CN111187727A - 一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌lw-6的菌液制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW‑6的菌液制备及应用，本发明选取的甲基营养型芽孢杆菌菌株来源保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的甲基营养型芽孢杆菌，保藏登记号为：CGMCCNo.6793，本发明菌剂的制备是在特定的发酵培养基和工艺条件下，主要包括:原种筛选‑‑确定出发菌株—制备液体种子液‑‑放大发酵—超滤浓缩‑‑制备200亿活孢子菌液/ml,本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌LW‑6对营养要求低，抗逆性强，生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀菌效果明显。本发明具有防治棉花枯黄萎病的功能，用浸种处理和滴灌处理防治黄萎病防效可达81.2%，枯萎病防效可达81.0%。本发明中的甲基营养型芽孢杆菌LW‑6作为棉花枯黄萎病的生物防治菌剂，从源头上断绝环境污染以及化学农药残留，且具有更好的防治效果。因此本发明在新的生物农药研发方面和应用方面都具有广阔的理论和时间意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌液制备及应用，属于微生物技术领域或者生物防治技术领域。
背景技术
棉花枯黄萎病是世界性的重要病害之一，自1935年由引进美国斯字棉种而传入中国，并逐年传播扩散。目前枯黄萎病的危害已成为棉花生产上的第一大病害，该病害属于土壤带菌和传播的根部病害，防治困难，其发生严重影响棉花的产量和质量，是棉花可持续生产的主要障碍之一。目前，国内外有两种主流防治该病的方法，一是主要依靠种植耐病品种，但由于抗性种质资源缺乏导致抗病育种进展缓慢，生产上缺乏真正有效的抗病品种；二是化学防治，但是化学防治措施控制该病的效果甚微，此方法同时带来严重的环境污染和化学农药残留。
对此，本发明一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液是以生物防治的方式来防治棉花枯黄萎病，并且结合滴灌再补充水肥的条件下加入有益微生物甲基营养型芽孢杆菌LW-6进行该病害的防治，本发明相比化学药剂和种植耐病品种的方式，都具有不同的优势，另一方面本发明的生防菌剂对环境无污染，也不会产生抗药性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌液制备及应用。该菌液制备工艺独特，包括原种筛选--确定出发菌株—制备液体种子液--放大发酵—超滤浓缩,该菌液含有的甲基营养型芽孢杆菌LW-6活孢子数高，可达200亿/ml，具有对棉花枯黄萎病更加高效的生物防治功能，用滴灌处理防治黄萎病防效可达81.2％，枯萎病防效可达81.0％。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
采用如下方法制备：一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌液制备及应用:
(1)将甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种接种于琼脂淀粉平板培养基上，35℃下培养72h，显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵出发菌落；
(2)将所述步骤(1)所述的发酵出发菌落接种于液体种子培养基，装液量为：500ml的摇瓶装100ml种子液，培养温度35℃，转速200rpm条件下培养72h，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)得到的发酵种子液，按照9％的接种量接入发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：罐压0.07Mpa，风量1:0.8vvm，转速260rpm，培养温度为35℃，直到发酵罐中发酵液中的活孢子数达200亿/ml以上、芽孢量大于或等于92 ％时即可终止发酵。
(4)将步骤(3)得到的发酵液进行超滤浓缩,去掉40％水分，其特征为：：串联使用孔径分别为0.005um、0.001um和1nm的3个超滤膜组件，将发酵液在35℃、压力0.3MPa条件下依次同时进行连续超滤处理，超滤时间4h,得到一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂,活孢子数≥200亿/ml.
