CN103060206B

CN103060206B - 一种发酵菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103060206B
Application number: CN201310009803.9A
Authority: CN
Inventors: 阮晖; 杨璐; 伍星主; 何李琳; 李青青; 徐娟; 陈功; 诸文颖; 杜姗姗; 刘松柏; 何国庆
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: CN103060206A

Abstract

本发明公开了一种发酵菌剂及其制备方法和应用。所述发酵菌剂的制备方法包括：(1)将未灭菌的白菜帮、桔皮、麦麸以重量比0.8～1.2∶1.5～1.9∶0.3～0.5混合，加水濡湿，获得培养基质；(2)在所述培养基质中接入黑曲霉(Aspergillus niger)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、麦曲，搅拌均匀；(3)静置培养，获得所述发酵菌剂。本发明还提供了一种利用所述制备方法获得的发酵菌剂及其在生产纤维素复合酶系中的应用。与现有技术相比，本发明利用未灭菌载体上的天然菌群对产酶微生物进行驯化，获得的发酵菌剂不仅微生态稳定，而且能够对纤维基质进行糖化发酵生产纤维素复合酶系。

Description

一种发酵菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纤维基质利用领域，尤其涉及一种发酵菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

饲料是发展畜牧业的物质基础，而大量的多纤维粗饲料又是世界上一笔取之不尽、用之不竭的饲料资源。

纤维质粗饲料资源包括农作物的秸秆、皮、壳、芯、废弃木材、锯末等，据统计，全世界每年的农作物秸秆产量约40多亿吨，我国每年约有7～8亿吨。这些资源粗纤维含量高，蛋白质少，粗灰分多，适口性差，不适于直接作饲料，长期以来大都被烧掉或者部分还田，而作为饲料利用的尚不到五分之一，资源利用率低而污染严重。

大白菜是我国一种广泛种植的蔬菜，其栽培面积和消费量在我国居各类蔬菜之首，在南北方都随处可见。但每年在白菜种植收成后都会产生大量的蔬菜垃圾，约占其产量的30％，不仅浪费资源，还易污染环境。若集中清理，成本也较高。白菜帮中纤维含量较为丰富，约占干重的30％以上，可作为一种良好的纤维质饲料来源。因此，如何环境友好而又有效地利用废弃的白菜帮具有重大的实际意义。

多年来，许多国家致力于研究多种方法对纤维质粗饲料进行加工处理，包括化学、物理、生物学方法在内，使其转化成适口性良好、营养价值高的饲料。其中，最有前景的是微生物发酵法，该方法既不需要太复杂的设备和过多的能量消耗，又不需高温、高压、强酸、强碱等较为极端的条件。

其中，微贮法是利用生物原理将农作物秸秆粉碎后加入微生物菌种进行生物发酵处理，利用各种真菌、细菌分泌的酶类降解纤维素和木质素，提高物料的消化率和营养价值，将纤维质粗饲料转化为富有多种营养成分的饲料的一种方法。

目前国内普遍使用的发酵菌剂有两种：纯化的单一菌剂和简单混合菌剂。纯化的单一菌剂是在自然环境中筛选优良的产酶单菌株，再通过一定的诱变手段，获得工业化大规模生产的产酶菌株，再吸附到特定载体上制成的菌剂。但自然环境中对纤维素、木质素等成分的降解是多种微生物协同完成的，微生物之间相互协调、相互制约，使产生的水解酶之间的比例处于一种最适降解状态。而纯化的单一菌剂中的菌种由于失去了自然条件下长期处于协同关系的其他菌的共存，其产酶能力大大降低，所产纤维素复合酶系往往不全，对发酵条件要求较高，且易受污染。

简单混合菌剂是将两种或两种以上的产酶菌种按一定的比例混合，吸附于适宜的载体上制成。人为地简单混合，各种菌之间是否具有协同关系，是否产生拮抗作用还有待证实。

发明内容

本发明提供了一种发酵菌剂的制备方法，该方法操作简便，获得的发酵菌剂微生态稳定。

一种发酵菌剂的制备方法，包括：

(1)将自然选取的白菜帮、桔皮、麦麸按比例混合，加水濡湿，获得培养基质；

(2)在所述培养基质中接入黑曲霉(Aspergillus niger)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、麦曲，搅拌均匀；

(3)静置培养，获得所述发酵菌剂。

本发明以自然选取的白菜帮、桔皮、麦麸作为载体，维持生长在所述载体上天然菌群中各菌种的互利共生关系；并在天然菌群的基础上，强化接种产酶微生物，通过驯化形成微生态稳定的发酵菌剂。

