CN101508726B

CN101508726B - 植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101508726B
Application number: CN2009100811265A
Authority: CN
Inventors: 武维华; 邹俊杰; 魏凤菊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2009-04-02
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2029-04-02
Also published as: CN101508726A

Abstract

本发明公开了一种与植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID No.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID No.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性相关功能的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。该基因具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的蛋白及其编码基因可用于培育耐旱性提高的植物新品种。

Description

植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于拟南芥的植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

干旱是非生物胁迫中限制作物产量的主要因素，由于干旱而导致的作物损失量超过其他逆境造成损失的总和。随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。因此，了解和认识植物对干旱胁迫的反应机制，进而提高植物特别是农作物的抗旱能力，已成为如何进一步提高作物产量的重要研究工作，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种典型的模式植物(其作用与实验鼠、果蝇等模式生物相当)，已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥约有1.3亿个碱基对，约2.7万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已经成为一种有效的方法。对拟南芥而言，T-DNA***突变是主要途径，并且已经得到大量T-DNA***突变体。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到与之同源的序列，有关拟南芥的绝大多数发现也都能应用于其他植物研究。以往的研究已经证明，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。面对农作物生产中日益严重的土壤干旱问题，克隆植物耐旱基因并对其功能进行研究，对尽快培育作物耐干旱品种有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物耐旱性相关蛋白，名称为AtDT-2(Arabidopsis thalianaDrought Tolerance)，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2所示的蛋白序列由545个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的AtDT-2分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的AtDT-2便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的AtDT-2可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的AtDT-2的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物耐旱性相关蛋白的编码基因(AtDT-2)也属于本发明的保护范围。

上述植物耐旱性相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码框为序列表中SEQ ID №：1的5′端第227-1864位核苷酸序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列1是由2568个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5′端第227-1864位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

上述植物耐旱性相关蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与1)、2)或3)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有上述植物耐旱性相关蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的AtDT-2基因导入植物细胞，或将AtDT-2基因过表达，提高了转基因植株对干旱的耐受能力。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的耐旱基因对于植物耐干旱分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为拟南芥突变体(Salk_082441)的***突变基因的鉴定结果；

图2为干旱条件下拟南芥突变体(Salk_082441)的表型分析结果；

图3为GUS染色方法进行AtDT-2基因表达定位结果

图4为AtDT-2在不同组织部位的表达结果

图5为AtDT-2基因在AtDT-2基因过量表达植株(OE)、突变体Salk_082441和Salk_082441恢复突变植株(COM)中的表达RT-PCR结果；

图6为野生型(Columbia型)、突变体(Salk_082441)、过量表达植株(OE2)及突变体Salk_082441恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理表型分析；

图7为野生型(Columbia型)、突变体(Salk_082441)、过量表达植株(OE2)及突变体Salk_082441恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理土壤相对含水量变化结果；

图8为野生型(Columbia型)、突变体(Salk_082441)、过量表达植株(OE2)及突变体Salk_082441恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理离体叶片失水速率结果。

具体实施方式

实施例1、植物耐旱性相关的基因及其编码蛋白的获得

一、Columbia背景的对耐旱性敏感的拟南芥突变体的获得

从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购得到编号为Salk_082441的T-DNA***突变体T₄代种子(简称突变体Salk_082441)，该编号为Salk_082441的T-DNA的纯合突变体在土壤干旱条件下表现为较野生型(Columia型)敏感症状。

1、Salk_082441进行T-DNA***的纯合体获得和鉴定

首先对Salk_082441进行T-DNA***的纯合鉴定。利用http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html网站进行引物设计。突变体Salk_082441中T-DNA***突变体的获得是通过载体pBIN-pROK2将携带的T-DNA***到目的基因，从而导致目标基因功能丧失。Salk_082441 T-DNA***突变体的鉴定需要3条引物，分别是LP、RP和Lba1。其中LP、RP为AtDT-2基因组上的序列，Lba1为T-DNA***左边界的序列，三条引物的序列分别为：

LP：5’-ccaacaatccgactcagaa-3’

RP：5’-atcctgatccgactaagcg-3’

Lba1：5’-tggttcacgtagtgggccatcg-3’。

分别以LP/RP和Lba1/RP为引物对，以T-DNA***突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增，鉴定表明上述Salk_082441的T-DNA***突变体T₄代种子为纯合的T-DNA***突变体Salk_082441。

2、***突变基因的表达鉴定

同时，以野生型(Columbia型)和DNA水平鉴定为纯合***的突变体Salk_082441在MS培养基生长两周幼苗为材料，各取100-200mg，用Trizol(Invitrogen)提取其总RNA，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。ss cDNA的合成按照Supercript II(Invitrogen)的使用说明，合成单链ss cDNA。用引物Primer1：5’-gacatatgatgggtaactgtaacgcctg-3’(下划线部分为保护碱基和NdeI切点)和Primer2：5’-gagtcgacttaaacaggaacagtttgtcca-3’(下划线部分为保护碱基和SalI切点)进行半定量RT-PCR鉴定***突变的预测基因是否表达。

