CN110227169A - 一种结构修饰的rgd多肽的核医学药物 - Google Patents

Abstract

一种结构修饰的RGD多肽，由该多肽和放射性核素形成的配合物，以及包含该配合物的药物组合物，所述药物组合物用于诊断或者治疗整合素αvβ3阳性肿瘤。所述配合物具有如下定义：A‑(L)n‑RGD多肽其中A为如下结构：L代表连接臂分子，具有如下结构：其中m为1‑8的整数。

Description

一种结构修饰的RGD多肽的核医学药物

技术领域

本发明涉及一种对肿瘤靶向RGD多肽修饰的核医学药物，尤其涉及结构修饰RGD多肽的诊断或治疗用放射性药物。

背景技术

分子影像是指应用影像学对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。分子探针是分子影像学发展的关键，其对某一特定生物分子(如蛋白质、RNA、DNA)具有特异性靶向的、并能够进行体内或体外示踪的标记化合物分子,这些标记化合物分子能够反映其靶向生物分子的量功能。分子探针根据所用显像手段的不同，可以分为核医学探针、光学探针以及MRI探针等，其中核医学分子探针有着独特的优势。分子探针按照分子量大小分类包括小分子类，多肽类，抗体类，纳米颗粒等类型，分子量的大小会很大程度上影响药物的动力学性质，其中小分子量的肿瘤靶向分子探针展现出了诸多独特的优点，得到了广泛的研究和应用，如靶向整合素αvβ3的RGD类多肽。

恶性肿瘤的持续生长、侵袭、转移依赖于肿瘤血管生成。整合素是参与调控肿瘤血管增生的重要因子之一，对肿瘤血管生成起着重要作用，整合素中以整合素αvβ3的作用最为重要。整合素αvβ3在肿瘤新生血管内皮细胞高度表达，而在正常细胞或成熟血管不表达或低表达。RGD能够特异性结合整合素αvβ3，因此利用RGD和整合素αvβ3的特异性结合而设计出的RGD类分子探针得到广泛的研究与运用。国内外研究者先后通过将线性RGD改造成环状RGD，药代动力学连接剂修饰例如将RGD糖基化，用谷氨酸将RGD环肽单体联接成多聚体、通过化学手段在二聚体中的两个RGD单体之间***Gly3或PEG4链等等多种方法来优化RGD多肽，以得到结构修饰的RGD多肽。

然而，很多环状RGD单体肽放射性标记物，肿瘤摄取低，血清除速率快，肾、肝等器官摄取高，这些都限制了环状单体肽作为显像剂的应用；随着多聚化程度提升，放射性RGD多肽在肾、肝、肺等器官摄取也明显增高，而且，多聚化程度越高合成越复杂，造价越高，这些也是RGD探针多聚化发展的制约因素；单纯多聚化或使用大分子量的药代动力学连接剂对RGD探针进行修饰的优势不再明显。

发明内容

为了改善现有技术存在的上述问题，本发明提供如下式结构修饰的RGD多肽：

A-(L)n-RGD多肽

其中A为如下结构：

L代表连接臂分子，具有如下结构：其中m为1-8的整数，例如2-6，优选5；

所述L通过其羧基与A中的氨基反应键链，例如，通过L中标记为*的羧基与A键链；

n为0或1；

当n为0时，所述RGD多肽通过其氨基与A中的羧基反应键链；

当n为1时，所述RGD多肽通过其氨基与L中的另一羧基反应键链，例如当L中标记为*的羧基与A相连时，标记为**的羧基与RGD多肽反应键链；

RGD多肽为选自以下的RGD多肽：c(RGDfV)、c(RGDfK)，c(RGDfE)，c(RGDyk)、E[c(RGDyk)]₂、E[c(RGDfK)]₂、3PRGD₂。

本发明还提供含有如上结构修饰的RGD多肽的放射性核素标记的配合物，其具有如下定义的结构：

Nu-BFC-A-(L)n-RGD多肽

其中：

Nu为放射性核素，例如诊断显像核素：¹¹¹In、⁶⁴Cu、^99mTc、⁶⁸Ga，或者治疗核素：⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re；BFC为双功能螯合剂(bifunctional chelating agent)，例如HYNIC(联肼尼克酰胺)、MAG₂(巯基乙酰二甘氨酸)、MAG₃(巯基乙酰三甘氨酸)、DTPA(二乙基三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7三羧酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11四乙酸)；

当n为0时，所述双功能螯合剂通过其结构中具有的羧基与A中的-NH₂反应键链；

当n为1时，所述双功能螯合剂通过其结构中具有的羧基与L中的-NH₂反应键链。

根据本发明，如上结构修饰的多肽RGD和配合物中：

RGD多肽选自：c(RGDfK)、3PRGD₂；

Nu选自：⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹¹¹In、⁶⁴Cu、^99mTc；

当Nu为⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu时，BFC选自DTPA、DOTA；当Nu为¹¹¹In、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、^99mTc时，BFC选自HYNIC、MAG₂、MAG₃、DTPA、DOTA、TETA和NOTA。

根据本发明，Nu为⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu，BFC选自DTPA、DOTA；Nu为¹¹¹In时，BFC选自DTPA、DOTA；Nu为⁶⁴Cu时，BFC选自TETA、DOTA；Nu为⁶⁸Ga时，BFC选自NOTA、DOTA；Nu为^99mTc时，BFC选自HTNIC、DTPA、MAG₂、MAG₃；

作为实例，由本发明结构修饰的多肽形成的配合物如下所述：

⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)；

^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂；

¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂。

应当理解，本发明的上述结构修饰的多肽的所有异构体，包括对映异构体、非对映异构体、以及消旋物都属于本发明的范围。本发明包括光学纯形式或混合物的立体异构体，也包括外消旋混合物。例如上述多肽中的结构A或L中的氨基以L-或D-形式存在。

