽生长：切去分化外植体上的子叶，并在节的基部切一个新的切口，然后将外植体转移到茎伸长培养基上，在培养室中生长2-8周，每两周换一次新的培养基，每次都在外植体的基部切一个新鲜的水平切口。
6)生根：幼芽生长到3cm长时，把他们从组织上切下，然后将其转移到装有生根培养基的培养瓶中培养，2周之后，待幼苗长出足够多根后，将其转移到基质中于培养箱中培养4周，然后将小苗转移到温室培养至结荚。
7)转基因植株的检测：
除草剂筛选：在转基因植株上选取完全展开的三出复叶中一片，用记号笔在一半作标记，另一半用棉签蘸取浓度为150mg/L的除草剂Basta涂抹在叶片正面，3天后观察叶片变化。如果叶片发生失绿、变黄，枯萎或者有色斑点产生则说明该植株不抗除草剂，为阴性的非转基因材料；如果叶片没有发生变化，说明其植株内有除草剂抗性，可能为阳性植株。
转基因植株的鉴定：抗除草剂的T0代植株收获种子之后，进行T1代繁种，T1代植株通过叶片涂抹除草剂，筛选获得除草剂抗性有分离的株系。收取新叶提取DNA，用SP3F、SP1R引物进行PCR鉴定，阴性的植株利用靶点检测引物进行PCR，PCR产物送测序检测靶点编辑情况。检测结果显示，已获得一种无cas9骨架的纯合pcl-四突变体(pcl-qm,pcl quadruplemutant)，编号为#3-15-6，pcl-qm在四个同源基因上的具体变异情况为：Glyma.0900G0597(pcl-09G)在靶点处***单碱基G；Glyma.13G100500(pcl-13G)在靶点处***单碱基C；Glyma.15G166200(pcl-15G)在靶点处缺失单碱基G和Glyma.17G05940(pcl-17G)在靶点处缺失7bp GGGCCAA(图4A-D)。将#3-15-6编号的pcl-qm突变体与野生型材料W82同时种在短日照(12h光照/12h黑暗)和长日照(16h光照/8h黑暗)两种条件下，对应的植株分别为图5A和图5B(出苗后20天的生长状态)。突变体与野生型相比，表现为生长发育速度减缓，株高变矮，主茎节数减少。但随着生长发育到成熟期时，短日照(12h光照/12h黑暗)条件下，突变体与野生型材料比较主茎节数并没有显著差异，单株总荚数以及单株总粒数显著增加，如图6所示。突变体在调节大豆生长发育状态和提高大豆单株产量方面具有潜能。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州大学
<120> 大豆PCL同源基因编辑位点及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtgcgtaa gaagggccaa ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggaatgat gttgatgggg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcaggtgcg taagaagggc caa 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacttggcc cttcttacgc acc 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcaggggaa tgatgttgat gggg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacccccat caacatcatt cccc 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcaataact tcgtataggc t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcgtgctcc acatgttgac c 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caacaccgac cgccactc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgccgctctg cttatccc 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttagcagag gggatcaaac c 21
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacaaagtaa gtttccctca aattgtc 27
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtccgatcgt tgtcctattt atacag 26
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtttataat caaccatata gcatatcc 28
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgtcgtgctc atttctttac ggg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccatatagca gcatactata cca 23
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaggggattg aacttgtgac cttccccc 28
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctattgatgg agaaattatg cattatacac g 31
Claims (8)
1.大豆PCL同源基因编辑位点、含有大豆PCL同源基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌在减缓大豆生长发育状态和提高产量中的应用，其特征在于，所述大豆PCL同源基因编辑位点为两段23个脱氧核糖核苷酸序列：SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2；所述SEQ ID NO .1的序列为 5’-AGGTGCGTAAGAAGGGCCAAGGG-3’，所述SEQ ID NO .2的序列为5’-GGGGAATGATGTTGATGGGGAGG-3’；SEQ ID NO .1编辑两个同源基因pcl-13G和pcl-17G，SEQ ID NO .2编辑两个PCL同源基因pcl-09G和pcl-15G；所述pcl-13G、pcl-17G、pcl-09G、pcl-15G的登录号分别为：Glyma .13G100500、Glyma .17G059400、Glyma .0900G0597、Glyma .15G166200；
所述应用为利用大豆PCL同源基因编辑位点、含有大豆PCL同源基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌构建PCL同源基因突变体遗传材料，所述PCL同源基因突变体遗传材料在四个同源基因上的具体变异情况为：Glyma .0900G0597在靶点处***单碱基G；Glyma .13G100500在靶点处***单碱基C；Glyma .15G166200在靶点处缺失单碱基G和Glyma .17G05940在靶点处缺失7bp GGGCCAA。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9；所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组表达载体是sgRNA载体与所述大豆PCL同源基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI 酶切后连接得到；
所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述构建PCL同源基因突变体遗传材料，具体包括以下步骤：
（1）按照如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示大豆PCL同源基因编辑位点的序列合成sgRNA；
（2）在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；分别将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ IDNO.6退火，形成双链DNA；
（3）构建sgRNA表达盒：将步骤（2）形成的双链DNA分别连接至两个sgRNA载体前，得到两个sgRNA表达盒；
（4）将步骤（3）中所述sgRNA表达盒串联，并与表达载体连接，得到Cas9 sgRNA重组表达载体；
（5）将步骤（4）中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；
（6）除草剂筛选，得到转基因植株。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（4）中，当NGG第20位碱基为A时，sgRNA的5’端添加碱基为GTC。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，