扩增条件如下：将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20μL体系，内含10×PCR缓冲液2μL，2.5mM dNTP mix 0.4μL，10μM Primer1和Primer2各0.4μL，Taq DNA聚合酶(15U/μL)0.2μL。在PE 9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min40s，共计35个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(1654bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

EF基因为看家基因，作为对照。其扩增引物为Primer3：5’-atgccccaggacatcgtgatttcat-3’，Primer4：5’-ttggcggcacccttagctggatca-3’。该看家基因的扩增方法为：将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：20μL体系，内含10×PCR缓冲液2μL，2.5mM dNTP mix 0.4μL，10μMPrimer3和Primer4各0.4μL，Taq DNA聚合酶(15U/μL)0.2μL。在PE 9700上扩增：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，共计20个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物(685bp)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

***突变基因的表达检测结果如图1所示，结果表明，该突变基因在野生型(Columbia型)中有表达，而在突变体Salk_082441中，完全被敲除，不表达。

3、突变体Salk_082441在干旱条件下的表型观察结果

拟南芥野生型(Columbia型)和突变体Salk_082441在MS培养基上生长7天后移栽至土壤中。温室培养条件：温度22℃、光照强度为100μmol·m^-2·s^-1，光周期：16h(光)/8h(暗)，相对湿度60％-70％。植物材料在土壤中继续生长两周后，分别分成两组，一组停止浇水进行干旱处理(其他条件相同继续培养)，干旱处理21天(干旱处理)，另一组继续按照正常浇水培养方法培养21天(阳性对照)。然后均恢复浇水，培养1天，上述过程中观察植株表型。

结果如图2所示，结果表明，突变体Salk_082441叶片萎蔫严重，野生型(Columbia型)叶片轻度萎蔫；恢复浇水后，野生型植株能恢复生长，而突变体Salk_082441不能恢复生长，全部死亡。图2中1为正常浇水培养的拟南芥野生型(Columbia型)，2为正常浇水培养的突变体Salk_082441，3为干旱处理的拟南芥野生型(Columbia型)，4为干旱处理的突变体Salk_082441，5为干旱处理恢复浇水后的拟南芥野生型(Columbia型)，6为干旱处理恢复浇水后的突变体Salk_082441。

二、本发明抗旱相关基因(AtDT-2)及其编码蛋白的获得

1、本发明抗旱相关基因(AtDT-2)的cDNA的获得

按照步骤一的步骤1的方法提取拟南芥(Columbia型)幼苗总RNA、反转录为cDNA。以此cDNA为模板、利用分别设有KpnT和SacI酶切位点的一对引物进行PCR扩增，得到抗旱相关基因的cDNA全长。引物序列如下：

Primer5：5’-ttggtaccatgggtaactgtaacgcctgt-3’(KpnI)；

Primer6：5’-ttgagctcttaaacaggaacagtttgtccag-3’(SacI)。

采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶对AtDT-2 cDNA全长进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 1μL，10μM Primer5和Primer6各1μL，Pyrobest DNA聚合酶0.25μL，模板3-5μL(共0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，56℃30s，72℃1min30s，循环数30个，72℃延伸10min。

将扩增片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，为本发明的抗旱相关基因cDNA基因命名为AtDT-2，序列表中序列1的核苷酸序列由1638个碱基组成，其编码序列为自序列表中序列1的第227-1864位核苷酸，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。将上述获得的正确的含有AtKH-2的重组载体命名为pMD18-AtDT-2。

2、本发明抗旱相关基因(AtDT-2)的基因组DNA的获得

采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA，以此为模板，利用分别设有SacI和SalI酶切位点的一对引物扩增目的基因的全长(4682bp)，引物序列如下(下划线为保护碱基和酶切位点)：

Primer7：5’-ttgagctctacttaatccaccacatgtccct-3’(SacI)；

Primer8：5’-ttgtcgactgatggtgtctgcaattgtagaac-3’(SalI)。

采用Takara公司的LA Taq DNA聚合酶对AtDT-2基因全长及启动子区域进行扩增，扩增体系为50μL，含10×LA PCR缓冲液5μL，10mM dNTP mix 8μL，10μM Primer7和Primer8各2μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL，模板3-5μL(约0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性3min，95℃变性1mim，56℃1min，72℃5min，循环数30个，72℃延伸20min。将扩增片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列3的核苷酸序列，为本发明的抗旱相关基因cDNA基因命名为AtDT-2，序列表中序列3的核苷酸序列由4682个碱基组成，自序列表中序列3的第1691-2342位核苷酸为第一个外显子，第2476-2619位核苷酸为第二个外显子，第2712-2864位核苷酸为第三个外显子，第2954-3069位核苷酸为第四个外显子，第3178-3345位核苷酸为第五个外显子，第3438-3668位核苷酸为第六个外显子，第3786-3959位核苷酸为第七个外显子，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。将上述获得的正确的含有AtKH-2基因组DNA的重组载体命名为pMD18-gAtDT-2。

