CN103076454B - 一种检测载脂蛋白c3的试剂盒及利用其实现的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，包含试剂R1：缓冲液、表面活性剂、稳定剂、电解质、高分子促进剂、防腐剂，pH为6～9；试剂R2：缓冲液、抗人载脂蛋白C3抗体、稳定剂、电解质、防腐剂，pH为6～9；校准品：缓冲液、载脂蛋白C3抗原、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂。以及利用该试剂盒检测载脂蛋白C3的方法。本发明操作简单、检测速度快、检测范围宽，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及属于医学免疫体外诊断领域，尤其涉及一种检测载脂蛋白C3的试剂盒以及利用该试剂盒实现的检测方法。
背景技术
载脂蛋白C3主要存在于极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及乳糜微粒中。载脂蛋白C3基因全长约3.1kb，位于11号染色体长臂载脂蛋白A I/C III/A IV基因簇内，在肝脏和小肠中均有表达。
载脂蛋白C3有抑制脂蛋白脂肪酶及肝细胞膜载脂蛋白E受体的功能，在调节极低密度脂蛋白及乳糜微粒的分解代谢中起重要作用。在严重的高甘油三酯血症常伴有载脂蛋白C3含量的明显升高。故测定血清载脂蛋白C3含量对探讨高甘油三酯血症的动脉粥样硬化发病机制有重要意义。
目前常用的载脂蛋白C3的检测方法是酶联免疫法。酶联免疫法的基本原理是：基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，通常以48孔或96孔的聚苯乙烯酶标板为载体；未结合的抗体通过洗涤除去。加入待检样本反应一段时间后，样本中的抗原会和固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物。洗涤除去未结合的杂质。加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样品中待测物质的量正相关。加底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
酶联免疫法测定过程较为繁琐，自动化程度不高，需要配备多种专门设备，不能直接在全自动生化分析仪上进行批量检测分析。随着检测自动化进程的加快以及样本检验数量的不断增加，临床上迫切需要一种更为简便、快捷的方法来进行规模化批量操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测载脂蛋白C3的试剂盒及利用其实现的检测方法，其更为简便、快捷，从而消除上述背景技术中缺陷。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其含有试剂R1、试剂R2和载脂蛋白C3校准品，
其中，试剂R1含有：缓冲液10～500mM，表面活性剂0.5～50g/L，稳定剂0.5～10g/L，电解质5～50g/L，高分子促进剂1～100g/L，防腐剂1～10g/L，pH为6～9；
试剂R2含有：缓冲液10～500mM，抗人载脂蛋白C3抗体5～50%（w/v），稳定剂0.5～10g/L，电解质5～50g/L，防腐剂1～10g/L，pH为6～9；
校准品包括缓冲液10～500mM、载脂蛋白C3抗原、稳定剂5～50g/L、防腐剂1～10g/L、抗氧化剂0.01～10g/L。
上述缓冲液10～500mM，也就是浓度为10～500mmol/L。
抗人载脂蛋白C3抗体5～50%（w/v），也就是浓度为50～500g/L。
优选的，本发明提供的试剂盒中，
所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、Hepes缓冲液中的一种或几种；
所述的表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种；
所述的稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清蛋白中的一种或几种；
所述的电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或几种；
所述的高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠中的一种或几种；
所述的防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；
所述的抗人载脂蛋白C3抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人或牛抗人载脂蛋白C3抗体中的一种；
所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚、维生素系列中的一种或几种。
为了保持统一的缓冲体系，作为一种优选的技术方案，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液相同。
作为一种优选的技术方案，所述校准品的缓冲液采用甘氨酸缓冲液。
进一步优选的，本发明提供的试剂盒中，
试剂R1含有：磷酸盐缓冲液10～500mM；Triton X1000.5～50g/L，牛血清蛋白0.5～10g/L，氯化钠5～50g/L，乙二醇聚氧乙烯醚1～100g/L，叠氮钠1～10g/L，且pH为6～9；
试剂R2含有：磷酸盐缓冲液10～500mM，羊抗人载脂蛋白C3抗体5～50%（w/v），牛血清蛋白0.5～10g/L，氯化钠5～50g/L，叠氮钠1～10g/L，且pH为6～9；
校准品包括甘氨酸缓冲液10～500mM、载脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5～50g/L、叠氮钠1～10g/L、二丁基羟基甲苯0.01～10g/L。
上述羊抗人载脂蛋白C3抗体5～50%（w/v），也就是羊抗人载脂蛋白C3抗体的浓度为150～300g/L。
一种利用上述试剂盒进行检测载脂蛋白C3的方法，该方法包括如下步骤：
（1）向待测样品中加入试剂R1，解除样本中抗原周围电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，待测样品与试剂R1按体积比为（1～10）：250，读取吸光度OD1；
（2）向步骤（1）的混合液中加入试剂R2，试剂R2与试剂R1按体积比为1：（1～7）加入，读取吸光度OD2；
（3）使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置曲线拟合模式拟合标准曲线，根据吸光度自动计算出待测样品中载脂蛋白C3的浓度。
作为一种改进，试剂R2与试剂R1体积比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6或1：7。