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的甲基营养型芽孢杆菌菌液，其特征在于，所述步骤(1)中的甲基营养型芽孢杆菌LW-6(Bacillus methylotrophilus)，保藏单位为：CGMCC—中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC NO.6793；保存时间：2012年11月07日，且检测结果为存活。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述步骤(1)中的淀粉琼脂平板培养基组分如下，均为重量百分比：琼脂15％，淀粉7％，酵母浸粉1.8％，蛋白胨01.3％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，氯化钠0.8％，余量为水，pH7.2～7.3。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述步骤(2)中液体种子培养基组分如下，均为重量百分比：蛋白胨1.0％，葡萄糖2.6％，酵母浸膏1.3％，N aCl 0.8％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，余量为水，PH7.0～7.1；
根据本发明优选的，所述步骤(3)种发酵培养基的组成成分及重量百分比为：玉米浆0.7％，玉米淀粉0.2％，麸皮粉1.4％，葡萄糖0.8％，酵母浸膏0.5％，蛋白胨 0.2％，KH2PO40.005％，(NH4)2SO40.009％，MnSO40.006％，CaCO30.007％， MgSO4.7H20.008％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，余量为水，pH7.4～7.5。
一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液在防治棉花枯黄萎病中的应用。
上述应用，步骤如下：
将一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂，在播种前做好浸种处理(3h)，待棉花出苗2个月，与水1：800混合4小时后(充分混合并通过 200目滤网过滤后)，进行滴灌，每隔7天重复一次，共计处理3次。
有益效果：
本发明所述的一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的制备及应用，制备工艺、培养基配方和发酵工艺独特，制备的菌液活孢子数高，并可用于棉花枯黄萎病的生物防治。生物防治不仅对环境无污染，还不易使病菌产生抗药性，且相对于耐病品种的培育更为容易获得，选择甲基营养型芽孢杆菌LW-6作为生防菌，是由于该菌对营养要求低，抗逆性强，生长繁殖快，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力以及更高的棉花枯萎病防治效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1中的甲基营养型芽孢杆菌保藏登记号为CGMCC No.6793，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的甲基营养型芽孢杆菌LW-6。
实施例1：
一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂，采用如下方法制备：
(1)将甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种接种于琼脂淀粉平板培养基上，35℃下培养72h，显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵出发菌落；
(2)将所述步骤(1)所述的发酵出发菌落接种于液体种子培养基，装液量为：500ml的摇瓶装100ml种子液，培养温度35℃，转速200rpm条件下培养72h，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)得到的发酵种子液，按照9％的接种量接入发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：罐压0.07Mpa，风量1:0.8vvm，转速260rpm，培养温度为35℃，直到发酵罐中发酵液中的活孢子数达200亿/ml以上、芽孢量大于或等于92％时即可终止发酵，
(4)将步骤(3)得到的发酵液进行超滤浓缩,去掉40％水分，其特征为：：串联使用孔径分别为0.005um、0.001um和1nm的3个超滤膜组件，将发酵液在35℃、压力0.3MPa 条件下依次同时进行连续超滤处理，超滤时间4h,得到一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂,活孢子数≥200亿/ml.
所述淀粉琼脂平板培养基组分如下，均为质量百分比：淀粉琼脂平板培养基组分如下，均为重量百分比：琼脂15％，淀粉7％，酵母浸粉1.8％，蛋白胨01.3％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，氯化钠0.8％，余量为水，pH7.3。
所述液体种子培养基组分如下，均为重量百分比：蛋白胨1.0％，葡萄糖2.6％，酵母浸膏1.3％，N aCl 0.8％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，余量为水，PH7.1；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：玉米浆0.7％，玉米淀粉0.2％，麸皮粉1.4％，葡萄糖0.8％，酵母浸膏0.5％，蛋白胨0.2％，KH2PO40.005％，(NH4)2SO40.009％，MnSO40.006％，CaCO30.007％，MgSO4.7H20.008％，硫酸镁0.1％,碳酸钠0.2％，余量为水，pH7.5
实施例2一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液对棉花黄萎病的防治效果。
试验处理：试验处理：用实施例(1)制得的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂与水1：800充分混合并通过200目滤网过滤后于棉花播种前将种子浸泡3个小时，待出苗之后进入旺长期(出苗后2月)进行加有本发明菌剂的滴灌处理；空白对照组：用等量清水进行浸种和滴灌。
试验方法：选取2个试验小区，选取市售棉花种子，在播种前做好浸种处理，待出苗后进入旺长期(出苗后2月)用实施例(1)制得甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂与水1：800充分混合后通过200目滤网过滤，进行滴灌的处理，每间隔7天进行一次，重复三次。对照组进行同种方法。试验结果见表一，从表一可看出该菌剂通过滴灌对棉花黄萎病的防治效果可达81.2％。