白菜帮和桔皮中含水量较大，不利于产酶微生物生长。因此，所述白菜帮、桔皮经粉碎至1～2mm，60℃下烘烤2.5～3.5h后再混合。

白菜帮、桔皮、麦麸优选以重量比0.8～1.2∶1.5～1.9∶0.3～0.5混合，再按0.4～0.6mL/g的比例加水濡湿后，接入产酶微生物。

本发明所述黑曲霉(Aspergillus niger)可选用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1；所述康氏木霉(Trichoderma koningii)可选用康氏木霉(Trichoderma koningii)ZJU-RDY2；均为浙江大学食品科学与发酵工程研究所保藏。也可使用其他可发酵生产纤维素复合酶系中的一种或多种酶的黑曲霉(Aspergillus niger)或康氏木霉(Trichoderma koningii)。

所述黑曲霉(Aspergillus niger)和康氏木霉(Trichoderma koningii)经活化后配制成1×10⁸～10⁹spores/mL的孢子悬液再接入培养基质中；接种量为0.8～1.2mL/100g培养基质。

优选地，所述麦曲为生麦曲，由安吉乌毡帽酒厂提供。与熟麦曲相比，生麦曲中微生物种类较为丰富，能够分泌更多更丰富的酶类。

所述生麦曲与培养基质的重量比优选为0.8～1.2∶10。

产酶微生物接种完毕、搅拌均匀后，将培养基质平铺散开，基质厚度控制在2～3cm，以增加透气度，加快天然菌群和产酶微生物的生长。

静置培养时，培养温度为28～31℃，培养环境湿度控制在86～94％，培养时间为3～4天。

本发明还提供了一种发酵菌剂，该菌剂即是利用所述的制备方法制备而成。所述发酵菌剂微生态稳定、能对纤维基质进行糖化发酵产生纤维素复合酶系，利用这种微生态群系可以进行较为粗放的发酵，不必担心污染问题，实现对纤维基质的低成本高性价比生物转化。

本发明中所述的纤维素复合酶系包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶以及木聚糖酶。

本发明还提供了所述发酵菌剂在生产纤维素复合酶系中的应用，包括：

将所述发酵菌剂加入到纤维基质中，搅拌均匀，静置发酵，获得所述纤维素复合酶系。

将该纤维素复合酶系与适宜的载体混合，还可制成纤维素酶制剂，用作饲料添加剂，提高饲料利用率，改善饲料品质。

所述的纤维基质也优选为粉碎至1～2mm之后再使用，若含水量较大，还应在60℃下烘烤2.5～3.5h后使用。所述发酵菌剂的添加量优选为8～12％。

所述静置发酵的条件优选为：发酵温度为28～31℃，发酵环境湿度控制在86～94％，发酵时间为3～6天。发酵基质的厚度控制在2～3cm，以增加透气率，促进微生物生长。

发酵完成后，将发酵物与适量的缓冲液混合，进行酶液的提取。

所述缓冲液优选为0.5M的柠檬酸酸钠溶液(pH 4.8)，与发酵物以6～8∶1(v/w)的比例混合，30℃水浴55～65min后离心，上清液即为所需酶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用未灭菌载体上的天然菌群对产酶微生物进行驯化，获得的发酵菌剂不仅微生态稳定，而且能够对纤维基质进行糖化发酵生产纤维素复合酶系，可实现对纤维基质低成本高性价比的转化；

(2)本发明的发酵菌剂为固体菌剂，便于运输和使用；且干燥、冷冻等处理不会降低发酵菌剂中活菌的数量和活性，保质期长。

附图说明

图1为本发明发酵菌剂稳定性测试结果图。

具体实施方式

1底物制备

将白菜帮废弃物、桔皮粉碎至1-2mm，60℃条件下烘干3h，备用。麦麸由安吉乌毡帽酒厂提供。

2发酵菌剂制备

黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1和康氏木霉(Trichodermakoningii)ZJU-RDY2为浙江大学食品科学与发酵工程研究所保藏。生麦曲由安吉乌毡帽酒厂提供。

将黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1和康氏木霉(Trichodermakoningii)ZJU-RDY2分别接种到PDA培养基斜面，28℃条件下培养3-4d进行活化。

PDA培养基配方为：马铃薯200g切碎煮沸30min，八层纱布过滤取滤液；葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，pH自然。