作为一种改进，所述曲线拟合模式包括Spline、二次方程、logit-log（3p）、logit-log（4p）、logit-log（5p）或Polygonal中的一种。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供的检测载脂蛋白C3的试剂盒及其检测方法可简洁快速地检测样本中脂蛋白C3的含量，使用简便快速；与进口对比试剂实验表明，本发明试剂具有较高的准确度和很好的特异性，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高；同时抗体原料实现自制，降低了试剂成本，易于产业化；试剂盒由于使用了筛选的最优化试剂组合，使得试剂的稳定性大大提高，2-8°C可以稳定存放一年以上。因此在临床应用上具有广阔的前景。
附图说明
图1为本发明检测载脂蛋白C3含量的检测方法流程示意图；
图2为本发明载脂蛋白C3校准品的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
试剂R1：
试剂R2：
按照需要的校准品浓度将相应量的载脂蛋白C3抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到载脂蛋白C3校准品。
本实施例配制5个不同浓度的参考校准品，分别为：0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，放置2～8℃保存。
使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法如图1所示。使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置logit-log（4p）曲线拟合模式拟合标准曲线，标准曲线如图2所示；向待测样品中加入试剂R1，样本与试剂R1体积分别为6μL、210μL，37℃保温5分钟，读取吸光度OD1；再向得到混合液中进一步加入试剂R2，试剂R2体积为70μL，37℃保温5分钟，读取吸光度OD2；根据吸光度自动计算出载脂蛋白C3的浓度。
实施例2
试剂R1：
试剂R2：
校准品：
本实施例选用高浓度单点校准品，载脂蛋白C3抗原浓度为180mg/L，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，放置2～8℃保存。在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，分别为：0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。
使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法同实施例1。
实施例3
试剂R1：
试剂R2：
校准品：
按照需要的校准品浓度将相应量的载脂蛋白C3抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到载脂蛋白C3校准品。
本实施例配制5个不同浓度的参考校准品，分别为：0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，放置2～8℃保存。
使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法同实施例1。
实施例4
试剂R1：
试剂R2：
校准品：
本实施例选用高浓度单点校准品，载脂蛋白C3抗原浓度为180mg/L，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，放置2～8℃保存。在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，分别为：0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。
使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法同实施例1。
实施例5
本发明试剂与载脂蛋白C3对比试剂（免疫比浊法，购自RANDOX公司）对照测定100例临床标本血清，测定结果如表1所示。本发明试剂盒测定方法同实施例1，载脂蛋白C3对比试剂按照说明书设定相关参数，使用日立7080全自动生化分析仪对样本进行分析。
表1本发明试剂与对照试剂检测值比较
线性回归得到的回归方程为Y=0.98184X+0.69589，相关系数R2=0.9952。数据表明，本发明试剂与对比试剂相关性很好，说明本发明试剂对检测载脂蛋白C3具有很好的特异性和准确度。
本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于：含有试剂R1、试剂R2和载脂蛋白C3校准品，其中，
试剂R1含有：磷酸盐缓冲液10～500mM；Triton X 1000.5～50g/L，牛血清蛋白0.5～10g/L，氯化钠5～50g/L，乙二醇聚氧乙烯醚1～100g/L，叠氮钠1～10g/L，且pH为6～9；
试剂R2含有：磷酸盐缓冲液10～500mM，羊抗人载脂蛋白C3抗体50～500g/L，牛血清蛋白0.5～10g/L，氯化钠5～50g/L，叠氮钠1～10g/L，且pH为6～9；
校准品包括甘氨酸缓冲液10～500mM、载脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5～50g/L、叠氮钠1～10g/L、二丁基羟基甲苯0.01～10g/L。
2.一种利用如权利要求1所述的检测载脂蛋白C3的试剂盒进行检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)向待测样品中加入试剂R1，解除样本中抗原周围电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，待测样品与试剂R1按体积比为(1～10)：250，读取吸光度OD1；
(2)向步骤(1)的混合液中加入试剂R2，试剂R2与试剂R1按体积比为1：(1～7)加入，读取吸光度OD2；
(3)使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置曲线拟合模式拟合标准曲线，根据吸光度自动计算出待测样品中载脂蛋白C3的浓度。
3.如权利要求2所述的一种检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于：所述试剂R2与试剂R1体积比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6或1：7。
4.如权利要求3所述的一种检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于：所述曲线拟合模式包括Spline、二次方程、logit-log(3p)、logit-log(4p)、logit-log(5p)或Polygonal中的一种。
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| GR01 | Patent grant |