表一甲基营养型芽孢杆菌LW-6对棉花黄萎病的防治效果
| 处理组 | 对照组 | |
| 播种株数 | 1000 | 1000 |
| 第一次调查记录病株数 | 30 | 120 |
| 第二次调查记录病株数 | 50 | 263 |
| 第三次调查记录病株数 | 93 | 495 |
| 最终发病率 | 9.30％ | 49.50％ |
| 最终防治效果 | 81.20％ |
(注：病株没有划分等级记录，为统一记录)
表一附：棉花黄萎病分级标准：0级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级：棉株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：棉株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：棉株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫； 4级：棉株四分之三以上叶片发病，或棉株枯死。
实施例3一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂对棉花枯萎病的防治效果。
1、试验处理：试验处理：用实施例(1)制得的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂与水1：800充分混合并通过200目滤网过滤后于棉花播种前将种子浸泡3个小时，待出苗之后进入旺长期(出苗后2月)，进行加有本发明菌剂的滴灌处理；空白对照组：用等量清水进行浸种和滴灌。
2、试验方法：选取2个试验小区，选取市售棉花种子，在播种前做好浸种处理，待出面后用实施例(1)制得甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液与水1：800充分混合并通过200 目滤网过滤后进行加有本发明菌剂的滴灌处理，每间隔7天进行一次，重复处理三次。对照组进行同种方法。试验结果见表二，从表二可看出本发明甲基营养型芽孢杆菌LW-6 液体菌剂对棉花枯萎病的防治效果可达81.0％
表二甲基营养型芽孢杆菌LW-6对棉花枯萎病的防治效果
| 处理组 | 对照组 | |
| 播种株数 | 1000 | 1000 |
| 第一次调查记录病株数 | 38 | 149 |
| 第二次调查记录病株数 | 62 | 277 |
| 第三次调查记录病株数 | 102 | 524 |
| 最终发病率 | 10.20％ | 52.40％ |
| 最终防治效果 | 81.00％ |
表二附注:棉花枯萎病分级标准：0级：健株无症状表现，茎杆木质部无病变；1级：病株叶片25％表现典型病状，茎杆木质部病变占剖面1/4以下；2级：病株叶片25 ％～50％表现典型病状，茎杆木质部病变占剖面1/4至1/2；3级：病株叶片50％～ 90％表现典型病状，茎杆木质部病变占剖面1/2至3/4；4级：病株叶片全部病状，枯萎落叶或急性枯死，茎杆木质部病变占剖面3/4以上。
Claims (7)
1.一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌液制备及应用,
其特征在于采用如下方法制备 ：
（1）将甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种接种于琼脂淀粉平板培养基上，35℃下培养 72h，显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵出发菌落；
（2）将所述步骤(1)所述的发酵出发菌落接种于液体种子培养基，装液量为 ：500ml的摇瓶装 100ml 种子液，培养温度 35℃，转速 200rpm 条件下培养 72h，得到发酵种子液 ；
（3）将步骤 (2) 得到的发酵种子液，按照 9％的接种量接入发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养，培养条件为 ：罐压 0.07Mpa，风量 1:0.8vvm，转速260rpm，培养温度为 35℃， 直到发酵罐中发酵液中的活孢子数达200亿/ml 以上、芽孢量大于或等于 92％时即可终止发酵，
(4) 将步骤(3)得到的发酵液进行超滤浓缩,去掉40%水分，其特征为：：串联使用孔径分别为0.005um、0.001um和1nm的3个超滤膜组件，将发酵液在35℃、压力0.3MPa条件下依次同时进行连续超滤处理，超滤时间4h, 得到一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂,活孢子数≥200亿/ml。
2. 如权利要求 1所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液，其特征在于，所述步骤（1）中的甲基营养型芽孢杆菌保藏登记号为：CGMCCNo.6793，保藏机构为 ：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的甲基营养型芽孢杆菌。
3. 如权利要求 1 所述的甲基营养型芽孢杆菌液，其特征在于，所述步骤（1）中的琼脂淀粉平板培养基组分如下，均为重量百分比 ：琼脂15%，淀粉7%，酵母浸粉 1.8%，蛋白胨01.3%，硫酸镁0.1%,碳酸钠0.2%，氯化钠 0.8%，余量为水，pH7.2～ 7.3。
4. 如权利要求 1 所述的甲基营养型芽孢杆菌菌液，其特征在于，所述步骤（2）中液体种子培养基组分如下，均为重量百分比 ：蛋白胨1.0%，葡萄糖 2.6％，酵母浸膏 1.3％，NaCl 0.8％，硫酸镁0.1%,碳酸钠0.2%，余量为水，PH7.0～7.1。
5.如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌菌液，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养基的组成成分及重量百分比为：玉米浆 0.7％，玉米淀粉 0.2％，麸皮粉1.4％，葡萄糖0.8％，酵母浸膏 0.5％，蛋白胨 0.2％，KH2PO4 0.005 ％，(NH4)2SO4 0.009 ％，MnSO40.006 ％，CaCO3 0.007 ％， MgSO4.7H2 0.008％，硫酸镁0.1%,碳酸钠0.2%，余量为水，pH7.4～ 7.5。
6.权利要求 1 所述的是一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌液的制备及应用。
7.如权利要求 6 所述的应用，其特征在于，步骤如下 ：
将一种用于棉花枯黄萎病生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂在播种前做好浸种处理（3h），待棉花出苗2个月，与水1：800混合4小时后（充分混合并通过200目滤网过滤后），进行滴灌，每隔7天重复一次，共计处理3次。
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