获取活化后的黑曲霉、康氏木霉的孢子，用蒸馏水制成浓度为1×10⁸spores/mL的孢子悬液，备用。

将未经过灭菌的白菜帮废弃物、桔皮和麦麸按1∶1.7∶0.4(w/w/w)的比例混合成100g的培养基质，培养基质按0.5mL/g的比例加水濡湿；再分别接种1mL的黑曲霉、康氏木霉孢子悬浮液，和1g的生麦曲充分搅拌混匀，静置培养3d。培养基质控制在2cm左右的厚度，培养温度控制在30±1℃，环境湿度控制在90±4％。最终获得本发明的发酵菌剂。

3固体发酵

下面以白菜帮废弃物作发酵底物为例，举例说明本发明的发酵菌剂在制备纤维素复合酶系中的应用。

将上述制得的发酵菌剂按10％的添加量加入到1kg经粉碎至1～2mm且烘干的白菜帮废弃物中，置于铁盘中进行静置发酵，发酵基质厚度控制在2cm左右，发酵温度控制在30±1℃，环境湿度控制在90±4％，发酵5～6天。

4酶液提取和酶活测定

每隔24h测定发酵物中纤维素酶(内切葡聚糖酶)、果胶酶、淀粉酶木聚糖酶的酶活力。每次检测作3次平行测验，并计算最后的平均值。

取发酵物和0.5M的柠檬酸酸钠缓冲液(pH 4.8)按比例(w/v＝1∶7)混合后，放入30℃水浴60min，然后在室温下3000rpm离心取上清液，即得所需酶液。

(1)纤维素酶(内切葡聚糖酶)活性测定

采用DNS法测定。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mL 1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液(1g CMC-Na溶于100mL pH 4.8的0.5mol/L柠檬酸钠缓冲溶液)，50℃保温30min。加入0.75mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入10mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。

(2)果胶酶活性测定方法

采用DNS法测定。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mL 1％的果胶溶液(1g果胶溶于100mL pH 5.0的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲溶液)，50℃保温10min。加入0.75mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入10mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量，再与半乳糖醛酸进行换算。

(3)淀粉酶活性测定方法

采用DNS法测定。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mL 1％的淀粉溶液(1g可溶性淀粉溶于100mL pH 5.0的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲溶液)，50℃保温10min。加入0.75mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入10mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。

针对以上三种酶，一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟释放1μmol葡萄糖所需的酶量。

(4)木聚糖酶活性测定方法

采用DNS法测定，加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mL 1％的木聚糖溶液(1g木聚糖溶于100mLpH 5.0的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲溶液)，50℃保温10min。加入0.75mL DNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入10mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。

针对木聚糖酶，一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟释放1μmoL木糖所需的酶量。

发酵过程中，发酵物中四种酶的酶活力如表1所示。

表1不同发酵时间下发酵物中四种酶的酶活力

由表1可见，利用本发明的发酵菌剂进行发酵获得的白菜帮废弃物发酵物中，纤维素酶(内切葡聚糖酶)、果胶酶、淀粉酶以及木聚糖酶酶活较高，且酶类丰富；发酵第5天时四种酶的酶活力均达到最高。

5发酵菌剂稳定性测定

将在常温下放置8个月后的发酵菌剂按上述的方法进行固态发酵及酶活测定，并与8个月前的测定结果进行比较。测定结果显示，8个月后发酵菌剂产生的纤维素酶(内切葡聚糖酶)、果胶酶、淀粉酶以及木聚糖酶的酶活占8个月前的各酶酶活的比例分别为：68.32％、98.17％、76.90％、68.03％。比较结果如图1所示。

由图1可见，本发明的发酵菌剂微生态稳定，保质期长。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将自然选取的白菜帮、桔皮、麦麸按比例混合，加水濡湿，获得培养基质；

（2）在所述培养基质中接入黑曲霉（Aspergillus niger）、康氏木霉（Trichoderma koningii）、麦曲，搅拌均匀；

（3）静置培养，获得所述发酵菌剂；

所述白菜帮、桔皮经粉碎至1～2mm，60℃下烘烤2.5～3.5h后再混合；

所述白菜帮、桔皮、麦麸以重量比0.8～1.2:1.5～1.9:0.3～0.5混合。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergillusniger）和康氏木霉（Trichoderma koningii）经活化后配制成1×10⁸～10⁹spores/mL的孢子悬液再进行接种；接种量为0.8～1.2mL/100g培养基质。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述麦曲与培养基质的重量比为0.8～1.2:10。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静置培养的温度为28～31℃，培养环境湿度控制在86～94%，培养时间为3～4天。