CN102851245B - 一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂，所用的生防微生物为烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa菌株，该菌株2012年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.6161。该微生物通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，且在烟草根际有很好的定殖能力，是一种具有工业化生产前景的菌株。菌剂为Kpa菌株可湿性粉剂，它对烟草青枯病菌有很好的防治效果，能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。利用Kpa菌株制备的Kpa菌株可湿性粉剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生物农药。本发明为烟草农业生产中青枯病的防治提供了一种具有较好防治效果的生防微生物。

Description

一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，特别是涉及一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂。 

背景技术

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种在世界范围内广泛传播的土传病害（彭西桥，刘红艳，罗宽等.烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定.中国烟草科学，2007（2）:38-40），该病具有危害大、分布广等特点。烟草青枯病在我国长江流域及南方各烟草种植区普遍发生，尤以广东、福建、湖南、江西等烟区为甚（陈瑞泰，朱贤朝，王智发等.全国主产烟省（区）烟草侵染性病害调研报告.中国烟草科学，1997（4）:3-9）。目前，在烟草青枯病的防治方面主要采用化学药剂，但防治烟草青枯病药剂的药效尚不十分理想，且长期使用化学药剂，导致病原的抗药性不断增强，用药量不断增加，严重影响生态环境及烟叶的生产质量。随着人类环保意识的增强，以及发展绿色烟叶、有机烟叶的需要，生物防治已经成为防控烟草青枯病的主导措施之一。 

采用微生物拮抗的方法，即利用致病拮抗菌或其提取物来防治病害的发生，具有高效、无污染和长效性等优点，在植物病害的防治中占据越来越重要的位置（霍沁建，张深，王若焱.烟草青枯病研究进展.中国农学通报，2007（8）:364-368）。对于烟草青枯病的微生物防治，研究者多从烟草种植区无病土壤中筛选生防菌。李清飞等从福建烟田根际土壤中分离出5株对烟草青枯病有明显抑制作用的细菌（李清飞，李红丽，王岩，等.烟草青枯病病原菌的分离及其拮抗菌的筛选.河南农业科学，2006（1）:51-53），Lemessa等从埃塞俄比亚烟田根际土壤中筛选出6株对烟草青枯病有明显拮抗作用的细菌（LEMESSA F,ZELLER W.Screening rhizobacteria for biological control of ralstonia solanacearum in Ethiopia .Biological Control ,2007,42(3):336-344）。然而，目前这类从土壤分离的拮抗菌存在的最大问题是防效不稳定。主要原因是：生防菌在土壤中普遍受到土壤抑菌作用（Lockwood J L.1977. Fungistasis in soil. Biological Reviews,52(1):1-36.）的影响，生防菌的萌发率很低，一般在0-30%之间，很少超过50%，因此，很难在土壤中建立达到控制靶标对象所需的种群密度。这类生防菌在根际的定殖能力已经成为阻碍其产品大面积推广应用的瓶颈问题。 

植物内生菌（Plant endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌(Stone J K, Bacon C W.  2000. An overview of endophytic microbes: endo- phytism defined. Bacon C W, White J F Jr. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekker, P3-9)。虽然，植物内生菌的分离纯培养较困难，但植物内生菌易于定殖在植物体内，相对于植物外生生防微生物，在定殖方面更具优势。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长、在烟草根际有很好的定殖能力、具有工业化生产前景的抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株。 

本发明的第二个目的在于提供一种用于培养抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株的菌剂。 

本发明的第一个目的是这样实现的： 

一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株，为烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa菌株，从烤烟新鲜叶片中分离、鉴定获得，已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年05月29日，保藏号：CGMCC No.6161。

烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa菌株的培养条件为：培养基为金氏培养基(Kings Medium)（葡萄糖24.0~26.0 g，蛋白陈19.0~21.0 g， MgSO₄·7H₂O 1.4~1.6 g， KH₂PO₄ 1.4~1.6g，蒸馏水1000 ml），pH 7.0，接种量2.5~3.5%，摇瓶培养38~46 h，培养温度34~37℃；摇瓶培养时Kpa菌株的生物量达2.00×10⁹ cfu/ml。 

本发明的第二个目的是这样实现的： 

一种用于培养抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株的菌剂，特征是：菌剂中的活菌数为6.0~6.5×10⁹ cfu/g、含水量为6.0~6.5%、悬浮率为70.0~72.0%、细度为99.5~99.7%，过400目筛，湿润时间为17.5~18.5 s，符合微生物农药国家标准（GB 20287-2006）。

所述菌剂为Kpa菌株可湿性粉剂，Kpa菌株可湿性粉剂由如下以百分比计的原料组成：Kpa菌剂原粉：8~12%，木钠：4~7%，十二烷基硫酸钠：0.4~0.6%，海藻酸钠：0.8~1.2%，蔗糖：0.8~1.2%，硅藻土：81~83%。 

Kpa菌剂原粉和Kpa菌株可湿性粉剂的最佳存储温度为3~5℃。 

Kpa菌株可湿性粉剂的制备方法为： 

A、将Kpa菌株先在发酵罐中进行发酵，发酵结束后用超滤***将发酵液进行浓缩，得到浓缩液，然后浓缩液于保鲜薄膜上摊开并在室内凉干，最后用搅碎机粉碎得到Kpa菌剂原粉；

B、将Kpa菌剂原粉与木钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、蔗糖和硅藻土按照20︰11︰1︰2︰2︰164的比例混合，搅拌均匀，最后得到Kpa菌株可湿性粉剂。

烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa菌株是本申请人从烤烟新鲜叶片中分离、鉴定的一种植物内生菌新物种。该微生物通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，且在烟草根际有很好的定殖能力，是一种具有工业化生产前景的菌株。 

利用Kpa菌株制备的Kpa菌株可湿性粉剂对烟草青枯病菌有很好的防治效果，能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。利用Kpa菌株制备的Kpa菌株可湿性粉剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生物农药。 

施用时可将Kpa菌株可湿性粉剂与烟草育苗基质混合使用，也可在移栽时施入烟草根际周围，或在成熟期兑水灌根。对病害发生严重田块，移栽期和成熟期分别施用一次效果最好。 

本发明为烟草农业生产中青枯病的防治提供了一种具有较好防治效果的生防微生物。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。 

1. Kpa菌株的培养及Kpa菌剂的制备 

Kpa菌株试管斜面种子的培养：将Kpa菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，在18-38℃下培养2-5天后获得Kpa菌株斜面种子，适宜的培养条件是36℃下培养2天。

Kpa菌株液体种子的培养：从划线培养的平板上取一环Kpa菌株接到YSP（蔗糖琼脂培养基）培养液中，在36℃下，转速150 rpm，培养24 h后作为种子。 

Kpa菌株可湿性粉剂的制备：在50 L发酵罐中用YSP培养基培养红霉素抗性标记的Kpa菌株（Kpa红霉素抗性标记菌株由云南大学提供），按培养基体积的5%接种液体Kpa种子，发酵条件为30℃、转速200 rpm、通气率0.8、42 h。发酵结束后用超滤***将发酵液浓缩至原有体积的1/5。发酵后浓缩液于保鲜薄膜上摊开，并在室内凉干，再用搅碎机粉碎成Kpa菌剂原粉。将Kpa菌剂原粉与木钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、蔗糖和硅藻土按照20︰11︰1︰2︰2︰164的比例混合，搅拌均匀，最后得到Kpa菌株可湿性粉剂。 

用常规的稀释平板涂布法计算单位重量的Kpa菌剂原粉中的活性数（cfu/g）。将5 gKpa菌剂原粉于120℃下烘烤1 min后取称重，计算Kpa菌剂原粉的含水量。 

含水量(%)=（初始重量-烘干重量）÷初始重量×100%。 

2. Kpa菌株可湿性粉剂防治青枯病的温室试验 

供试菌剂：活菌数为1×10⁹个/g的Kpa可湿性粉剂。

烟草品种：K326。 

供试病原材料：烟草青枯病菌。 

试验方法： 

烤烟常规漂浮育苗时，50 g Kpa可湿性菌剂用300 ml水稀释后与1 kg育基质混匀；阳性对照处理为青枯灵可湿性粉剂，青枯灵1 g用300 ml水稀释后与1 kg育基质混匀；空白对照为300 ml水与1 kg育基质混匀。待烟苗长至5-6片叶子时，在直径为15 cm的、装有500 g土壤（沙土:腐殖土=1:1）的每一花钵移栽一株烟苗，在烟根接种青枯病病原菌5 ml，每处理三个重复，每重复5盆。肥水管理按常规方法进行，在室温温室内生长90天后统计各处理的烟草青枯病的发病率，按以下公式计算发病率和防效：

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效（%）=空白对照的发病率-药剂处理的发病率

试验结果：空白对照的发病率为87.5%；青枯灵可湿性菌剂处理的发病率为10.8%，防效为76.7%；Kpa可湿性菌剂处理的发病率为11.3%，防效为76.2%，与化学农药青枯灵可湿性粉剂的防治效果相当。

Claims (5)

1.一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株，其特征在于：为烟草赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus tobaccocum）Kpa菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年05月29日，保藏号：CGMCC No.6161。

2.根据权利要求1所述的烟草内生菌菌株，其特征在于：烟草赖氨酸芽孢杆菌Kpa菌株的培养条件为：培养基为金氏培养基，pH 7.0，接种量2.5~3.5%，摇瓶培养38~46 h，培养温度34~37℃；摇瓶培养时Kpa菌株的生物量达2.00×10⁹ cfu/ml。

3.一种抗烟草青枯病的含权利要求1中的Kpa菌株的菌剂，其特征在于：菌剂中的活菌数为6.0~6.5×10⁹ cfu/g、含水量为6.0~6.5%、悬浮率为70.0~72.0%、细度为99.5~99.7%，过400目筛，湿润时间为17.5~18.5 s。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为Kpa菌株可湿性粉剂，Kpa菌株可湿性粉剂由如下以百分比计的原料组成：Kpa菌剂原粉：8~12%，木钠：4~7%，十二烷基硫酸钠：0.4~0.6%，海藻酸钠：0.8~1.2%，蔗糖：0.8~1.2%，硅藻土：81~83%；

其中：Kpa菌剂原粉和可湿性粉剂的制备方法为：

A、将Kpa菌株先在发酵罐中进行发酵，发酵结束后用超滤***将发酵液进行浓缩，得到浓缩液，然后浓缩液于保鲜薄膜上摊开并在室内凉干，最后用搅碎机粉碎得到Kpa菌剂原粉；

B、将Kpa菌剂原粉与木钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、蔗糖和硅藻土按照20︰11︰1︰2︰2︰164的比例混合，搅拌均匀，最后得到Kpa菌株可湿性粉剂。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：Kpa菌剂原粉和Kpa菌株可湿性粉剂的最佳存储温度为3~5℃。