实施例2、本发明的植物耐旱性相关的基因及其编码蛋白的功能验证

一、AtDT-2在植物组织中的表达定位结果

1、GUS染色方法进行AtDT-2基因表达定位

以CTAB法提取拟南芥(Columbia型)基因组DNA，采用Takara公司Pyrobest DNA聚合酶进行PCR扩增AtDT-2启动子，片段长度1573bp，反应条件：95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min 40s，30个循环；72℃10min。引物Primer9：5’-aagcacttaagctctgtgtgg-3’，Primer10：5’-tttagttcatatggacgccg-3’。

将PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶回收，末端补A后，装入Takara公司pMD18-T载体上，测序正确后采用BamH I和PstI切下启动子目的片段，***到pCAMBIA1381载体的BamHI和PstI酶切位点之间得到重组载体。将该重组载体PCR、酶切鉴定，将确认正确的含有AtDT-2启动子和其下游连接的GUS基因的重组载体命名为P_AtDT-2::GUS。用P_AtDT-2::GUS转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞(Clough和Bent，1998，Plant J.16：735-743)，进行PCR鉴定阳性克隆，将鉴定正确的含有P_AtDT-2::GUS的重组菌株采用农杆菌介导的花芽浸沾法(Clough和Bent，1998，Plant J.16：735-743)转化野生型拟南芥(Columbia型)植株，获得转P_AtDT-2::GUS拟南芥植株，收获T₁代种子。T₁代种子在含有50μg/mL的潮霉素的MS培养基上进行筛选，得到根和叶均能生长的阳性转化植株，继续栽培，单株种植单株收T₂代种子。在含有50μg/mL的潮霉素的MS培养基上统计T₂代幼苗的分离比(抗潮霉素：不抗潮霉素)，统计数分离比符合3∶1χ²检验的T₂代幼苗继续繁种至T₃代，即为纯合的转P_AtDT-2::GUS拟南芥种子。

将纯合的转P_AtDT-2::GUS拟南芥T₃代转化材料进行GUS染色，染色液含0.5mg/mLX-gluc、0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0)、0.5mM铁***、0.5mM的亚铁***、10mMEDTA(pH 8.0)、2％(V/V)甲醇、0.1％(V/V)Triton x-100。具体染色方法为：将待染色的材料浸入X-gluc染色液中，于37℃避光孵育12h，用磷酸缓冲液冲洗材料，浸泡在75％酒精进行脱色，照相。在进行叶片染色前将叶片在不含X-gluc的染色液中抽气10min，然后再进行染色。结果如图3所示，GUS染色结果表明AtDT-2基因在植物的各个部位具有表达。图3中，1为萌发两天幼苗，2为萌发七天幼苗，3为成苗叶片，4为保卫细胞，5为花器官。

2、AtDT-2在不同组织部位的表达

Trizol(Invitrogen)试剂分别提取拟南芥萌发2天幼苗、7天幼苗、土壤栽培四周植株的根、茎、莲坐叶、花、角果、茎生叶材料的RNA，利用Supercript II(Invitrogen)反转录获得单链cDNA，分别采用引物对不同部位进行定量RT-PCR扩增，EF为看家基因，具体方法如实施例1的步骤一中的步骤2所示。

结果如图4所示，结果表明AtDT-2基因的表达具有普遍性，在叶片中表达较高。图4中1为萌发2天幼苗，2为萌发7天幼苗，3为根，4为茎，5为莲坐叶，6为花，7为角果、8为茎生叶。

二、AtDT-2基因转基因功能验证

1、AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2植株)和Salk_082441恢复突变体植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体)的获得

将pMD18-AtDT-2粒，用KpnI和SacI进行酶切，回收得到1638bp的AtDT-2 cDNA片段，将该片段***到表达载体pBIB-Super质粒(pBIB-Super载体的构建方法：利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT和tctagaCTAGAGTCGATTTGGT从质粒pMSP-1(Ni M，Cui D，Einstein J，Narasimhulu S，Vergara C，Gelvin SB. Strenght and tissuespecificity of chimaeric promoters derived from the octopine and mannopinesysthas

