CN101813700A - 一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒 - Google Patents
一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种测定血清中的β2-微球蛋白的试剂盒。所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足,提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好,适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒。技术方案是:一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,包括;a、试剂R1:缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂,其余为纯化水;b、试剂R2:缓冲液、结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、防腐剂,纳米微球直径为50-150nm;c、参考校准品:缓冲液,稳定剂,防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品,其余为纯化水。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂盒,特别是测定血清中的β2-微球蛋白(β2-MG)的试剂盒,可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
β2-微球蛋白(β2-MG)是一种低分子量(11800)的蛋白质,最先在肾小管性肾炎的病人尿中分离;β2-MG存在于几乎所有有核细胞表面,是人类白细胞抗原(HLA)分子轻链的组成部分。作为HLA代谢和分解的产物,β2-MG以低浓度的游离形式出现在血清、尿液和其他体液中。游离β2-MG通过肾小球滤过肾小管重吸收排出和降解。因为β2-MG每天在体内生成率较为恒定,且只被肾脏***,测定血β2-MG可作为肾小球滤过率的指标。
已知测定β2-微球蛋白(β2-MG)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法(ELISA法)。这些方法存在着操作繁琐,需要特殊的设备,样本需要预处理,不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足,提供一种β2-微球蛋白检测试剂的改进,所提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好,适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒。
本发明提供的技术方案是:
一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及参考校准品;其中:
a、试剂R1:一种使样本中β2-微球蛋白抗原位点充分暴露,有利于与抗β2-微球蛋白抗体试剂充分结合的β2-微球蛋白溶液,包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂,其余为纯化水;
b、试剂R2:一种结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液,包括5-200mmol/L缓冲液、0.1%-5%重量比的结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂,纳米微球直径为50-150nm;
c、参考校准品:一种用来与样本比较,进行结果计算的β2-微球蛋白溶液,包括缓冲液100-200mmol/L,稳定剂166-180mmol/,适量防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品,其余为纯化水。将重组人β2-微球蛋白纯品加入上述溶液中,获得所需浓度的β2-MG参考校准品(该β2-微球蛋白参考校准品为添加重组人β2-微球蛋白纯品的人血清或其它类似血清基质的液体)。
β2-MG参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品,在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品;也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。这里没有特别的限制,只要制得的β2-MG参考校准品能够与样本比较,能够测定样本中β2-MG的含量即可。
所述β2-微球蛋白试剂R1中还加入反应加速剂,浓度为3-10mmol/L。
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。
所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。
所述防腐剂是广谱杀菌剂。
所述结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是:用缓冲液在室温下稀释重量比例为1∶1的抗人β2-MG抗体多克隆抗体和纳米微球,将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即常规的物理吸附法),加入含0.1%BSA的缓冲液封闭1小时,离心去上清,再用缓冲液稀释至浓度为0.3%,并加入适量防腐剂。
抗人β2-MG抗体多克隆抗体包括羊抗抗人β2-MG抗体多克隆抗体或兔抗抗人β2-MG抗体多克隆抗体或鼠抗抗人β2-MG抗体多克隆抗体。
本发明所需主要原料
1、羊抗人β2-微球蛋白多克隆抗体;可外购或委托浙江伊利康生物技术研发中心按常规方法制备,该抗体仅与人β2-微球蛋白反应,与其它抗原无免疫交叉反应,效价能够满足本试剂要求。
2、纳米微球;市场上有许多商品化的纳米微球可供选择,包括美国Sigma公司、德国默克公司、日本UNF公司;可选择多种直径的纳米微球,本发明采用了直径为80~120nm的微球,相应的试剂检测主波长为600nm。
3、重组β2-微球蛋白纯品;可外购,或由浙江伊利康生物技术研发中心制备,用于制备本试剂所需参考校准品。
其余生化原料均可外购。
本发明测定样本的原理是利用抗原抗体反应,先加入试剂R1(样本稀释液),解除样本中抗原周围的电子层和水化层,使抗原位点充分暴露;然后加入试剂R2(抗人β2-MG抗体的纳米微球溶液),使β2-MG抗体的纳米微球与样本中相应的β2-MG抗原反应,形成不溶性的抗原-抗体复合物,产生一定的浊度,其浊度高低与样本中的β2-MG含量成正比;在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值,与已知浓度的β2-MG参考校准品进行比较,则可计算出样本中β2--MG的含量。
试剂R2中纳米微球与抗人β2-微球蛋白抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备,优选物理吸附法。
本发明提供的试剂为液体双试剂,具有特异性好,灵敏度高,准确性好及抗干扰能力强等优点,而且测定时操作简单、样本不用预稀释,可用于检测体液中β2-微球蛋白的浓度,适用于临床全自动生化分析仪。
附图说明
图1为采用本发明实施例1进行测定所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值的相互关系示意图。
图2为采用本发明实施例2进行测定所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值的相互关系示意图。
图3为采用本发明实施例3进行测定所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值的相互关系示意图。
具体实施方式
β2-MG检测试剂的制备实施例:
实施例一
1、β2-MG溶液(试剂R1)
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 50mmol/L
吐温-20(表面活性剂) 0.5mmol/L
NaCL(电解质) 100mmol/L
PEG-6000(反应加速剂) 4mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 3mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 5mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β2-MG抗体溶液(试剂R2)
用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4)在室温下稀释羊抗人β2-MG抗体多克隆抗体和80nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1),将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法),加入封闭液(含0.1%BSA三羟甲基氨基四烷缓冲液)封闭1小时,离心去上清,用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%,并加入适量的防腐剂;即获得β2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。