本领域技术人员熟知，如上定义的配合物，当双功能螯合剂作为配体不能占据放射性核素所有配位位置时，还需要协同配体。本发明中需要协同配体的放射性核素和双功能螯合剂是本领域技术人员所熟知的。例如^99mTc以HYNIC作为双功能螯合剂时，作为协同配体，其可以相同或不同，均是现有技术中已知的那些，其中常见的协同配体包括水溶性膦(例如三苯基膦三间磺酸钠盐TPPTS)，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N-二(羟乙基)甘氨酸、葡庚糖酸盐、乙二胺-N,N’-二乙酸酯(EDDA)、3-苯甲酰基吡啶(BP)、吡啶-2-偶氮-p-二甲苯胺(PADA)等。例如，^99mTc以HYNIC作为双功能螯合剂时，TPPTS和Tricine作为协同配体。而例如¹⁷⁷Lu或者⁶⁸Ga以DOTA为双功能螯合剂时，并不需要协同配体完成配位。作为实例，提供如下结构的配合物：

本发明还提供具有上述配合物结构的分子探针。

本发明还提供上述结构修饰的RGD多肽的制备方法，所述方法包括：

任选的步骤(1)：A与L的偶联反应；

步骤(2)：A-(L)n结构部分与RGD多肽的偶联反应。

根据本发明的制备方法，其还包括A的合成步骤，所述步骤包括：

(3)式1：与式2：的偶联反应。

根据本发明的制备方法，步骤(1)、(2)和(3)的偶联反应是本领域熟知的羧基与氨基的酰胺化反应，通常需要先活化其羧基，随后再与氨基反应。例如可先在式1的溶液中，加入N-羟基苯并三氮唑或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成酰胺，该反应可加入缩合剂碳二亚胺，例如DCC(二环己基碳二亚胺)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)，促使酰胺的生成。随后酰胺在缩合剂的存在下，例如EDCI、HOBT、DIEA，和式2反应得到目标物，反应溶剂可以选用二氯甲烷、DMF等。步骤(2)、步骤(1)的反应与步骤(3)相同，也同样是先活化羧基，再成酰胺，因此可在同样条件下反应。

本发明还提供由上述结构修饰的RGD多肽得到的放射性核素配合物的制备方法，所述方法包括：

任选的步骤(1)：A与L的偶联反应；

步骤(2)：A-(L)n结构部分与RGD多肽的偶联反应；

步骤(3)：A-(L)n-RGD多肽与双功能螯合剂的偶联反应；

步骤(4)：用放射性核素标记连接双功能螯合剂的A-(L)n-RGD多肽。

根据本发明，所述配合物的制备方法，还包括A的合成步骤，所述步骤包括：

式1：与式2：的偶联反应。

根据本发明的制备方法，步骤(3)的偶联反应同样是A-(L)n-RGD多肽中的氨基与双功能螯合剂的羧基的酰胺化反应，因此可采用与步骤(1)、(2)相同的反应条件，例如在在缩合剂的存在下，包括EDCI、HOBT、DIEA，使用溶剂二氯甲烷、DMF等。步骤(4)的放射性核素的标记是本领域技术人员所熟知的，例如将放射性核素加入分子探针前体，即连接双功能螯合剂的A-(L)n-RGD多肽的溶液中，加热得到。所述加热温度在80-120℃，反应时间在5-60min。通常在标记结束后纯化和质控所述标记物，例如用已知的Sep-Pak反相色谱柱、Sephadex G-25柱、YMC-Pack ODS-A C18分析柱、Radio-HPLC法等纯化并测定标记率和放射化学纯度。

本发明还提供一种药物组合物，所述组合物包含有效量的上述标记配合物Nu-BFC-A-(L)n-RGD多肽。

根据本发明，当Nu为诊断核素时，本发明的药物组合物是一种诊断药物，例如所述药物作为显像剂，用于整合素αvβ3阳性肿瘤的显像诊断。将其直接施用于个体，通过检测给受试者施用的该化合物所发射的放射线，基于该放射线获得的信息显像来诊断。优选地，本发明的诊断药物是一种可注射制剂，其包含上述标记配合物和可注射的载体。优选所述显像剂是指作为正电子发射断层扫描PET、单光子发射计算机化断层显像SPECT根据本发明，当Nu为治疗核素时，本发明的药物组合物是一种治疗药物，所述药物用于整合素αvβ3阳性肿瘤的放射靶向治疗。将其直接施用于个体，所述药物与整合素αvβ3具有特异性亲和力，富集在肿瘤组织内，放射性核素通过发射纯β-射线或伴有γ射线的β-射线产生电离辐射生物效应破坏病变组织。优选地，本发明的治疗药物是一种可注射制剂，其包含上述标记配合物和可注射的载体。

优选地，本发明的药物组合物是一种静脉注射剂，例如一种无色透明液体针剂。适用于静脉注射剂的辅料是本领域公知的，所述药物组合物可以配置在水溶液中，如果需要，使用生理相容的缓冲剂，包括例如，磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐等，用于调节制剂pH，还可使用张度剂，诸如氯化钠、蔗糖、葡萄糖等，还可使用共溶剂，例如聚乙二醇，低毒性表面活性剂，例如聚山梨酯或泊洛沙姆等。

优选地，本发明的药物组合物还包括抗吸附剂，例如生理盐水，1％环糊精的水溶液，含吐温-20的PBS溶液(如吐温的质量分数为0.01～0.1％)，使用本发明的含有抗吸附剂的药物组合物，使用表面活性剂如吐温-20(质量份数例如0.05％)的溶液，能够有效避免所述标记物在输液中的非特异性吸附，明显防止管壁对放射性标记物的吸附，实现给药剂量的精准化，同时避免了药物在使用过程中的浪费。含有上述抗吸附剂的药物组合物在一系列新的EP管中连续转移4次，标记物的回收率可达97％以上。

本发明还提供上述A-(L)n-RGD多肽或者Nu-BFC-A-(L)n-RGD多肽分子探针在制备药物中的用途。根据本发明，所述药物用于诊断或者治疗整合素αvβ3阳性肿瘤，所述肿瘤是指实体肿瘤，例如在血液、肝、腺体(例如乳腺、***、胰腺)、肠(例如结肠直肠)、肾、胃、脾、肺、肌肉、骨头等部位的恶性肿瘤。

