CN106810606A - 一种载脂蛋白c-ⅲ抗原多肽及其多克隆抗体的制备与应用 - Google Patents

一种载脂蛋白c-ⅲ抗原多肽及其多克隆抗体的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载脂蛋白C-III抗原多肽，抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的制备与应用，属于生物技术领域。本发明所述抗载脂蛋白C-III多克隆抗体是以氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽为免疫原，与卵白蛋白OVA偶联后免疫新西兰兔制备抗血清，并用NHS激活的琼脂糖树脂与本发明的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联制备抗体亲和纯化填料，进行抗体亲和纯化，对纯化后的抗体进行ELISA、Western blot鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别人血浆中的载脂蛋白C-III，可用于高甘油三酯血症患者血浆中载脂蛋白C-III的检测，为高甘油三酯血症诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。

Description

一种载脂蛋白C-Ⅲ抗原多肽及其多克隆抗体的制备与应用
技术领域
本发明涉及一种载脂蛋白C-III抗原多肽，抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的制备与应用，属于生物技术领域。
背景技术
载脂蛋白C-III是由79个氨基酸组成的小分子糖蛋白，是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类，主要在肝脏中合成，仅小部分在小肠合成，载脂蛋白C-III主要分布于乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。载脂蛋白C-III基因位于11号染色体长臂q23区，在载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-IV之间，三者共同组成一个基因家族。载脂蛋白C-III的转录受胰岛素及过氧化物酶体增殖物激活受体等多种因素调控。
载脂蛋白C-III具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，可抑制肝脏摄取富含甘油三酯的脂蛋白及脂类分解，是血浆甘油三酯水平的主要调节因子。载脂蛋白C-III在血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白之间相互转移，在血脂正常个体的血清中，载脂蛋白C-III大部分与高密度脂蛋白结合，而在高甘油三酯血症患者血清中，则大部分与极低密度脂蛋白结合。高甘油三酯血症是我国最常见的脂质代谢异常疾病，是引起冠心病的独立危险因素之一。随着我国肥胖人群的增加，高甘油三酯血症患者的数量也在逐年增加，其发病主要是由于富含甘油三酯的脂蛋白代谢障碍引起，患者血浆中载脂蛋白C-III含量显著高于正常人群，载脂蛋白C-III已成为高甘油三酯血症发生发展的有效标志物，制备载脂蛋白C-III多克隆抗体可用于开发高甘油三酯血症患病风险的诊断试剂，对探讨高甘油三酯血症的发病机制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高甘油三酯血症标志物载脂蛋白C-III抗原多肽。
本发明的另一目的是提供一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体。
本发明的又一目的是提供上述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：一种载脂蛋白C-III抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，是以本发明的载脂蛋白C-III抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。
上述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：载脂蛋白C-III抗原多肽与载体蛋白卵白蛋白OVA偶联，作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行五次免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1∶16000后，采集兔血清，进行亲和纯化，经过ELISA和Western blot鉴定后，得到抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体。
化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白偶联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽偶联的载体蛋白有多种，其中较为常用的血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、卵白蛋白(ovalubumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。由于OVA与本发明的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联后免疫原性最强，因此本发明选用OVA作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA常用于检测试验的阻断剂而使该方法生产的抗体在应用上存在一定的局限性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益结果：
本发明对载脂蛋白C-III氨基酸序列的理化性质、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的多肽序列进行人工合成；将合成的多肽与卵白蛋白OVA偶联后免疫新西兰兔；经过五次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达到理想值后收集免疫兔血清，并用NHS激活的琼脂糖树脂与本发明的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联制备抗体亲和纯化填料，将填料装柱后进行抗体的亲和纯化，对纯化后的抗体进行ELISA、Western blot鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别载脂蛋白C-III，具有特异性好、纯度高的特点，可用于检测人血浆中表达的载脂蛋白C-III，为高甘油三酯血症患者诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
附图说明
图1.经DNAstar软件分析载脂蛋白C-III免疫原性、亲疏水性及表面可及性，方框中显示的是选用合成的多肽序列片段。
图2.抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体经抗原亲和纯化柱纯化后的SDS-PAGE电泳(12％)检测结果。泳道1：Marker；泳道2：上样；泳道3：流穿；泳道4：平衡；泳道5：洗脱上峰；泳道6：洗脱下峰。
图3.抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的Western blot鉴定结果。泳道1：人血浆；泳道2：HepG2细胞。
图4.本发明的实验流程。
具体实施方式
下面应结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：载脂蛋白C-III抗原多肽设计
1.根据载脂蛋白C-IIIGenBank登录号GI：4557323，获得人载脂蛋白C-III的蛋白序列(UniProt：P02656)，含有79个氨基酸。
2.用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)在线分析载脂蛋白C-III的蛋白基本理化性质。分析结果见表1，载脂蛋白C-III分子量为8.7646KD，等电点为4.72，为酸性蛋白。
表1载脂蛋白C-III基本理化性质分析结果
3.用DNAstar软件分析载脂蛋白C-III免疫原性、亲疏水性及表面可及性，分析结果如图1，载脂蛋白C-III近C端有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。
4.载脂蛋白C-III抗原多肽筛选
将筛选出的16个氨基酸序列经Blastp分析，最终筛选多肽序列为：KFSEFWDLDPEVRPTS(60aa-75aa，SEQ ID NO：1)。
实施例2：载脂蛋白C-III抗原多肽合成及与载体蛋白偶联
1.多肽由上海吉尔生化公司合成，纯度为93.85％。
2.多肽与载体蛋白偶联
将5mg多肽用50μl DMSO溶解，待溶解完全后，加入偶联缓冲液稀释至终体积为1ml，取出200μl用于ELISA检测，在剩余800μl多肽溶液中加入400μl浓度为10mg/ml的OVA溶液混匀后，再加入200μl浓度为10mg/ml的EDC，立即混匀含有EDC、OVA的多肽溶液，室温反应2h。
3.偶联产物的超滤与分装
将偶联产物用PBS稀释至4ml，用10KD Milipore超滤离心管对偶联产物进行超滤，每次超滤后将下管中滤液弃去，待上管中剩余液体约1ml时，继续用PBS稀释后进行超滤离心，循环超滤4次后，取上管中剩余液体1ml加入PBS稀释至3ml混匀，采用NanoDrop分光光度计测定偶联后蛋白浓度为1.272mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌后，每管分装偶联后蛋白 500μl，-80℃保存。
实施例3：抗载脂蛋白C-III多克隆抗体制备及纯化
1.动物免疫
免疫前于兔耳静脉取血，静置后离心取血清-80℃保存，作阴性对照血清。取分装后的偶联蛋白与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混匀后，用注射乳化器乳化，乳化结束后免疫新西兰兔(体重2～2.5kg)，具体免疫程序见表2。
表2抗原免疫程序表
2.ELISA检测抗体效价
分别在免疫第29、43、57天进行抗体效价ELISA检测。将多肽抗原用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)稀释终浓度为5μg/ml，以每孔100μl加入到96孔板中，4℃包被过夜后，洗液(磷酸盐缓冲液PBST：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 3.58g，KH2PO4 0.27g，NaOH 0.085g，吐温500μl)洗涤3次，拍干后，每孔加入200μl封闭液(胎牛血清与PBST以1∶1000混合)，37℃封闭2h后，洗涤3次，拍干。兔耳静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释后，每孔100μl加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前兔血清作为阴性对照，不加血清作为空白对照，37℃孵育90min，洗涤3次，拍干。加入1∶5000稀释的二抗，每孔100μl，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。每孔加入50μl显色剂A，50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光孵育10min后，每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)。以空白孔调零，在450nm波长处测量各孔的吸光度，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。结果如表3，经过第五次免疫后，抗血清效价达到1∶16000，可采集血清进行多克隆抗体的纯化。