3、血清型β2-MG溶液(参考校准品)
CAPSO (缓冲液) 100mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 2mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂) 3mmol/L
氯化钠(稳定剂) 166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β2-MG参考校准品浓度将相应量的重组β2-MG纯品40mg/L加入上述溶液中,制备得40mg/L浓度的β2-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定,所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值进行比较(参见图1,并进行回归分析);获知相关性r=0.9995(y=1.007x+0.0236);显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
实施例二
1、β2-MG溶液(试剂R1)
三羟甲基氨基甲烷(缓冲液) 150mmol/L
吐温-20(表面活性剂) 4mmol/L
NaCL(电解质) 60mmol/L
PEG-6000(反应促进剂) 8mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 0.1mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.5mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β2-MG抗体溶液(试剂R2)
用150mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β2-MG抗体多克隆抗体和100nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1),将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法),加入含0.1%BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时,离心去上清,用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为4%,并加入适量的防腐剂;即获得β2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。
3、血清型β2-MG溶液(参考校准品)
CAPSO(缓冲液) 150mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 3mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂) 3mmol/L
氯化钠(稳定剂) 166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β2-MG参考校准品浓度将相应量的重组β2-MG纯品60mg/L加入上述溶液中,制备得60mg/L浓度的β2-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定,所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值进行比较(参见图2,并进行回归分析);获知相关性r=0.9985(y=1.0264x+0.0149);显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
实施例三
1、β2-MG溶液(试剂R1)
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 200mmol/L
吐温-20(表面活性剂) 2mmol/L
NaCL(电解质) 200mmol/L
PEG-6000(反应促进剂) 5mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 3mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 2mmol/L
其余为纯化水
2、抗人β2-MG抗体溶液(试剂R2)
用200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β2-MG抗体多克隆抗体和120nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1),将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法),加入含0.1%BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时,离心去上清,用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为2%,并加入适量的防腐剂;即获得β2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。
3、血清型β2-MG溶液(参考校准品)
CAPSO(缓冲液) 200mmol/L
广谱杀菌剂(防腐剂) 2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂) 0.5mmol/L
牛血清白蛋白(稳定剂) 5mmol/L
氯化钠(稳定剂) 166mmol/L
其余为纯化水
按照所需要的β2-MG参考校准品浓度将相应量的重组β2-MG纯品80mg/L加入上述缓冲液中,制备得80mg/L浓度的β2-MG参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定,所得β2-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的β2-MG测得值进行比较(参见图3,并进行回归分析);获知相关性r=0.9992(y=1.0062x+0.0285);显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。
本发明的测定条件及步骤:
结果的计算:
式中:
ΔAT待测样品平均每分钟吸光度变化值
ΔAS校准液平均每分钟吸光度变化值
CS校准液中β2-MG的浓度
尚需补充的是:本文中凡未特别标明的比例均为重量比。
Claims (5)
1.一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及参考校准品;其中:
a、试剂R1:一种使样本中β2-微球蛋白抗原位点充分暴露,有利于与抗β2-微球蛋白抗体试剂充分结合的β2-微球蛋白溶液,包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂,其余为纯化水;
b、试剂R2:一种结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液,包括5-200mmol/L缓冲液、0.1%-5%重量比的结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂,纳米微球直径为50-150nm;
c、参考校准品:一种用来与样本比较,进行结果计算的β2-微球蛋白溶液,包括缓冲液100-200mmol/L,稳定剂166-180mmol/,适量防腐剂2mmol/L以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品,其余为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,其特征在于所述β2-微球蛋白试剂R1中还加入反应加速剂,浓度为3-10mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。
4.根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,其特征在于所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。
5.权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒,其特征在于所述结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是:用缓冲液在室温下稀释重量比例为1∶1的抗人β2-MG抗体多克隆抗体和纳米微球,将两者混匀后室温振荡吸附2小时,加入含0.1%BSA的缓冲液封闭1小时,离心去上清,再用缓冲液稀释至浓度为0.3%,并加入适量防腐剂。
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