步骤（3）中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种；
步骤（4）中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（3）中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤（4）中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，
步骤（5）中所述发根农杆菌为K599；
步骤（6）中所述筛选转基因系采用的除草剂为Basta。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111139430.8A CN113862282B (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111139430.8A CN113862282B (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113862282A CN113862282A (zh) | 2021-12-31 |
| CN113862282B true CN113862282B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=78991451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111139430.8A Active CN113862282B (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113862282B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006138005A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-12-28 | Monsanto Technology, Llc | Genes and uses for plant improvement |
| CN103102400A (zh) * | 2011-11-14 | 2013-05-15 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用 |
| WO2017044476A1 (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for recombinase-based genetic diversification |
| CN113265418A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用 |
| CN113265406A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 大豆fdl12基因编辑位点及其应用 |
| CN113265403A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 大豆Dt1基因编辑位点及其应用 |
| CN113308481A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-27 | 广州大学 | 一种大豆dgat2基因外显子编辑位点及其应用 |
-
2021
- 2021-09-26 CN CN202111139430.8A patent/CN113862282B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006138005A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-12-28 | Monsanto Technology, Llc | Genes and uses for plant improvement |
| CN103102400A (zh) * | 2011-11-14 | 2013-05-15 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用 |
| WO2017044476A1 (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for recombinase-based genetic diversification |
| CN113265418A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用 |
| CN113265406A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 大豆fdl12基因编辑位点及其应用 |
| CN113265403A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-17 | 广州大学 | 大豆Dt1基因编辑位点及其应用 |
| CN113308481A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-27 | 广州大学 | 一种大豆dgat2基因外显子编辑位点及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113862282A (zh) | 2021-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113265418B (zh) | 一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用 | |
| CN113265403A (zh) | 大豆Dt1基因编辑位点及其应用 | |
| US20230265447A1 (en) | Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations | |
| CN109852634B (zh) | 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法 | |
| CN115960192A (zh) | GmASHH2a/b蛋白及其编码基因在调控大豆晚花中的应用 | |
| CN116590301A (zh) | 一种杂交鹅掌楸LhWUS基因及其表达蛋白和应用 | |
| CN113862282B (zh) | 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 | |
| CN116064653B (zh) | 番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用 | |
| CN117802151B (zh) | 水稻根结线虫感病基因OsThil在调控水稻对根结线虫的抗性方面的应用 | |
| CN114990131B (zh) | OsHLS1在获得半矮化水稻中的应用 | |
| CN116121298B (zh) | 抑制hsrp1基因的表达在提高植物耐热性中的应用 | |
| CN117051006A (zh) | 一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用 | |
| CN117904174A (zh) | 大豆sweet同源基因的编辑位点作为靶点在调控大豆的下胚轴长度中的应用 | |
| CN116751808A (zh) | 调控植物开花和成熟时间的方法及其生物材料与应用 | |
| CN117384919A (zh) | 一种NtERF283基因及其编码的蛋白与应用 | |
| CN118222582A (zh) | 一种大豆耐盐相关基因GmHKT6及其应用 | |
| CN115927381A (zh) | 一种油菜rna加工因子ncbp基因及其应用 | |
| CN115948451A (zh) | LsARF3蛋白或其编码基因在调控叶用莴苣的高温抽薹性能中的应用 | |
| CN117025627A (zh) | 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用 | |
| CN116411015A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法 | |
| CN117070515A (zh) | 一种水稻生物钟基因OsPRR37启动子区引导RNA双靶点序列及其应用 | |
| CN118048366A (zh) | 一种大豆根系镉抗性相关基因GmEIL3及应用 | |
| CN117126860A (zh) | Dtx31基因及其用途 | |
| CN116590338A (zh) | 基于CRISPR/Cas9与BeYDV结合的植物基因修复和***的载体和构建方法 | |
| CN116590331A (zh) | SmD3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |