CN103041412A - 一种具有fshr靶向性的pet示踪剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以正电子显像核素标记具有FSHR靶向性的多肽化合物得到的PET示踪剂及其制备方法，并公开了其在肿瘤活体监测领域中的应用。所述PET示踪剂解决了FSHR靶向性正电子示踪剂领域的空白及对FSHR水平进行活体监测的技术问题。特别适用于FSHR高表达的肿瘤的诊断、疗效监测等。

Description

一种具有FSHR靶向性的PET示踪剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种对具有***受体靶向性的多肽化合物进行正电子核素标记得到的PET示踪剂，以及其在检测肿瘤中的应用。

背景技术

***(foll icle s t imulat ing hormone，FSH)是垂体分泌的可以刺激***生成和***成熟的一种激素，通过与分布于性腺的***受体（FSHR）结合发挥生物学功能。FSH主要作用为促进卵泡成熟。人***促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进整个卵巢长大。***在男女两性体内都是很重要的激素之一，有助于调控发育、生长、***性成熟以及生殖相关的一系列生理过程，尤其在生殖相关的生理过程中发挥着至关重要的作用。

FSH是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两条亚基组成，其中，β亚基负责与FSH受体的相互作用。黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜***等糖蛋白激素具有与***相似的结构，它们共享同样的α亚基，而β亚基则随激素的不同而不同。

正电子发射计算机断层扫描（Po s it ron emi s s ion tomography，简称PET）是将人体代谢所必需的物质（如葡萄糖、蛋白质、核酸、氧等）标记上短半衰期的核素（¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁶⁸Ga或⁶⁴Cu）制成示踪剂（如¹⁸F-FDG），注入人体后进行断层扫描，采集数据及成像，进行诊断和分析。PET可在活体上显示生物分子代射、受体及神经介质活动。目前已广泛应用于多种疾病的诊断与鉴别、病情判断、治疗效果评价、脏器功能研究和新药开发等方面。

PET在肿瘤诊断和治疗中的应用，主要是因为绝大部分恶性肿瘤存在着对葡萄糖、蛋白质、核酸、氧等物质具有高代谢或高表达倾向，例如¹⁸F-FDG作为与葡萄糖结构相似的放射性物质，静脉注射入人体后会在恶性肿瘤中聚集，PET显像可以将其显示出来，进而PET显像可以分辨恶性肿瘤与正常组织及良性病变。同时，PET也可对复发的肿瘤与周围坏死及瘢痕组织加以区分。在肿瘤化疗、放疗的早期（第一周期结束或全疗程的中期），当形态学检查尚未出现明显变化时，PET检查即可发现肿瘤代射是否已经受到抑制，从而为确定进一步治疗的方案提供帮助。PET多用于肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、脑肿瘤、头颈部肿瘤、淋巴瘤等多种肿瘤的诊治。

正常成年人中性腺血管内皮细胞有极少量FSHR表达，但近来研究发现肿瘤血管内皮细胞中FSHR高度表达。2010年《新英格兰医学杂志》（Radu A,Pichon C,Camparo P,et a l.Expression of follicle-stimulating hormonereceptor in tumor blood vessels.N Eng l J Med.2010Oct21;363(17):1621-30.）报道1336例患者肿瘤标本中，所有级别的肿瘤（包括早期T1期肿瘤）的内皮细胞都表达FSH受体。这些肿瘤位于***、乳腺、结肠、胰腺、膀胱、肾、肺、肝、胃、睾丸和卵巢。同时，良性炎症组织和毗邻正常组织中未检出FSHR表达。另外，肿瘤FSHR表达水平与预后存在着显著相关性。由此可以猜测，FSHR可能是潜在的肿瘤靶向标志物，活体监测FSHR的表达将有助于肿瘤的诊断和治疗。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有FSHR靶向性的PET示踪剂及其制备方法；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种通过无创观测肿瘤FSHR表达水平进行肿瘤诊断的技术。

本发明所述的PET示踪剂，通过对具有FSHR靶向性的多肽化合物进行正电子核素标记得到。所述具有FSHR靶向性的多肽化合物优选为***类多肽。

上述PET示踪剂，所述多肽化合物优选为***，本领域技术人员可以对所述***的全部序列或部分氨基酸序列进行标记操作，以实现本发明的目的，或是对所述***进行适应性的修饰后再进行正电子核素显像标记，均可以实现本发明的目的。

本发明优选包含***β亚基的第33-53位的氨基酸残基序列，即如SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列；或第81-95位的氨基酸残基序列，即如SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列。

上述多肽化合物均可市售，本申请所述的多肽化合物均购自楚肽公司，纯度均在95%以上。

上述PET示踪剂，具有如下所示的结构：X-N-G；其中X为所述正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述多肽化合物。

上述PET示踪剂，所述双功能螯合剂为本领域技术人员熟知的可起到连接作用的基团，优选与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂。

更优的，所述双功能螯合剂为可与巯基定位结合的螯合剂如：

MAA-NOTA，中文名称为（2,2'-(7-(2-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

MAA-GA-NODA，中文名称为2,2'-(7-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

MAA-DOTA，中文名称为2,2',2″-(10-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸]；

和/或

与氨基定位结合的螯合剂如：

p-SCN-Bn-NOTA，中文名称为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸；

DOTA-NHS，中文名称为2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-氧乙基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸。

上述螯合剂均可购自法国Chematech公司或美国Macrocyclic s公司，各型号产品并无明显区别，对本发明的技术效果不产生影响，本发明中均选用100mg包装。

同样的，所述PET示踪剂具有如Y-G所示的结构；其中Y为正电子显像核素标记辅基，G为所述多肽化合物。

所述正电子显像核素标记辅基可选择本领域技术人员熟知的起到连接作用的集团，本发明中，所述标记辅基优选¹⁸F-NPFP，中文名称为2-[¹⁸F]氟丙酸（4-硝基）苯酯；所述标记辅基¹⁸F-NPFP可参照文献报道的方法制得。

上述PET示踪剂的正电子显像核素，可以为本领域中常使用的正电子显像核素，本发明所述的正电子显像核素优选为¹⁸F或⁶⁸Ga。

本发明还公开了连接基为标记辅基时，上述PET示踪剂的制备方法，包括如下步骤：取所述标记辅基与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，分离纯化得到所需的PET示踪剂。

本发明还公开了连接基为双功能螯合剂时，上述PET示踪剂的制备方法，包括如下步骤：（1）制备标记前体：取含有所述双功能螯合剂的缓冲液与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，纯化得到所需的标记前体；（2）制备所述正电子显像核素溶液；（3）将步骤（1）中制备的所述标记前体溶液与步骤（2）中制备的所述正电子显像核素溶液混合反应，并分离纯化，即得。

所述步骤（1）中，所述双功能螯合剂与多肽化合物的摩尔比例为1:1-10:1。

上述PET示踪剂的制备方法，所述步骤（1）中，所述含有双功能螯合剂的缓冲液和所述含有多肽化合物的缓冲液彼此独立的为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐缓冲溶液或二甲亚砜。

上述PET示踪剂的制备方法，在所述步骤（3）中，还包括将所述标记前体溶解于乙醇、乙腈或水的步骤。

上述PET示踪剂的制备方法，在步骤（3）中，还包括在所述标记前体中加入AlCl₃溶液和/或酸性溶液的步骤，所述酸性溶液为醋酸、抗坏血酸和醋酸-醋酸钠缓冲液等。

本领域技术人员可以根据各自熟知的技术手段选择合适的方法对产物进行纯化及检测，本发明选择以制备型HPLC进行对产物的纯化，并以分析型HPLC方法对产物的纯度进行检测分析。该方法简单、高效，且纯化及检测精度高。

本发明还提供了一种具有FSHR靶向性的多肽化合物用于PET示踪剂的应用。

上述PET示踪剂在进行肿瘤活体监测领域的应用。

一种活体监测肿瘤的技术，使用上述的PET示踪剂进行PET扫描以监测活体的FSHR水平。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

1、本发明采用具有FSHR靶向性的多肽化合物，以正电子核素进行标记，首次制备了靶向FSHR的PET示踪剂。阻断实验证实此类显像剂与FSHR特异性结合，经正电子断层扫描显像，肿瘤可清晰显影，并进行肿瘤FSHR表达的定量分析。为人类检测及诊治肿瘤病症提供了新的医疗途径；

2、本发明所述的PET示踪剂，优选对与FSHR有良好结合性能的***类多肽进行标记，能够与FSHR高度特异性结合，达到示踪的目的；

3、本发明优选对***的第33-53位氨基酸序列和第81-95位氨基酸序列进行正电子显像核素标记，实验表明，FSH_33-53和FSH_81-95具有最强的与FSHR结合的能力，尤其是FSH_33-53不仅是抗FSH血清抗原的一部分且与***(LH)不发生交叉反应，能够实现对FSHR的高效显像；

4、由于标记的多肽化合物与肿瘤血管内皮细胞高度表达的FSHR特异性结合且放射性核素标记多肽具有组织渗透迅速的优点，因此本发明所述示踪剂可以灵敏的、快速的与FSHR特异性结合，进而可以快速的对肿瘤进行显像，有利于对肿瘤的诊断和分析，进而有利于肿瘤的及早发现；

5、本发明所述的标记方法选用适宜的螯合剂或标记辅基进行正电子现象核素标记，所述方法简单快捷，标记率和放化纯均可达到满意效果，且适用于医用检测之用，便于临床推广；

6、本发明所述的标记方法优选与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂，不仅标记步骤简单，且标记效率较高；

7、本发明所述的方法以HPLC法对标记前体和标记产物进行提纯和纯度分析，不仅分离效果较好，且与杂质明显区分；

8、荷瘤鼠microPET显像表明，肿瘤清晰可见，肿瘤与背景对比度高。尾静脉注射1小时后，肿瘤与正常肌肉组织对所述PET示踪剂的摄取比值大于5，提示所述PET示踪剂与肿瘤高表达的FSHR特异性结合。阻断实验显示，在未标记FSHR靶向肽阻断下，肿瘤中放射性浓聚显著降低，该结果证实所述PET示踪剂与FSHR特异性结合。综上所述，本发明解决了靶向FSHR的PET示踪剂的制备和活体监测肿瘤的技术问题。特别适用于高表达FSHR的肿瘤的诊断、疗效监测等。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例1中所述PET示踪剂的标记前体的分析型HPLC图；

图2为实施例1所述PET示踪剂的分析型HPLC图；

图3-A为实施例1中所述荷人PC-3***癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；

图3-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷P人PC-3***癌模型鼠的主要器官对PET示踪剂的摄取值；

图3-C为实施例1中所述荷人PC-3***癌模型鼠的靶/非靶比值；

图4-A为实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；

图4-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠的主要器官对PET示踪剂的摄取值；

图4-C为实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠的靶/非靶比值；

图5-A为实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；

图5-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠主要器官对PET示踪剂的摄取值；

图5-C为实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠的靶/非靶比值；

图6为本发明实施例2所述PET示踪剂的分析型HPLC图；

图7-A为实施例2中所述荷人PC-3***癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；

图7-B为通过ROI计算所得实施例2中所述荷人PC-3***癌模型鼠主要器官对PET示踪剂的摄取值；

图7-C为实施例2中所述荷人PC-3***癌模型鼠的靶/非靶比值；

图8为本发明实施例3中所述PET示踪剂的分析型HPLC图；

图9-A为实施例3中所述荷人PC-3***癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；

图9-B为通过ROI计算所得实施例3中所述荷人PC-3***癌模型鼠ROI计算所得主要器官对PET示踪剂的摄取值；

图9-C为实施例3中所述荷人PC-3***癌模型鼠的靶/非靶比值。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述的PET示踪剂是以双功能螯合剂MAA-NOTA为连接基对具有SEQ.ID NO：1所示氨基酸序列的多肽化合物进行正电子核素（¹⁸F）标记，具体步骤包括：

1）标记前体NOTA-MAA-FSH_33-53的制备：将1ml(8mg,11.6mmol)含有MAA-NOTA的0.2M乙酸铵溶液加入到含有氨基酸序列如SEQ.ID NO：1所示的多肽化合物(6.8mg，2.6mmol)的0.2M乙酸铵溶液中，室温反应1小时。

反应结束后，使用制备型HPLC纯化，条件如下：

制备型反相C₁₈柱（Xbridge，19×150mm，Waters）；

Waters2998二级管阵列紫外检测器；

BioScan放射性检测器；

Waters2545二元高压梯度泵；

流动相为：A、含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液；B、含0.1%TFA的水溶液；

梯度洗脱：0-2分钟的5%A和95%B增加到21分钟的65%A和35%B；

流速为20ml/min，检测波长为218nm。

收集出峰时间为9.0min时的流份，冻干后得到3.5mg白色粉末，获得标记前体。

通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为：

反相C₁₈柱（Luna，4.6×250mm，phenomenex）；

Waters1525二元HPLC液相泵；

Radiomatic610TR放射性检测器(Perkin-Elmer)；

Waters2998双波长紫外检测器；

流动相为：A、含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液；B、含0.1%TFA的水溶液；

梯度洗脱：0-2分钟的5%A和95%B增加到32分钟的65%A和35%B；

流速为1ml/min，检测波长为218nm；

前体保留时间：15.9分钟（HPLC图谱见图1所示），产品纯度>95%。LC-MS:[MH]⁺=2968.5(m/z),这与标记前体即NOTA-MAA-FSH_33-53(C₁₃₃H₂₁₀N₃₆O₃₉S:2968.1)的计算值相吻合。

所述标记前体NOTA-MAA-FSH_33-53的结构式如下：

2）¹⁸F溶液的制备：医用加速器中采用质子速轰击H₂ ¹⁸得到¹⁸F溶液。采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为20mCi。

3）PET示踪剂—¹⁸F-Al-NOTA-MAA-FSH_33-53的制备：将40μg前述标记前体用200μl乙醇溶解，加入6μl的2mM的AlCl₃溶液和40μl的5%醋酸，充分混匀后加入100μl20mCi前述新鲜制得的¹⁸F-溶液，100℃反应10min。冷却，并加15ml水稀释后注入C18分离小柱，（Var i an BOND ELUT C₁₈，100mg1ml），5ml的磷酸盐缓冲液和8ml水冲洗柱子后用300μl乙醇洗脱标记产品，生理盐水稀释后无菌过滤即得所述PET示踪剂，合成时间约20min，采用CRC-15R活度计（CAPI NTEC）测定其放射剂量为10.1mCi，因此，计算其标记率（未校正）为49.4±3.0%。

采用步骤2中所述的分析型HPLC条件对示踪剂进行检测，产品保留时间：15.5分钟（HPLC图谱见图2所示），放射化学纯度>95%。

PET示踪剂¹⁸F-Al-NOTA-MAA-FSH_33-53的结构式及合成路线图如下，

MicroPET显像

取荷人移植瘤（PC-3***癌、MDA-MB231乳腺癌和A549肺癌）模型鼠置于小动物PET床板上，异氟烷麻醉模型鼠，经胶带固定。模型鼠经尾静脉注射上述PET示踪剂的生理盐水溶液(1.85MBq,0.2mL)。注射后30分钟、1小时、2小时，分别进行microPET显像，结果分别如图3-A、图4-A和图5-A所示。图中箭头所示为肿瘤。图中颜色由明到暗表示所述PET示踪剂摄取值由高到低。

采用二维有序子集期望最大化算法进行图像重建。在肿瘤、肌肉、肝等器官用感兴趣区（ROI）法计算放射性活度（MBq/mL），所得值除以注射剂量获得各组织对PET示踪剂摄取值（%ID/g）（假定组织密度为1g/ml）。计算结果分别如图3-B、图4-B和图5-B所示。靶/非靶比值（T/NT）分别如图3-C、图4-C和图5-C所示。

如图3-A、图4-A和图5-A所示，注射上述PET示踪剂后30min到60min，各移植瘤均清晰可见，其中PC-3人***癌移植瘤在注射后30min到120min均清晰可见。从图中可以看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。

所述PET示踪剂在模型鼠的肾中具有显著的浓聚，这表明其主要通过肾代谢。随着时间的延长，所述PET示踪剂在模型鼠体内的浓聚逐渐降低，显示所述PET示踪剂逐渐代谢排出体外，这表明所述PET示踪剂是安全的，不会持久的存于鼠体内，且半衰期较短，不会对模型鼠造成伤害。

如图3-B、图4-B和图5-B所示，注射后30min，肿瘤对所述PET示踪剂摄取值达最高约1-3%ID/g，随着时间的变化，摄取值逐渐降低。肾对所述PET示踪剂摄取值显著，证实所述PET示踪剂主要通过肾代谢。此外，如图3-C、图4-C和图5-C所示，肿瘤较正常组织如肌肉对所述PET示踪剂摄取显著，肿瘤与肌肉摄取比值（T/NT）均大于5，这有利于获得高清晰度的肿瘤PET图像，便于肿瘤的诊断和治疗。

特异性实验：

荷人PC-3***癌模型鼠预先注射未标记的靶向FSHR多肽化合物（FSH_33-53）（10mg/kg体重）30min后，然后注入所述PET示踪剂，1小时后进行microPET显像。

由图3-A至3-C中可见，注射后60min，阻断组模型鼠移植瘤对PET示踪剂的摄取值较未阻断组显著下降约70%。这是由于未标记的靶向FSHR的多肽化合物，有效抑制肿瘤高表达的FSHR与所述PET示踪剂的结合，导致肿瘤对所述PET示踪剂的摄取值相应降低。实验证实，所述PET示踪剂与FSHR特异性结合。

实施例2

本实施例所述的靶向FSHR PET示踪剂是以双功能螯合剂MAA-DOTA为连接基对具有SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽化合物进行正电子核素（⁶⁸Ga）标记，具体步骤包括：

1）标记前体DOTA-MAA-FSH_33-53的制备：将1ml(3.9mg,5mmo l)含有MAA-DOTA的0.2M乙酸铵溶液加入到含有氨基酸序列如SEQ.ID NO：1所示的多肽化合物(8mg，3.0mmo l)的0.2M乙酸铵溶液中，室温反应1小时。

反应结束后，使用制备型HPLC纯化，条件如下：

制备型反相C₁₈柱（Xbridge，19×150mm，Waters）；

Waters2998二级管阵列紫外检测器；

BioScan放射性检测器；

Waters2545二元高压梯度泵；

流动相为：A、含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液；B、含0.1%TFA的水溶液；

梯度洗脱：0-2分钟的5%A和95%B增加到21分钟的65%A和35%B；

流速为20ml/min，检测波长为218nm。

收集出峰时间为8.5min时的流份，冻干后得到4.5mg白色粉末，获得标记前体DOTA-MAA-FSH_33-53。

通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为：

反相C₁₈柱（Luna，4.6×250mm，phenomenex）；

Waters1525二元HPLC液相泵；

Radiomatic610TR放射性检测器(Perkin-Elmer)；

Waters2998双波长紫外检测器；

流动相为：A、含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液；B、含0.1%TFA的水溶液；

梯度洗脱：0-2分钟的5%A和95%B增加到32分钟的65%A和35%B；

流速为1ml/min，检测波长为218nm。

前体保留时间：15.7分钟，产品纯度>95%。LC-MS:[MH]⁺=3071.1(m/z),这与标记前体即DOTA-MAA-FSH_33-53(C₁₃₇H₂₁₇N₃₇O₄₁S:3070.4)的计算值相吻合。

所述标记前体DOTA-MAA-FSH_33-53的结构式如下：

2）新鲜⁶⁸Ga溶液的制备：用注射器抽取0.05mol/l盐酸5ml.对⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器进行淋洗，收集洗脱液，每瓶1ml。对每只淋洗瓶进行放射性活度检测，取活度最大的一瓶（10mCi）用于标记。

3）PET示踪剂—⁶⁸Ga-DOTA-MAA-FSH_33-53的制备，将20μg步骤1中获得的标记前体，用200μl乙醇溶解，加入40μl的0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=4.0）和100μl（10mCi）新鲜淋洗的⁶⁸Ga溶液，充分混匀后100℃反应10min。冷却，加15ml水稀释后注入C₁₈分离小柱（Varian BOND ELUT C₁₈，100mg1ml），5ml的磷酸盐缓冲液和8ml水冲洗柱子后用300μl乙醇洗脱标记产品，生理盐水稀释后无菌过滤即得靶向FSHR的PET示踪剂。合成时间约20min，用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为6.2mCi，因此计算其标记率（未校正）为61.4±2.0%（n=5）。

采用实施例1中所述分析型HPLC方法测定产品保留时间15.2min，放化纯>95%（图6）。所述PET示踪剂的合成路线如下：

MicroPET显像

取荷人PC-3***癌模型鼠置于小动物PET床板上，异氟烷麻醉模型鼠，经胶带固定。模型鼠经尾静脉注射上述PET示踪剂的生理盐水溶液(1.85MBq,0.2mL)。注射后30分钟、1小时、2小时，分别进行microPET显像，如图7-A所示。图中箭头所示为肿瘤。图中颜色由明到暗表示放射性摄取值由高到低。

采用二维有序子集期望最大化算法进行图像重建。在肿瘤、肌肉、肝等器官用感兴趣区（ROI）法计算放射性活度（MBq/mL），所得值除以注射剂量获得各组织放射性摄取值（%ID/g）（假定组织密度为1g/ml）。计算结果如图7-B所示，靶/非靶比值（T/NT）如图7-C所示。

如图7-A所示，注射上述PET示踪剂后30min到120min,PC-3人***癌移植瘤均清晰可见。从图中可以看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。

所述PET示踪剂在模型鼠的肾中具有显著的浓聚，这表明其主要通过肾代谢。随着时间的延长，所述PET示踪剂在模型鼠体内的浓聚逐渐降低，显示所述PET示踪剂逐渐代谢排出体外，这表明所述PET示踪剂是安全的，不会持久的存于鼠体内，且半衰期较短，不会对模型鼠造成伤害。

如图7-B所示，ROI计算表明，注射后30min，肿瘤对所述PET示踪剂摄取值达最高约2%ID/g，随着时间的变化，摄取值逐渐降低。肾对所述PET示踪剂摄取值显著，证实所述PET示踪剂主要通过肾代谢。此外，如图7-C所示，肿瘤较正常的组织如肌肉对所述PET示踪剂摄取显著，肿瘤与肌肉摄取比值（T/NT）均大于5，这有利于获得高清晰度的肿瘤PET图像，便于肿瘤的诊断和治疗。

特异性实验：

荷人PC-3***癌模型鼠预先注射靶向FSHR多肽化合物（FSH_33-53）（10mg/kg体重）30min后，然后注入所述PET示踪剂1小时后行microPET显像。

由图7-A至图7-C可见，注射后60min，阻断组模型鼠移植瘤对所述PET示踪剂的摄取值较未阻断组显著下降约75%。这是由于未标记的FSH多肽化合物有效抑制肿瘤高表达的FSH受体与所述PET示踪剂的结合，导致肿瘤对所述PET示踪剂的摄取值相应降低。实验证实，所述PET示踪剂具有与FSHR特异性结合的能力。

实施例3

本实施例所述的靶向FSHR的PET示踪剂的连接基为标记辅基¹⁸F-NPFP，对具有SEQ.ID NO：2所示氨基酸序列的多肽化合物进行正电子核素（¹⁸F）标记，具体步骤包括：

1）¹⁸F溶液的制备：加速器生产的¹⁸F经QMA吸附后被1mL冠醚K₂₂₂/K₂CO₃（15mg/3mg）乙腈/水（体积比为9:1）溶液洗脱入反应管，经2次除乙腈。所述的冠醚K₂₂₂（4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二叠氮双环[8.8.8]-二十六烷）购自Sigma公司，采用CRC-15R活度计（CAP INTEC）测定其放射剂量为200mCi。

2）¹⁸F-NPFP的制备：将步骤1）中制备的¹⁸F-溶液加入1mL含5mg的2-溴-丙酸甲酯的乙腈溶液，120℃下反应10分钟后。冷却，加入1mL含50μL的1M四丁基氢氧化铵水溶液，90℃下反应5分钟，后加入2mL乙腈，干燥除水。加入1mL含40mg的二(对硝基苯)碳酸酯的乙腈溶液，90℃下反应10分钟。冷却后，用2mL的5%乙酸乙腈溶液水解，使用实施例1中的制备型HPLC纯化,收集出峰时间为5.0min时的流份，减压浓缩干燥得到2-[¹⁸F]氟丙酸（4-硝基）苯酯（¹⁸F-NPFP）51mCi。

3）PET示踪剂的制备：在上述步骤2）中获得的¹⁸F-NPFP中加入50μL的N,N-二异丙基乙胺（DIEA）和0.1mL含500μg的多肽化合物（FSH_81-95），60℃下反应10分钟,后加入0.5mL的5%乙酸乙腈溶液水解，使用实施例1中制备型HPLC纯化,减压浓缩干燥，生理盐水稀释后无菌过滤即得¹⁸F-NP-FSH_81-95。采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为20.8mCi，因此计算其标记率（未校正）以¹⁸F-NPFP计算为40.5±2.0%（n=5），使用实施例1中HPLC法测定产品保留时间16.5分钟，放化纯度>95%（如图8所示）。所述PET示踪剂，¹⁸F-NP-FSH_81-95，合成路线如下，

MicroPET显像

取荷人PC-3***癌模型鼠置于小动物PET床板上，异氟烷吸入麻醉，经胶带固定。床前经尾静脉注射上述PET示踪剂的生理盐水溶液(1.85MBq,0.2mL)。注射后30分钟、1小时、2小时，分别进行microPET显像，如图9-A所示。图中箭头所示为肿瘤。图中颜色由明到暗表示放射性摄取值由高到低。

采用二维有序子集期望最大化算法进行图像重建。在肿瘤、肌肉、肝等器官用感兴趣区（ROI）法计算放射性活度（MBq/mL），所得值除以注射剂量获得各组织放射性摄取值（%ID/g）（假定组织密度为1g/ml）。计算结果如图9-B所示。靶/非靶比值（T/NT）如图9-C所示。

如图9-A所示，注射上述PET示踪剂后30min到120min,PC-3人***癌移植瘤均清晰可见。从图中可以看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。

所述PET示踪剂在模型鼠的肾中具有显著的浓聚，这表明其主要通过肾代谢。随着时间的延长，所述PET示踪剂在模型鼠体内的浓聚逐渐降低，显示所述PET示踪剂逐渐代谢排出体外，这表明所述PET示踪剂是安全的，不会持久的存于鼠体内，且半衰期较短，不会对模型鼠造成伤害。

如图9-B，注射后30min，肿瘤对所述PET示踪剂摄取值最高约4%ID/g，而随着时间的变化，摄取值逐渐降低。肾对所述PET示踪剂摄取显著，证实所述PET示踪剂主要通过肾代谢。此外，如图9-C所示，肿瘤较正常组织如肌肉对所述PET示踪剂摄取值显著，肿瘤与肌肉摄取比值（T/NT）均大于5，这有利于获得高清晰度的肿瘤PET图像，便于肿瘤的诊断和治疗。