将pMD18-gAtDT-2用SacI和SalI进行双酶切，回收4682bp的AtDT-2基因组基因片段，将该片段***到pCAMBIA1300质粒(CAMBIA公司)的SacI和SalI酶切位点之间，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将简单表明正确的含有AtDT-2基因组基因的重组载体命名为pCAMBIA1300-gAtDT-2。

分别将super::AtDT-2或pCAMBIA1300-gAtDT-2转化根癌农杆菌GV3101的感受态细胞得到重组菌，利用菌落PCR和酶切的方法鉴定，将经鉴定表明含有得到super::AtDT-2的阳性克隆菌株命名为GV-super::AtDT-2，将经鉴定表明含有得到pCAMBIA1300-gAtDT-2的阳性克隆菌株命名为GV-pCAMBIA1300-gAtDT-2。

将GV-super::AtDT-2采用农杆菌介导的花芽浸沾法(Clough和Bent，1998，PlantJ.16：735-743)导入拟南芥野生型(Columbia型)中，将GV-pCAMBIA1300-gAtDT-2也采用上述农杆菌介导的花芽浸沾法导入拟南芥Salk_082441突变体，然后分别收获T₀植株的种子，即分别得到T₁代种子。按照步骤一的步骤1的方法筛选单拷贝纯合突变体，经筛选共得到质粒单拷贝***AtDT-2过量表达纯合株系(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)5个，质粒单拷贝***Salk_082441恢复突变纯合株系(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)6个。

2、AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2植株)和Salk_082441恢复突变体植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体)的定量RT-PCR检测

对得到的单拷贝纯合株系进行定量RT-PCR检测，EF为看家基因，以野生型拟南芥(Columbia型)和突变体Salk_082441为对照，具体RT-PCR检测方法如实施例1的步骤一中的步骤2所示。

结果如图5所示，结果表明获得三个AtDT-2基因的表达量明显高于野生型植株的AtDT-2过量表达株系(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)，分别命名为OE1、OE2、OE3；两个AtDT-2的表达量与野生型(Columbia型)植株相当的Salk_082441恢复突变株系(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)，分别命名为COM1、COM2。图5中1为野生型拟南芥(Columbia型)，2为拟南芥突变体Salk_082441，3为转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE3，4为转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE1，2为转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE2，6为转pCAMBIA1300-gAtDT-2变体纯合株系COM1，7为转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系COM2。

3、AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)和Salk_082441恢复突变体植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)的表型观察

将在MS培养基上萌发后生长7天的拟南芥野生型(Columbia型)、突变体Salk_082441 T₄代、AtDT-2过量表达(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)和Salk_082441恢复突变(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)幼苗移入土壤中继续生长2周，2周内正常浇水(具体条件如实施例1中步骤一的步骤3所示)；2周后停止浇水进行干旱处理(其他条件相同继续培养)，干旱处理21天后恢复浇水。整个过程观察各植株的表型。

结果如图6所示，干旱处理19天时，突变体Salk_082441表现明显的萎蔫症状，野生型(Columbia型，图6中A)表现轻微萎蔫，而AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE2，图6中C)和Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系COM2)生长良好；干旱处理21天时，突变体Salk_082441叶片表现严重萎蔫并发紫，野生型(Columbia型)和Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系COM2，图6中D)比AtDT-2过量表达植株(OE2，图6中C)表现更加明显的萎蔫表型，叶片卷曲程度高。恢复浇水后，突变体Salk_082441不能继续生长，全部死亡，而野生型(Columbia型)、AtDT-2过量表达植株(OE2，图6中C)和Salk_082441恢复突变植株(COM2，图6中D)都能继续生长，但AtDT-2过量表达植株(OE2，图6中C)的长势优于野生型和Salk_082441恢复突变植株(COM2，图6中D)，说明AtDT-2过量表达植株(OE2，图6中C)具有较野生型强的耐受干旱的能力。图6中A为野生型拟南芥，B为突变体Salk_082441，C为转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE2，D为转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系COM2。

4、野生型、突变体Salk_082441、AtDT-2过量表达植株(OE2)和Salk_082441恢复突变植株(COM2)四种材料生理指标的检测

1)土壤相对含水量变化检测

拟南芥野生型(Columbia型)、突变体Salk_082441T₄代、AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)OE2和Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)COM2按照步骤3的方法进行幼苗培养及干旱处理。在进行干旱处理之日起设定土壤最初含水量为100％，每隔三天称量小盆重量，测定土壤相对含水量(称重时小盆的重量/最初小盆的重量)。结果如图7所示，结果表明，从停止浇水的第6天开始，在同样的干旱处理时间，突变体Salk_082441的土壤相对含水量最少，AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE2)的土壤相对含水量最多，野生型(Columbia型)和Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系COM2)的土壤相对含水量基本一致，介于突变体Salk_082441和AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系OE2)之间。图7中，1为拟南芥野生型(Columbia型)，2为突变体Salk_082441T₄代，3为AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)OE2，4为Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)COM2。