本发明还提供一种诊断或治疗整合素αvβ3高表达的血液***和实体恶性肿瘤的方法，将有效量的上述Nu-BFC-A-(L)n-RGD多肽施用于有此需求的个体。根据本发明，所述个体可以为哺乳动物，如人类。

有益效果

本发明设计和制备了结构修饰的RGD多肽，以及由该结构修饰的RGD多肽制备得到了药代动力学性质改善的系列新型RGD多肽分子探针。本发明发现，所述RGD多肽通过结构修饰和改造，由该结构修饰的RGD多肽通过双功能螯合剂与放射性核素形成的本发明分子探针具有较高的体内外稳定性、与白蛋白(albumin)的结合率，从而明显延长了半衰期；本发明的分子探针具有较高的肿瘤摄取率、对比度、安全性，降低了使用剂量，减少了副作用，从而改善了RGD系列探针作为显像诊断分子探针在SPECT和/或PET中的显像效果，以及作为治疗分子探针进行放射性靶向性治疗的效果。

本发明新型分子探针的一个实例¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂，在血液中具有较高摄取，从而提高了在肿瘤中的摄取，其在血液中的累计摄取量可达原探针的8倍左右在肿瘤中的累积摄取量为原探针的4

倍左右。其在注射后4小时，肿瘤摄取达到最高，其百分注射剂量率为26.52±0.58％ID/g，注射后48小时后仍能清晰显像。这一性质明显提高了RGD系列探针作为显像诊断分子探针的显像效果，

以及作为治疗分子探针进行放射性靶向性治疗的效果。

术语定义和说明

除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。

RGD多肽：均为本领域已知物质。RGD是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)氨基酸序列的小分子多肽。加入D型苯丙氨酸和缬氨酸，合成了RGD环五肽结构-c(RGDfV)，其中c代表该多肽为环形、R代表精氨酸、G代表甘氨酸、D代表天冬氨酸、f代表D-苯甘氨酸、V代表缬氨酸。环五肽结构-c(RGDfV)的5位氨基酸被其他氨基酸取代后得c(RGDfK)，c(RGDfE)，c(RGDyk)，其中K为赖氨酸、E为谷氨酸、y为D-酪氨酸。例如c(RGDfK)具有如下结构：

这些环肽结构可形成二聚体，例如E[c(RGDyk)]₂、E[c(RGDfK)]₂，用谷氨酸将两个RGD环肽连接形成二聚体。3PRGD₂是指含有三个聚乙二醇修饰的RGD五环肽二聚体，即PEG₄-[PEG₄-c(RGDXk)]₂，X为D-苯甘氨酸、D-酪氨酸等。示例性的，其结构示意图如下：

双功能螯合剂：双功能螯合剂(bifunctional chelator BFC)是指既能与生物分子共价连接又能鳌合金属核素，其结构能保证与金属核素的牢固结合，且引入的金属核素远离生物分子以保证其生物活性不受损失，形成一个稳定的核素-螯合剂-生物分子标记物的这一类功能有机材料。本发明用到的双功能螯合剂是本领域现有技术中已知的那些，例如HYNIC(联肼尼克酰胺)、MAG₂(巯基乙酰二甘氨酸)、MAG₃(巯基乙酰三甘氨酸)、DTPA(二乙基三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7三羧酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11四乙酸)等。

本文所用的术语“治疗”和其它类似的同义词包括缓解、减轻或改善疾病或病症症状，预防其它症状，改善或预防导致症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，使疾病或病症好转，缓解由疾病或病症导致的症状，或者中止疾病或病症的症状，此外，该术语包含预防的目的。该术语还包括获得治疗效果和/或预防效果。所述治疗效果是指治愈或改善所治疗的潜在疾病。此外，对与潜在疾病相关的一种或多种生理症状的治愈或改善也是治疗效果，例如尽管患者可能仍然受到潜在疾病的影响，但观察到患者情况改善。就预防效果而言，可向具有患特定疾病风险的患者施用所述组合物，或者即便尚未做出疾病诊断，但向出现该疾病的一个或多个生理症状的患者施用所述组合物。

附图说明

附图1：实施例1终产物⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)的放射性HPLC图；图1a为纯化前，图1b为纯化后；

附图2：实施例1的分子探针和对照探针在荷LLCC57BL/6J鼠体内生物分布结果；

附图3：实施例3终产物^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂的标记率测定图；

附图4：实施例3的血清除实验结果图；

附图5：实施例3的荷U87MG裸鼠SPECT/CT显像图；

附图6：附图A\B\C\D分别为实施例12的SPECT/CT显像结果的本发明分子探针与对照探针的在U87肿瘤的％ID/g、肿瘤/肾脏，肿瘤/肌肉，肿瘤/肝脏的比值比较图；

附图7：实施例3的分子探针在荷U87MG裸鼠体内分布结果图；

附图8：实施例7的终产物¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的放射性HPLC图；

附图9：实施例7的分子探针血清除实验结果图；

附图10：实施例7的分子探针荷U87MG裸鼠SPECT/CT显像图；

附图11：实施例7的分子探针在U87鼠体内生物分布图；

附图12：实施例7的分子探针放射性治疗的肿瘤体积随时间变化的趋势图；

附图13：实施例7的分子探针在MC-38小鼠模型中的生物分布、MC-38裸鼠SPECT/CT显像图和在MC-38小鼠模型中放射性治疗的肿瘤体积随时间变化的趋势图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

统计学分析

实验结果以平均值±标准偏差(mean±SD)的形式进行表示。组间的差异采用方差分析和t检验对结果进行统计学分析。P<0.05，认为具有统计学差异(*)。

实施例1 ⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)的制备

DOTA-A-c(RGDfk)的合成路线图如下：

(1)化合物1的合成

称取4-(4-碘苯基)丁酸(9.8mg，33.8mmol)加入单口瓶，溶解于400μL DMF中，加入NHS(3.9mg，33.9mmol)。再加入5.3μL DIC。30℃恒温搅拌反应2h，TLC(乙酸乙酯：石油醚：乙酸＝100:200:2)监测至原料消失。待反应结束，将反应液溶于乙酸乙酯，用水洗三次，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚：乙酸＝100:200:2)，收集馏分检测，将收集的产品旋干得到白色固体10.2mg，产率78％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MS(ESI)：m/z＝387.2137(化学式：C₁₄H₁₄INO₄，计算分子量387.00)。取少量固体重新溶解后，经HPLC纯度鉴定纯度＞98％。