实施例4

本实施例的方法同实施例1，其区别仅在于使用MAA-GA-NODA螯合剂作为连接基，¹⁸F为显像核素。采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为10.4mCi，计算其标记率（未校正）为51.2±3.1%。

实施例5

本实施例的方法同实施例2，其区别仅在于使用p-SCN-Bn-NOTA螯合剂作为连接基，⁶⁸Ga为显像核素。采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为6.3mCi，计算其标记率（未校正）为63.2±3.1%。

实施例6

本实施例的方法同实施例2，其区别仅在于使用DOTA-NHS螯合剂作为连接基，⁶⁸Ga为显像核素。采用CRC-15R活度计（CAPINTEC）测定其放射剂量为6.5mCi，计算其标记率（未校正）为65.2±3.1%。

综上所述，本发明所述的具有***受体靶向性的PET示踪剂的制备方法便捷，标记率（未校正）为40-65%，放化纯大于95%，满足临床需要。

本发明所述的FSHR靶向PET示踪剂可以与体内FSHR高度结合，可以有效将目标位置的FSHR分布情况进行活体显像，为后续肿瘤的诊断及治疗提供了可靠的技术保证。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (18)

1.一种PET示踪剂，其特征在于，通过对具有***受体靶向性的多肽化合物进行正电子显像核素标记得到。

2.根据权利要求1所述的PET示踪剂，其特征在于，所述多肽化合物为***类多肽。

3.根据权利要求1或2所述的PET示踪剂，其特征在于，所述多肽化合物包括SEQ.ID NO：1和/或SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的PET示踪剂，其特征在于，具有如X-N-G所示的结构；其中X为所述正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述多肽化合物。

5.根据权利要求3所述的PET示踪剂，其特征在于，所述双功能螯合剂为与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂。

6.根据权利要求5所述PET示踪剂，其特征在于，所述双功能螯合剂包括MAA-NOTA、MAA-GA-NODA、MAA-DOTA、p-SCN-Bn-NOTA和DOTA-NHS中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述PET示踪剂，其特征在于，具有如Y-G所示的结构；其中Y为正电子显像核素标记辅基，G为所述多肽化合物。

8.根据权利要求7所述PET示踪剂，其特征在于，所述标记辅基为¹⁸F-NPFP。

9.一种用标记辅基制备权利要求7或8所述PET示踪剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：取所述标记辅基与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，分离纯化得到所需的PET示踪剂。

10.一种用双功能螯合剂制备权利要求4-6任一所述PET示踪剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备标记前体：取含有所述双功能螯合剂的缓冲液与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，纯化得到所需的标记前体；（2）制备所述正电子显像核素溶液；（3）将步骤（1）中制备的标记前体与正电子显像核素溶液混合反应，并分离纯化，即得PET示踪剂。

11.根据权利要求10所述的PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述双功能螯合剂与所述多肽化合物的摩尔比例为1:1-10:1。

12.根据权利要求10或11所述的PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述含有双功能螯合剂的缓冲液与所述含有多肽化合物的缓冲液彼此独立的为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐缓冲溶液或二甲亚砜。

13.根据权利要求10-12任一所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中还包括将所述标记前体溶解于乙醇、乙腈或水的步骤。

14.根据权利要求13所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中还包括在所述标记前体中加入AlCl₃溶液和/或酸性溶液的步骤。

15.根据权利要求10-14任一所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）和所述步骤（3）中，所述纯化步骤是采用制备型HPLC法进行的。

16.一种具有FSHR靶向性的多肽化合物用作PET示踪剂的应用。

17.一种权利要求1-8任一所述的PET示踪剂在肿瘤活体监测领域的应用。

18.一种活体监测肿瘤的技术，其特征在于，使用权利要求1-8任一所述的PET示踪剂进行PET扫描以监测活体的FSHR水平。

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