表3抗体效价ELISA检测结果
3.抗原亲和纯化柱的制备
将筛板置于柱子底部压实。取NHS-Activated Sepharose4 Fast Flow填料(购自GE公司)平衡至室温后摇晃均匀，取1ml加入柱子中。用PBS平衡柱子，以去除储存液。向柱中加入20mg偶联的蛋白抗原。混匀后，置于室温摇床孵育3h或4℃过夜。用PBS平衡柱子，加入封闭液(0.5M Tris-HCl，pH 6.8)，置于室温摇床孵育30min，以封闭未结合位点。用PBS平衡柱子，抗体洗液清洗柱子，再次用PBS平衡柱子后加入PBS和0.05％NaN3，将抗原亲和纯化柱子编号并保存于4℃备用。
4.抗体的亲和纯化
采用颈动脉放血法，收集兔全血在37℃孵育2h，离心取上清，无菌条件下分装血清每管1.5ml。将抗原亲和纯化柱置于室温，用PBS平衡10个柱体积，以去除储存液。取2管多抗血清稀释1倍，用0.22μm滤器过滤后进行缓慢上样，置于室温摇床孵育3h。上样后用PBS平衡10个柱体积，以洗去未结合的抗体。用抗体洗液(NaCl 8.6g/L，Glycine 7.5g/L，pH 3.0)洗脱，收集洗脱峰，并及时加入中和液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和洗脱的抗体至pH为7.0左右，保证洗脱的抗体处于中性环境中以免影响抗体活性。将各管洗脱抗体混合，用10KD Milipore超滤离心管4℃超滤至终体积为0.5μl，取小样12％SDS-PAGE电泳分析纯化效果，用NanoDrop分光光度计测定亲和纯化后的抗体浓度，加入抗体保存液(0.02％NaN3，50％Glycerol，1mg/ml BSA)于-20℃保存。结果：抗体纯化后经SDS-PAGE电泳鉴定(图2)，NanoDrop分光光度计测定亲和纯化后的抗体浓度为4.0mg/ml。
实施例4：抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的鉴定
1.抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体的ELISA鉴定
以合成的载脂蛋白C-III为检测抗原，包被酶标板，以1∶2000稀释的未免疫兔血清作为阴性对照，将兔血清及纯化后的抗体倍比稀释后，应用ELISA方法检测抗体效价，具体方法同实施例3.2。结果显示纯化后的抗载脂蛋白C-III抗体效价为1∶16000(表4)。
表4抗载脂蛋白C-III抗体效价ELISA检测结果
2.抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的Western-blot鉴定
分别取人血浆及HepG2细胞，将其裂解后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测出提取样本的蛋白浓度，以20μg上样进行SDS-PAGE电泳后，200mA恒流1h转至PVDF膜，转印结束，用TBST缓冲液配制5％(M/V)脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温封闭60min。将封闭好的PVDF膜放入杂交袋中，加入5％(M/V)脱脂奶粉稀释的实施例3中纯化得到的抗载脂蛋白 C-III多克隆抗体(一抗1∶1000)，用压膜机封口，4℃孵育过夜。PVDF膜取出，放入TBST中，在摇床上洗涤4次，每次10分钟。HRP标记的羊抗兔二抗用5％的脱脂牛奶按1∶5000稀释，制成二抗工作液，将二抗与PVDF膜在37℃一起孵育45min，取出PVDF膜放入TBST缓冲液中洗涤4次，每次10分钟。ECL显色以检测载脂蛋白C-III的表达情况。结果如图3，本发明中的抗载脂蛋白C-III多克隆抗体可在人血浆和HcpG2细胞裂解液中检测到分子量11KD左右的单一条带，与人载脂蛋白C-III预期相对分子量相符。

Claims (6)

1.一种载脂蛋白C-III抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，其特征在于以权利要求1所述载脂蛋白C-III抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。
3.根据权利要求2所述的抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，其特征在于抗体效价为1∶16000。
4.权利要求2所述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体制备方法，其特征在于步骤如下：权利要求1所述载脂蛋白C-III抗原多肽与卵白蛋白OVA偶联后，作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，进行五次免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1∶16000后，采集兔血清，进行亲和纯化后，经ELISA和Western blot鉴定，得到抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于以权利要求1所述载脂蛋白C-III抗原多肽制备抗原亲和纯化柱，进行多克隆抗体的亲和纯化。
6.权利要求2所述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体在高甘油三酯血症诊断中的应用。
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