(2)化合物2的合成

取化合物1(20mg，51.7mmol)加入装有500μL DMF的圆底烧瓶中溶解，再取Fmoc-D-Lys.HCL(22.8mg，56.3mmol)加入烧瓶，.加入12μL DIEA调节pH＝8.5。30℃恒温搅拌反应0.5h，TLC(乙酸乙酯：石油醚：乙酸＝100:200:1)监测至原料消失。反应结束后，将反应液溶于20mL乙酸乙酯，分别用20mL饱和氯化钠溶液、20mL水洗3次。乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，减压旋蒸至干，得到黄色粘液26.5mg。产率85％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z＝1718.33(M+H)⁺，1741.02(M+Na)⁺(化学式：C₈₀H₁₁₉N₂₅O₁₆S,计算分子量：1719.02Da.)。取少量产物重新溶解后，利用HPLC进行分析，纯度96.7％。

(3)化合物3的合成

称取化合物2(10mg，15.6mmol)加入单口瓶，溶解于500μL DMF中，再加入NHS(1.83mg，15.9mmol)，再向单口瓶中加入DIC 4μL。35℃下搅拌反应35分钟。加热5min时，发现悬浊液变清。TLC(乙酸乙酯：石油醚：乙酸＝100:200:1)监测至原料消失。反应结束后，将反应液溶于20mL乙酸乙酯，分别用20mL饱和氯化钠溶液、20mL水洗3次。乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，浓缩后层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)，收集馏分检测，将收集的产品旋干减压旋蒸至干，得到白色固体8.02mg，产率70％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z＝760.2(M+Na)⁺(化学式：C₃₅H₃₆IN₃O₇,计算分子量：737.16)。

(4)化合物4的合成

取化合物3(11.5mg，15.6mmol)于1mL EP管中，溶解于500μL DMF，加入c(RGDfk)(9.4mg，15.6mmol)，再加入DIEA调节pH＝8.5，30℃反应2小时。使用HPLC监测反应。HPLC(高效液相色谱)方法一：使用安捷伦1100系列HPLC***配备YMC-Pack ODS-A C18半制备柱(10mm×250mm,poresize,颗粒大小为5μm)，梯度淋洗25分钟，流速1mL/min，其中流动相A为H₂O溶液，B为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度设定为起始时100％A和0％B，20分钟时0％A和100％B，25分钟时100％A和0％B。产物在14.854min时出峰。

(5)化合物5的合成

向前一步反应EP管中加入125μL哌啶，脱去Fmoc保护基，向反应体系中加入500μL***高速离心沉淀，弃去***，得到产物为白色固体，约为9.55mg，产率为61％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z[C43H62IN11O9]⁺(M+H)⁺，1004.38；实测值1004.88。取少量固体溶解后，HPLC鉴定纯度为94.4％。

(6)化合物6的合成

称取化合物5(5mg，4.98mmol)，DOTA-NHS-ester 3.79mg溶于400μL DMF。加入DIEA调节pH＝8.5，30℃震荡反应30min。半制备HPLC分离纯化，HPLC(高效液相色谱)方法二：使用安捷伦1100系列HPLC***配备YMC-Pack ODS-A C18半制备柱(10mm×250mm,poresize,颗粒大小为5μm)，梯度淋洗25分钟，流速1mL/min，其中流动相A为H₂O溶液，B为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度设定为起始时80％A和20％B，20分钟时50％A和50％B，25分钟时80％A和20％B。收集保留时间为15.7分钟时的馏分，合并收集液并冻干，得到白色粉末3.2mg。产率为46.3％，纯度>95％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z[C55H80IN15O16]⁺(M+H)⁺，1390.50；实测值1390.7040。HPLC鉴定纯度为98％。

(7)⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)的制备、纯化与质控

准确称取定量DOTA-A-c(RGDfk)，用水重新溶解后，装成20μg/管，置于-80℃冰箱保存。待放射性标记时，取出已经分装好的化合物，室温融化30分钟。

制备：利用0.05M HCl淋洗⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器，得到12.4mCi(469.9MBq)⁶⁸Ga液。取500μL ⁶⁸Ga淋洗液，置于洁净EP管中，加入1.25M NaOAc溶液12μL，调节pH值至4.0。将此⁶⁸Ga液(4.0mCi，148MBq)加入至装有多肽EP管中。金属浴加热至100℃，反应10分钟。

纯化：用Sep-Pak C-18小柱进行纯化，首先用10mL无水乙醇活化Sep-Pak C-18柱，紧接着用10mLH₂O洗柱。将放射性样品通过Sep-Pak C-18柱，用10mL的生理盐水洗柱，移去游离的⁶⁸Ga，最后用0.4mL 80％的乙醇洗柱，收集放射性标记物。过0.22μm微孔滤膜除菌，用于后期的体内实验。

质控：放射性探针室温放置10分钟后，利用放射性HPLC监测纯度。采用放射性HPLC方法测定标记率和放射化学纯度。使用HPLC***，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6mm x 250mm,pore size)，梯度淋洗30分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为H₂O溶液，B为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度设定为起始时100％A和0％B，5分钟时95％A和5％B，30分钟时78％A和22％B，30-35分钟回到基线梯度100％A和0％B。

在进行标记前，水和所用的缓冲液都用Chelex 100column处理，去除金属离子。⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)用一步法标记，制备过程简单快速，标记率在85％，经C-18Sep-Pak柱纯化后，标记物的放化纯均大于99％。经校正计算后，标记物产率在80％，见图1。

实施例2：实施例1的分子探针体内生物分布实验

取荷瘤C57BL/6J小鼠36只，随机分为9组，每组4只。其中四组尾静脉各注射0.1mL⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)(约1.85MBq)，四组尾静脉注射⁶⁸Ga-DOTA-c(RGDfk)(约1.85MBq)，分别于0.5h、1h、2h、4h取血后处死，解剖取心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、骨、肉、瘤。测质量和放射性计数，称重并测量放射性cpm计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量(％ID/g)。剩余一组尾静脉同时注射0.1mL ⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)和0.05mL c(RGDfk)溶液(0.5mg)，一小时后处死，取器官称重并测量放射性cpm计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量(％ID/g)。

注射⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)0.5h后在血液里摄取达到了33.32±5.49％ID/g，肿瘤摄取在7.52±0.99％ID/g，而与之对比，⁶⁸Ga-DOTA-c(RGDfk)0.5h后血液摄取值在1.49±0.49％ID/g，在肿瘤内的摄取值为2.74±0.73％ID/g。在随后的时间点里，⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)肿瘤摄取始终高于⁶⁸Ga-DOTA-c(RGDfk)，注射4h后⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)肿瘤摄取值为6.57±0.89％ID/g，是⁶⁸Ga-DOTA-c(RGDfk)的3.5倍，说明，新型探针能有效地和血清蛋白结合，提高探针的血液半衰期，有效提高了肿瘤摄取值(P<0.01，n＝4)。该探针经肾脏代谢。生物分布数据见图2。

实施例3：^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂的制备

HYNIC-A-3PRGD₂合成路线示意图如下：

R＝3PRGD₂

(1)化合物1、2、3的合成

化合物的合成方法参考实施例1。

(2)化合物7的合成

称取化合物3(5.64mg，7.65mmol)于1mL EP管中，溶解于500μL DMF，加入3PRGD₂(15.75mg，7.8mmol)，再加入DIEA调节pH＝8.5，室温反应过夜。使用HPLC监测反应。采用HPLC(高效液相色谱)方法一，产物在13.17min时出峰。HPLC收集，经质谱鉴定，确定为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z＝2680.89(化学式：C₁₂₃H₁₈₁IN₂₄O₃₅,计算分子量：2681.22Da.)。

(3)化合物8的合成

向前一步反应EP管中加入125μL哌啶，脱去Fmoc保护基，再向反应体系中加入500μL***高速离心沉淀，弃去***，得到产物为白色固体，约为10.6mg，产率为56％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z＝2460.85(M+H)⁺，2482.87(M+Na)⁺(化学式：C₁₀₈H₁₇₁IN₂₄O₃₃,计算分子量：2459.15Da.)。

取少量固体重新溶解后，利用HPLC进行纯度分析，纯度92.5％。

(4)化合物9的合成

称取化合物8(5mg，2.03mmol)，SBZH-HYNIC 0.9mg溶于500μL DMF中。加入DIEA调节pH＝8.5，30℃震荡反应10分钟。半制备HPLC分离纯化，HPLC(高效液相色谱)方法三：使用安捷伦1100系列HPLC***配备YMC-Pack ODS-A C18半制备柱(10mm×250mm,poresize,颗粒大小为5μm)，梯度淋洗30分钟，流速1mL/min，其中流动相A为H₂O溶液，B为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度设定为起始时100％A和0％B，5分钟时75％A和25％B，25分钟时50％A和50％B，25-30分钟返回基线梯度100％A和0％B。收集保留时间为15.2分钟时的馏分，合并收集液并冻干，得到白色粉末1.95mg。产率为34.8％，纯度>95％。经MALDI-TOF质谱分析确认为预期产物。

MALDI-TOF-MS：m/z＝2763.07(M+H)⁺，2785.21(M+Na)⁺(化学式：C₁₂₁H₁₈₀IN₂₇O₃₇S,计算分子量：2762.18Da.)。

取少量固体溶解后经HPLC分析，纯度大于99％。

(5)^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂的制备与质控

在EP管中依次加入20μL HYNIC-A-3PRGD₂(1mg/mL溶于纯水)，100μL tricine溶液(100mg/mL溶于25mM琥珀酸盐缓冲液,pH 5.0),100μL TPPTS(60mg/mL溶于25mM琥珀酸盐缓冲液,pH 5.0)，100μL Na^99mTcO₄(10mCi)。混匀后，置100℃水浴加热25min。标记产物冷却后，用HPLC(HP1100高效液相色谱，配有LB-509放射性检测器)分析其标记率和放射化学纯度。

^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂采用非SnCl₂一步法制备。放射性HPLC对标记物进行分析，^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂保留时间为11.8min，测得的标记率＞99％。如图3所示。

实施例4：实施例3的分子探针血清除实验

取14只昆明雌性4-5周龄小白鼠，随机分为两组，每一组分别注射0.1mL^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂，^99mTc-HYNIC-3PRGD₂(约1.85MBq)，注射后分别于1min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、30min、60min、90min、120min取血，测量放射性cpm计数，经衰变校正后计算两种探针在血液里的百分注射剂量(％ID/g)。

通过血清除实验，我们可以看到结构改造后的3PRGD₂探针，其体内性质和原探针相比发生了明显改变。^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂的药物快速半衰期为4.57min；慢速半衰期为93.32min。而^99mTc-HYNIC-3PRGD₂(未结构修饰)的药物快速半衰期为0.72min；慢速半衰期为17.91min。药物快速半衰期提高了6.3倍，慢速半衰期提高了5.2倍。注射1min，未修饰的分子探针血液摄取值为17.07±11.77％ID/g，而^99mTc-HYNIC-A-3PRGD2摄取为44.76±11.83％ID/g，是前者的约2.6倍。在5min时前者摄取值只有4.39±2.55％ID/g，而后者即本发明分子探针摄取为33.63±7.83％ID/g，是前者的7.6倍。10min时，前者摄取1.99±1.54％ID/g，而后者摄取为19.06±6.51％ID/g。前者摄取在60min后，降到0.5％ID/g以下，在240min时，，摄取值为0.34±0.18％ID/g；与之对比，后者的摄取为2.81±0.83％ID/g，是原探针的8倍。可见，结构修饰极大的延长了3PRGD₂的血液滞留时间(P<0.01，n＝7)，这样就有利于增加探针在肿瘤部位的摄取值。血清除结果见图4。

实施例5：实施例3的分子探针荷瘤裸鼠SPECT/CT显像

^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂(下称本发明分子探针)按1.2.3法制备。同时按照3PRGD₂标记方法进行^99mTc-HYNIC-3PRGD₂(下称对照探针)的制备。进行放射性HPLC检测后，用生理盐水分别稀释至2mCi/100μL，取荷U87MG瘤裸鼠分别进行静脉注射，每只小鼠经由尾静脉注射100μL的^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂。该药物在荷瘤鼠各组织和器官中的特异性摄取通过封闭实验进行验证，封闭组小鼠通过尾静脉注射100μL的1mg 3PRGD₂冷肽，并立即注射100μL的^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂同时每种药取50μCi进行定量。分别在0.5、1、2、4、8、12、24h进行SPECT/CT图像采集，结果见图5荷U87MG裸鼠SPECT/CT显像图。

图6A为^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂和^99mTc-HYNIC-3PRGD₂在U87肿瘤的％ID/g；6B、6C、6D分别为^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂和^99mTc-HYNIC-3PRGD₂肿瘤/肾脏，肿瘤/肌肉，肿瘤/肝脏的比值比较。结果表示为means±SD,(n＝3)。

我们发现新探针在各个采集时间点，肿瘤都能很好的成像，甚至是在注射24小时后。这与改造后探针有更长的血液滞留时间，进而增强了肿瘤摄取有关。如图6A定量分析所示，本发明分子探针在肿瘤处的清除很缓慢，在注射后0.5、8、24h分别为11.85±2.18％ID/g，21.17±0.49％ID/g和22.27±1.64％ID/g。如图6B所示，与对照探针相比，修饰后的新探针瘤/肾比得到提高，注射后1h，对照探针瘤肾比为1.14±0.26,注射后24h为1.21±0.17；而本发明分子探针相应摄取分别为1.57±0.26.,1.92±0.17。改造后3PRGD₂的瘤/非瘤比也得到了改善，如图6C、6D所示。这表明，改造后的分子探针与改造前相比，有着更好的生物分布特性、药代动力学特性。

实施例6：实施例3的分子探针生物分布

将24只荷U87裸鼠随机分成6组，每组4只，按照1h、2h、4h、8h、12h设置时间点。每组裸鼠分别经尾静脉注射20μCi的^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂，一组注射3PRGD₂用作Block组。并于注射后将动物处死，取血液及主要脏器，称重并测量放射性cpm计数。经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率(％ID/g)。

生物分布标样制备：以注射器将100μL用于生物分布实验的标记物溶液加入100mL容量瓶中，加水定容到100mL，充分混匀，以移液器准确取出1mL用γ计数器测量放射性计数，此计数放大100倍，作为标准注射剂量，制备三个平行样，取平均值。

如图7所示，尾静脉注射^99mTc--HYNIC-A-3PRGD₂后，随着时间的延长，显像剂在U87肿瘤中的摄取先升后降，其在1h、2h、4h、8h四个时间点的肿瘤中的摄取分别为(22.38±3.68％ID/g，21.71±3.61％ID/g，25.96±1.69％ID/g，23.53±3.40％ID/g)。摄取最高的器官是肾脏，一直在30％ID/g以上，所以放射性探针应该是经过肾脏代谢，这和SPECT/CT显像结果是一致的。注射后其余各器官摄取也都较对照探针高，原因在于本发明的多肽结构修饰使其随血液在体内循环时间更久，这样，各器官的摄取值都会有所提高。

实施例7：¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的制备

(1)化合物2的制备同实施例1

(2)化合物11的制备

称取100.0mg(250μmol)化合物10，76.4mg(400μmol)EDC.HCL和46.0mg(400μmol)NHS溶解于5mL二氯甲烷，室温搅拌过夜。混合物通过硅胶层析进行分离和纯化，洗脱液为含有2％甲醇的二氯甲烷。减压蒸馏除去溶剂，得白色粉末状固体85.2mg。HPLC梯度和时间方法为：0分钟50％流动相A和50％流动相B；25分钟时10％流动相A和90％流动相B；30分钟时50％流动相A和50％流动相B。取少量产物用HPLC检验纯度(保留时间为17.7分钟)，然后用MALDI-TOF质谱鉴定。

(3)化合物12的制备

称取85.2mg(147μmol)Fmoc-Cys(tBu)-NHS化合物11，61.0mg(145μmol)化合物2，加入400μLDMF和20μL DIEA，水浴超声形成悬液。加入400μL纯水使溶液中的固体完全溶解，室温搅拌过夜。混合物经HPLC方法进行分离和纯化，收集保留时间为20.9分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟50％流动相A和50％流动相B；25分钟时10％流动相A和90％流动相B；30分钟时50％流动相A和50％流动相B。冷冻干燥，得白色粉末状固体67.2mg。取少量产物用HPLC方法验证纯度，然后用MALDI-TOF质谱鉴定。

(4)化合物13的制备

称取67.2mg(84.1μmol)化合物12，加入20％哌啶-DMF溶解后室温反应10分钟。混合物经HPLC方法进行分离纯化，收集保留时间为24.1分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟85％流动相A和15％流动相B；25分钟时45％流动相A和55％流动相B；30分钟时85％流动相A和15％流动相B。冷冻干燥，得白色粉末状固体27.8mg。取少量产物用HPLC方法验证纯度，然后用MALDI-TOF质谱鉴定。

(5)化合物14的制备

称取10.0mg(12.5μmol)化合物13，10mg(13.1μmol)DOTA-NHS溶于200μL DMF。加入10μLDIEA，将不溶物超声打散成悬液。加入200μL纯水使溶液中的固体完全溶解，室温搅拌过夜。混合物通过HPLC方法进行分离纯化，收集保留时间为21.7分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟85％流动相A和15％流动相B；25分钟时45％流动相A和55％流动相B；30分钟时85％流动相A和15％流动相B。冷冻干燥，得白色粉末状固体8.5mg。产物用HPLC方法验证纯度，然后用MALDI-TOF质谱鉴定。

(6)化合物15的制备

称取8.5mg(8.8μmol)化合物14，加入200μL 20％TFMSA-TFA反应30秒，立即加入400μL DMF防止产物酸解。混合物经HPLC方法进行分离纯化，收集保留时间为26.6和26.9分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟85％流动相A和15％流动相B；25分钟时45％流动相A和55％流动相B；30分钟时85％流动相A和15％流动相B。冷冻干燥，得白色粉末状固体1.2mg。产物用HPLC方法验证纯度，然后用MALDI-TOF质谱对其进行鉴定。

(7)MAL-3PRGD₂(L7)的制备

称取10mg(4.8μmol)3PRGD2，2.0mg(6.5μmol)Mal-NHS，加入200μLDMF和10μLDIEA。混合液在室温下搅拌过夜。混合物经HPLC方法进行分离纯化，收集保留时间为22.1分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟90％流动相A和10％流动相B；25分钟时60％流动相A和40％流动相B；30分钟时90％流动相A和10％流动相B。冷冻干燥，得白色粉末状固体6.7mg。取少量产物用HPLC方法验证纯度，然后用MALDI-TOF质谱对其进行鉴定。

(8)化合物16的制备

称取0.7mg(0.8μmol)化合物15，加入1.8mg(0.8μmol)MAL-3PRGD2，加入0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)，室温震荡反应过夜。产物经HPLC方法进行分离纯化，收集保留时间为25.6分钟的洗脱峰。HPLC梯度和时间方法为：0分钟90％流动相A和10％流动相B；25分钟时60％流动相A和40％流动相B；30分钟时90％流动相A和10％流动相B。合并产物峰洗脱液进行冷冻干燥，得白色粉末状固体1.2mg。取少量产物用HPLC检测纯度，然后用MALDI-TOF质谱鉴定。HPLC分析产物纯度>98％，MALDI-TOF质谱结果显示m/z＝3160.84。实验结果表明[M+H]+与C137H215IN30O45S的理论分子量M＝3161.36相符。

(9)¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的制备、纯化与质控

称取20μg化合物16、DOTA-3PRGD₂或DOTA-A-L，然后加入200μL醋酸铵缓冲液(0.1M，pH＝4.8)和5～25mCi 177LuCl₃。将混合液置于99℃空气浴加热器中反应20分钟，自然冷却后即得。为了防止标记物发生辐射自分解，加入200μL龙胆酸水溶液(1mg/mL)。标记物能够保持6小时以上的室温放置稳定性。

¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD2、¹⁷⁷Lu-3PRGD2和¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L的放射化学纯度(RCP)检测使用带有放射性检测器的Agilent HPLC-1260Infinity液相色谱***和Agilent ZORBAXExtend-C18(250x 4.6mm，5um)色谱柱(250x 10mm，5μm)，流速为1mL/min。流动相A为水(含0.05％TFA)，流动相B为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度和时间方法为：0～5分钟90％流动相A和10％流动相B；25分钟时60％流动相A和40％流动相B；30分钟时90％流动相A和10％流动相B。

所述终产物¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的放射性HPLC图见图8

实施例8：实施例7的分子探针血液分布

取10只昆明小白鼠，分为两组，分别注射0.1mL，取15只昆明小鼠随机分为三组(n＝5)，通过尾静脉注射100μL(740KBq)的本发明实施例14的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂，以及作为对照的¹⁷⁷Lu-3PRGD2或¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L。小鼠注射后按时间点从内眦取适量血液，称重并测量放射性计数cpm。计算放射性药物在血液中的每克组织的百分注射剂量率(％ID/g)。实验结果用GraphPad Prism 7.0软件进行非线性回归分析，计算血液代谢双室模型(Twophase decay)中的快速半衰期和慢速半衰期。

根据实验结果，结果见图9：¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的快速半衰期和慢速半衰期分别为6.909min和77.15min，而¹⁷⁷Lu--3PRGD₂的快速半衰期和慢速半衰期分别为1.231min和20.83min，可见本发明的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂与¹⁷⁷Lu--3PRGD₂相比，血液滞留时间有着明显延长，证明本发明对多肽的结构修饰确实能延长c(RGDfk)在血液里的滞留时间。这说明本发明改造后的RGD探针与MSA结合能力强，探针能随着血液在体内循环更长时间，使血液里的放射性探针浓度增加所致。探针在血液的每克组织的百分注射剂量率与时间的积分(曲线下面积，AUC)能够表示药物在血液中的作用效果。¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂、¹⁷⁷Lu--3PRGD₂在给药后0～72小时的AUC(％ID/g-h)值依次为208.9、27.0。实验结果表明，本发明新型¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂具有比¹⁷⁷Lu--3PRGD₂高7.7倍的血液药代动力学。虽然¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L在血液内的最慢慢速半衰期比本发明的分子探针还要长，但其作为分子探针的其他性质，例如在肿瘤中的滞留和摄取要比本发明的分子探针差很多，具体参见下述实施例。

实施例9：实施例7的分子探针荷瘤裸鼠SPECT/CT显像

SPECT/CT显像***(Mediso公司)具有4个探头及平行孔准直器。U87-MG荷瘤鼠经尾静脉注射100μL(20MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂、¹⁷⁷Lu-3PRGD₂或¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L。然后注射后1、4、8、12、24、48和72小时进行SPECT显像。小鼠在显像过程中使用1.5％异氟烷-氧气进行麻醉，保持其在小动物床上的俯卧位的固定。封闭组小鼠在注射标记物的同时，混入了1.0mg的冷肽。将SPECT图像与CT图像融合，然后在3D显像图中勾勒出SPECT图像中的感兴趣区域(ROI)，计算组织和器官的每克组织的百分注射剂量率(％ID/cc)。显像及定量结果包括物理半衰期和生物半衰期，不进行衰变矫正。结果见图10。