2)土壤失水速率检测

将MS培养基上生长7天的拟南芥野生型(Columbia型)、突变体Salk_082441T₄代、AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)OE2和Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)COM2幼苗移栽到土壤中，在与步骤3的方法相同温室条件下继续生长4周，正常浇水。生长4周后，将植物材料的地上部剪下，立即称重，然后放在湿度40％、温度23-25℃条件下进行失水实验。每间隔一定时间进行称重，每个株系重复4次，以失去最初鲜重的百分比计算失水量，以单位时间的失水量表现为地上部的失水速率。结果如图8所示，野生型(Columbia型)和Salk_082441恢复突变植株(COM2)失水速率基本一致，突变体Salk_082441失水最快，AtDT-2过量表达植株(OE2)失水最慢。图8中，1为拟南芥野生型(Columbia型)，2为突变体Salk_082441T₄代，3为AtDT-2过量表达植株(转super::AtDT-2拟南芥纯合株系)OE2，4为Salk_082441恢复突变植株(转pCAMBIA1300-gAtDT-2突变体纯合株系)COM2。

序列表

<160>3

<210>1

<211>2568

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

gaatcaaaca aaatccgaaa tttcgaaagg tccgactttt cctcacctga acccgcgttt 60

tctctccccc tcccaaccca actctccaat tcgccggaaa atcaccgcca ccgtcacttc 120

cggcgtccat atgaactaaa gagataagct tttttcttct ataatccttc ttcttcttct 180

tccttgatct cctttctctg agtttgctga gtttcttaac tcagccatgg gtaactgtaa 240

cgcctgtgta aggccagact caaaagaatc aaaaccatct tcaaagccga aaaaacccaa 300

tcgagatcgg aaattaaacc cattcgccgg agatttcacc agatccccag ctccaatacg 360

tgttctcaaa gatgtaatcc ctatgagcaa tcaaactcag atcagcgaca aatacatctt 420

aggtcgtgaa ttaggtcgag gcgaattcgg aatcacttac ctctgtactg atcgtgaaac 480

ccacgaagct ttagcttgca aatcgatttc aaagcgaaag cttcgaacag ctgtcgatat 540

cgaagacgtt cgtcgtgagg tagcgattat gtctacttta cctgagcatc caaacgtagt 600

taagcttaag gctagttatg aggataacga gaacgtgcat ctggttatgg agctttgtga 660

aggaggtgag ctttttgatc ggattgttgc tagaggacat tacacggagc gtgctgctgc 720

agctgttgcg agaacgattg ctgaggttgt gatgatgtgt cactctaatg gagttatgca 780

tcgagatttg aaacctgaga atttcttgtt tgctaataaa aaggagaatt ctccactaaa 840

ggctattgat tttggcttgt ctgtgttctt caaacctgga gataagttta cagagattgt 900

aggaagtccg tattatatgg ctccagaagt gttgaagaga gattatggac caggggttga 960

tgtgtggagt gccggagtta ttatctatat cttgctctgt ggtgttcctc cgttttgggc 1020

tgagactgaa caaggtgttg ctcttgcgat cttgcgggga gttcttgatt ttaagagaga 1080

cccttggcct cagatatcag agagtgccaa gagccttgtg aagcagatgt tggatcctga 1140

tccgactaag cggttaactg ctcagcaagt gttagctcac ccatggatac agaatgcaaa 1200

gaaagctccc aatgttcctt taggagatat agtcagatct aggttgaagc agttctctat 1260

gatgaacaga ttcaaaaaga aagttcttcg tgtaattgcg gagcacttgt ctattcaaga 1320

ggttgaagtg ataaagaaca tgttctcact gatggatgat gacaaggatg gtaaaataac 1380

ttacccggaa ctcaaagctg ggcttcagaa ggtcggttca caacttggtg aaccagagat 1440

caaaatgttg atggaagtgg cggatgtcga tggaaatggg tttctggatt atggagagtt 1501

tgtagctgtg ataattcact tgcagaagat agagaatgat gaacttttca aactagcttt 1560

tatgtttttc gacaaagatg gaagtacata cattgaactt gatgagctac gggaagcttt 1620

agcggatgag ttaggcgagc cagacgccag tgttctaagc gacatcatgc gtgaagttga 1680

cactgacaag gacggacgta taaactatga tgagtttgtg acgatgatga aagctggaac 1740

tgactggaga aaggcatcga gacaatattc aagagagagg ttcaaaagct taagcattaa 1800

cttgatgaaa gatgggtcat tgcatctcca tgacgctctc actggacaaa ctgttcctgt 1860

ttaaatttat tcgttatcac caaaaacaga gcaatgctcc gttttttccc catttcataa 1920

attgggaatt ttccgggctt gttctttgag ggatgggaat tttacggaag ctatggttct 1980

ttacatatat aaacatttta cattgtattt tgtatgtaat gttttgttca aaggttgtat 2040

ttttattgtc tcaaagcccc taaaccaaag agtcaaagga aagatcttta ttacactgac 2100

accttatcaa actcagcaga agtcttgtcc atgtccttgt ccttggccac aacatctttg 2160

taacggtacc aatgtgagac caacaagaaa taggccaagt ttagagtcat cataccagca 2220

accaagaagt agaaatactc caatcttccc ttgtttaaat cttccggaag ccaacttcct 2280

cctgaaaatc cctctgtggt atcgtgtacc gccgataaca aaaaggtgct gaggtaactc 2340

gccaatccga ttccacaata atacagagaa ccagcaaaac ttcgcatgtt ctctggaaac 2400

tgtttgtagt aaaactccat ttgtccaact ccagcgaggg cgtccgcgat acccattagc 2460

actagctgag gaatcaacca cataccggac atcgaagaga ttgcgccttt tcttggggcc 2520

aaccctagcg tcggttttgt gagagctacc tttcttctgt attgttct 2568

<210>2

<211>545

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Gly Asn Cys Asn Ala Cys Val Arg Pro Asp Ser Lys Glu Ser Lys

1 5 10 15

Pro Ser Ser Lys Pro Lys Lys Pro Asn Arg Asp Arg Lys Leu Asn Pro

20 25 30

Phe Ala Gly Asp Phe Thr Arg Ser Pro Ala Pro Ile Arg Val Leu Lys

35 40 45

Asp Val Ile Pro Met Ser Asn Gln Thr Gln Ile Ser Asp Lys Tyr Ile

50 55 60

Leu Gly Arg Glu Leu Gly Arg Gly Glu Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Cys

65 70 75 80

Thr Asp Arg Glu Thr His Glu Ala Leu Ala Cys Lys Ser Ile Ser Lys

85 90 95

Arg Lys Leu Arg Thr Ala Val Asp Ile Glu Asp Val Arg Arg Glu Val

100 105 110

Ala Ile Met Ser Thr Leu Pro Glu His Pro Asn Val Val Lys Leu Lys

115 120 125

Ala Ser Tyr Glu Asp Asn Glu Asn Val His Leu Val Met Glu Leu Cys

130 135 140

Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Ala Arg Gly His Tyr Thr

145 150 155 160

Glu Arg Ala Ala Ala Ala Val Ala Arg Thr Ile Ala Glu Val Val Met

165 170 175

Met Cys His Ser Asn Gly Val Met His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn

180 185 190

Phe Leu Phe Ala Asn Lys Lys Glu Asn Ser Pro Leu Lys Ala Ile Asp

195 200 205

Phe Gly Leu Ser Val Phe Phe Lys Pro Gly Asp Lys Phe Thr Glu Ile

210 215 220

Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Lys Arg Asp Tyr

225 230 235 240

Gly Pro Gly Val Asp Val Trp Ser Ala Gly Val IleIle Tyr Ile Leu

245 250 255

Leu Cys Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Thr Glu Gln Gly Val Ala

260 265 270

Leu Ala Ile Leu Arg Gly Val Leu Asp Phe Lys Arg Asp Pro Trp Pro

275 280 285

Gln Ile Ser Glu Ser Ala Lys Ser Leu Val Lys Gln Met Leu Asp Pro

290 295 300

Asp Pro Thr Lys Arg Leu Thr Ala Gln Gln Val Leu Ala His Pro Trp

305 310 315 320

Ile Gln Asn Ala Lys Lys Ala Pro Asn Val Pro Leu Gly Asp Ile Val

325 330 335

Arg Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Met Met Asn Arg Phe Lys Lys Lys

340 345 350

Val Leu Arg Val Ile Ala Glu His Leu Ser Ile Gln Glu Val Glu Val

355 360 365

Ile Lys Asn Met Phe Ser Leu Met Asp Asp Asp Lys Asp Gly Lys Ile

370 375 380

Thr Tyr Pro Glu Leu Lys Ala Gly Leu Gln Lys Val Gly Ser Gln Leu

385 390 395 400

Gly Glu Pro Glu Ile Lys MetT Leu Met Glu Val Ala Asp Val Asp Gly

405 410 415

Asn Gly Phe Leu Asp Tyr Gly Glu Phe Val Ala Val Ile Ile His Leu

420 425 430

Gln Lys Ile Glu Asn Asp Glu Leu Phe Lys Leu Ala Phe MetT Phe Phe

435 440 445

Asp Lys Asp Gly Ser Thr Tyr Ile Glu Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala

450 455 460

Leu Ala Asp Glu Leu Gly Glu Pro Asp Ala Ser Val Leu Ser Asp Ile

465 470 475 480

Met Arg Glu Val Asp Thr Asp Lys Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Asp Glu

485 490 495

Phe Val Thr Met Met Lys Ala Gly Thr Asp Trp Arg Lys Ala Ser Arg

500 505 510

Gln Tyr Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Leu Ser Ile Asn Leu Met Lys

515 520 525

Asp Gly Ser Leu His Leu His Asp Ala Leu Thr Gly Gln Thr Val Pro

530 535 540

Val

545

<160>3

<210>1

<211>4682

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

tacttaatcc accacatgtc ccttgaaaca aaagcactta agctctgtgt ggttgacatt 60

aaatcacaca tttcattttg ttaaaattaa agtctaaaat tttattcatg gtagtacatc 120

catcatcaaa gaccattttc attgaacaaa ataaagtttc aatctctaat cctttgtgaa 180

aattcttact actatatatt aattaggtct tttggaatat agacgcgcaa cacacatttt 240

cttatatatg gattgaatgg tatccaaatc cccaaggtaa tgtaatgtaa aaccaagata 300

aagaaaacga gtatgacatt gacaattgaa cttgtagcga agtcaggata ggacgacttg 360

cggtttctac tttctaagcc aaagaaacat agttttcatt gatttttagt gtttttaaat 420

ttgttgttga cttccattaa tggaatattt cgtactttgc ttcttctttt cgaattttat 480

ttacctatat aactttgctt tattttctac aacacaataa gtattgctca taattgagga 540

agtctataca cacaatattt tcctatcctt tctttttttc tgtcgggaat ttcttcatat 600

cctagcatct agattatgat tgtacacata caaaaacaga aaagaactag acttcaaaat 660

aatgcaaatt agaaacaaaa aattgctcca aaaaaaatat attcaaaact ataaataaaa 720

tattattatg atttttcttc tattttacgt acattgtata tctctagaga agaaaataat 780

ttttaaaaaa tagtttggga tcaacgtcgc acttattgtt ttgtcttaca atctcagagt 840

ctcaccgtat ccaccacgct ggtcaacaac ttcaacaaaa ctctcttcct cgaacttcaa 900

tcttatccct tcatttcatt accattaatt cacaccaacg gctaacattg tcctcctcgc 960

taaactgtta attatacgtt tggccgtaat gttttgaagt ctgcctatat ttcttttcaa 1020

taaatgctct tttaattagg ttttaatttg gtgaaatcca acctttaaat tttctgatgc 1080

tgttaaatct aagagtttga attttctaaa atcattgttg tcggttatca tttgtacatc 1140

ttgatagaac tataatatga tcaatataaa cttataataa taataactga aaatacaaat 1200

gattttgttt gtttgtttat aaaaccactg aaaaatgcaa gagttaatcc actgagttca 1260

accaaaaaat aaagaagtga attctattag tcataagctt ggaccaaaaa atccatctag 1320

aagaaaaaaa aaattgaaaa aaaattacaa gtttctaaga agatggtgca atggttagaa 1380

aaatctctca agttattaaa tgcatcataa actaatactg tatattacta tacacaaaaa 1440

tcaaagactc cctttttttt aattgaatca aacaaaatcc gaaatttcga aaggtccgac 1500

ttttcctcac ctgaacccgc gttttctctc cccctcccaa cccaactctc caattcgccg 1560

gaaaatcacc gccaccgtca cttccggcgt ccatatgaac taaagagata agcttttttc 1620

ttctataatc cttcttcttc ttcttccttg atctcctttc tctgagtttg ctgagtttct 1680

taactcagcc atgggtaact gtaacgcctg tgtaaggcca gactcaaaag aatcaaaacc 1740

atcttcaaag ccgaaaaaac ccaatcgaga tcggaaatta aacccattcg ccggagattt 1800

caccagatcc ccagctccaa tacgtgttct caaagatgta atccctatga gcaatcaaac 1860

tcagatcagc gacaaataca tcttaggtcg tgaattaggt cgaggcgaat tcggaatcac 1920

ttacctctgt actgatcgtg aaacccacga agctttagct tgcaaatcga tttcaaagcg 1980

aaagcttcga acagctgtcg atatcgaaga cgttcgtcgt gaggtagcga ttatgtctac 2040

tttacctgag catccaaacg tagttaagct taaggctagt tatgaggata acgagaacgt 2000

gcatctggtt atggagcttt gtgaaggagg tgagcttttt gatcggattg ttgctagagg 2160

acattacacg gagcgtgctg ctgcagctgt tgcgagaacg attgctgagg ttgtgatgat 2220

gtgtcactct aatggagtta tgcatcgaga tttgaaacct gagaatttct tgtttgctaa 2280

taaaaaggag aattctccac taaaggctat tgattttggc ttgtctgtgt tcttcaaacc 2340

tggtaaagat tcaattttta gtgtttctta actcagtgga tggttctatt tttagactat 2400

cctgccatat cttcatgttt atggaagttt gtgtagatat ctgagattgg gtaaataacg 2460

ttttctttat tgtaggagat aagtttacag agattgtagg aagtccgtat tatatggctc 2520

cagaagtgtt gaagagagat tatggaccag gggttgatgt gtggagtgcc ggagttatta 2580

tctatatctt gctctgtggt gttcctccgt tttgggctgg ttagcttctt cttttaatta 2640

ttttagcagc tgtgtaattg ttcacctatg ttgattagat aaaccgataa gattgtggtt 2700

tctattgaca gagactgaac aaggtgttgc tcttgcgatc ttgcggggag ttcttgattt 2760

taagagagac ccttggcctc agatatcaga gagtgccaag agccttgtga agcagatgtt 2820

ggatcctgat ccgactaagc ggttaactgc tcagcaagtg ttaggtgaag ttcttgtgtt 2880

tctgttttct ttaatggtcg tagttacctt aatccactct attactaatg attttctttt 2940

tctcaccttt cagctcaccc atggatacag aatgcaaaga aagctcccaa tgttccttta 3000

ggagatatag tcagatctag gttgaagcag ttctctatga tgaacagatt caaaaagaaa 3060

gttcttcgtg taagtgtttt ttttttgcct tttacttttc tgctgaagtt tgtagagagt 3120

ctgttgtgtg tgtctatatt tggttttgat cattatcatc cctgttaatg cttccaggta 3180

attgcggagc acttgtctat tcaagaggtt gaagtgataa agaacatgtt ctcactgatg 3240

gatgatgaca aggatggtaa aataacttac ccggaactca aagctgggct tcagaaggtc 3300

ggttcacaac ttggtgaacc agagatcaaa atgttgatgg aagtggtaat ttaagcattg 3360

cccttatctg attaaagacc aattcagtgt tcttctctga taaacatagc tgaaatctgt 3420

atggctttga cgcgcaggcg gatgtcgatg gaaatgggtt tctggattat ggagagtttg 3480

tagctgtgat aattcacttg cagaagatag agaatgatga acttttcaaa ctagctttta 3540

tgtttttcga caaagatgga agtacataca ttgaacttga tgagctacgg gaagctttag 3600

cggatgagtt aggcgagcca gacgccagtg ttctaagcga catcatgcgt gaagttgaca 3660

ctgacaaggt tctttcaaat atccaaaaaa atcctccttt aaggcctaac aataaagctt 3720

gtcaagagaa aagatatatc cctctgcttc tgagtcggat tgttgggctt gtttgctttt 3780

tacaggacgg acgtataaac tatgatgagt ttgtgacgat gatgaaagct ggaactgact 3840

ggagaaaggc atcgagacaa tattcaagag agaggttcaa aagcttaagc attaacttga 3900

tgaaagatgg gtcattgcat ctccatgacg ctctcactgg acaaactgtt cctgtttaaa 3960

tttattcgtt atcaccaaaa acagagcaat gctccgtttt ttccccattt cataaattgg 4020

gaattttccg ggcttgttct ttgagggatg ggaattttac ggaagctatg gttctttaca 4080

tatataaaca ttttacattg tattttgtat gtaatgtttt gttcaaaggt tgtattttta 4140

ttgtctcaaa gcccctaaac caaagagtca aaggaaagat ctttattaca ctgacacctt 4200

atcaaactca gcagaagtct tgtccatgtc cttgtccttg gccacaacat ctttgtaacg 4260

gtaccaatgt gagaccaaca agaaataggc caagtttaga gtcatcatac cagcaaccaa 4320

gaagtagaaa tactccaatc ttcccttgtt taaatcttcc ggaagccaac ttcctcctga 4380

aaatccctct gtggtatcgt gtaccgccga taacaaaaag gtgctgaggt aactcgccaa 4440

tccgattcca caataataca gagaaccagc aaaacttcgc atgttctctg gaaactgttt 4500

gtagtaaaac tccatttgtc caactccagc gagggcgtcc gcgataccca ttagcactag 4560

ctgaggaatc aaccacatac cggacatcga agagattgcg ccttttcttg gggccaaccc 4620

tagcgtcggt tttgtgagag ctacctttct tctgtattgt tctacaattg cagacaccat 4680

ca 4682

Claims

1.序列表中SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质在培育耐旱性提高的植物中的应用,所述植物为拟南芥。

2.序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列或序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列在培育耐旱性提高的植物中的应用,所述植物为拟南芥。