我们发现本发明的探针¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂具有适当的药代动力学，在肿瘤中具有高肿瘤摄取和肿瘤对比度，更重要的是，其在肿瘤中的摄取始终显著高于全身其他正常组织和器官。荷瘤鼠注射后1～72小时的肿瘤定量结果表明，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂在肿瘤中的累计摄取值为662.0ID/cc-h；¹⁷⁷Lu-3PRGD₂在肿瘤中的累计摄取值为158.7ID/cc-h；¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L在肿瘤中的累计摄取值为266.3ID/cc-h。¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂在各个采集时间点，肿瘤都能很好的成像，甚至是在注射48小时后肿瘤处成像清晰，而对照探针本底高、对比度低，在肿瘤处富集少。如图10定量分析所示，本发明分子探针在肿瘤处的摄取值最高、清除很缓慢，荷瘤鼠给药后4小时，肿瘤摄取达到最高，其百分注射剂量率为26.52±0.58％ID/g。这表明，本发明的分子探针与改造前相比，有着更好的生物分布特性、药代动力学特性。

实施例10：实施例7的分子探针体内生物分布实验

取16只U87-MG荷瘤鼠，经尾静脉注射100μL(0.74MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂。注射后1、4、24和72小时处死小鼠(n＝4)；取4只荷瘤小鼠，通过尾静脉注射100μL混有740KBq的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂和0.5mg的3PRGD₂冷肽，注射后1小时处死小鼠；取12只荷瘤小鼠随机分成3组(n＝4)，经尾静脉注射100μL(0.74MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂、¹⁷⁷Lu-3PRGD2或¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L，注射后4小时处死小鼠。取血液和其他主要组织和器官，称重并测量其放射性计数(cpm)，计算每克组织的百分注射剂量率(％ID/g)。

如图11a所示，注射后4小时，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的肿瘤摄取值为26.52±0.58％ID/g，177Lu-3PRGD2的肿瘤摄取值为4.91±0.92％ID/g，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L的肿瘤摄取值为4.80±1.19％ID/g。177Lu-k428-3PRGD2在肿瘤中的摄取显著高于177Lu-3PRGD2(P<0.0001)和177Lu-k428(P<0.0001)。

如图b所示，荷瘤鼠给药后1、4、24和72小时的肿瘤摄取值分别为19.93±1.99％ID/g，28.57±5.27％ID/g，11.67±2.80％ID/g和2.66±1.14％ID/g。除肿瘤之外，该探针在肾脏中的摄取最高，放射性探针应该是经过肾脏代谢，这和SPECT/CT显像结果是一致的。在4小时，肿瘤/肾脏比为2倍以上(28.57/13.70％ID/g)。

如图c所示，封闭组给药后1小时的肿瘤摄取值为6.41±1.52％ID/g，正常组给药后1小时的肿瘤摄取值为19.93±1.98％ID/g。实验结果表明，封闭组的肿瘤摄取显著低于未封闭组(P<0.005)，177Lu-k428-3PRGD2在U87-MG肿瘤中的摄取具有特异性。

实施例11：实施例7的分子探针的放射性靶向治疗

取35只U87-MG荷瘤小鼠随机分成5组(n＝7)：第1组小鼠通过尾静脉注射100μL(18MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂，第2组小鼠通过尾静脉注射100μL(18MBq)的¹⁷⁷Lu--3PRGD₂，第3组小鼠通过尾静脉注射100μL(18MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L；第4组小鼠通过尾静脉注射100μL(9MBq)的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂，第5组荷瘤小鼠注射100μL的PBS作为对照。注射后每2天监测肿瘤体积和体重变化，肿瘤体积达到1000mm³设定为仁慈终点。

结果参见附图12。图A和图C为本发明的分子探针¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂与对照组¹⁷⁷Lu--3PRGD₂、¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L在相同剂量(18Mbq)时、以及本发明分子探针在减半剂量(9Mbq)时的肿瘤体积随时间变化的趋势图。

给药14天后肿瘤体积为：18MBq¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂治疗组的肿瘤体积为401.3±195.5mm3，9MBq ¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L治疗组的肿瘤体积为691.3±195.9mm3，18MBq¹⁷⁷Lu--3PRGD₂治疗组的肿瘤体积为1122.4±189.6mm3，18MBq ¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L治疗组的肿瘤体积为897.4±178.0mm3，PBS对照组的肿瘤体积为1336.3±315.4mm3。治疗实验结果表明，在注射剂量为18MBq的条件下，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂治疗组的治疗效果显著优于¹⁷⁷Lu-3PRGD₂治疗组(p<0.0001)和¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L治疗组(p<0.05)。在治疗过程中，以上三组小鼠的体重变化及生存指标均处于正常范围。同时注射三种探针的小鼠体重变化比例均在正常范围之内，没有出现显著的急毒性。更重要的是，减少¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂的给药剂量至9MBq，其治疗效果仍然显著高于双倍剂量的¹⁷⁷Lu-3PRGD₂(p<0.01)。实验结果表明，与传统¹⁷⁷Lu-3PRGD₂相比，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂具有更好的治疗效果。实验证明，¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂在U87-MG荷瘤鼠中的靶向核素治疗后能够显著抑制注射后10天内的肿瘤生长。治疗组和对照组第10天的初始体积比(V/V0)为1.4和8.0。

图B为本发明的分子探针¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂与对照组¹⁷⁷Lu--3PRGD₂、¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L在相同剂量(18Mbq)时、以及本发明分子探针在减半剂量(9Mbq)时的小鼠体重随时间变化的趋势图。实验结果表明，BALB/c裸鼠对18MBq给药剂量的¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂耐受，给药组的小鼠体重和血常规指标下降后恢复正常。18MBq剂量给药后的小鼠在第6天的体重下降比例最大，并在给药后第14天恢复正常。第6天给药组和对照组的初始体重百分数为90.8±3.7％和98.7±5.0％；第14天给药组的初始体重百分数为100.5±4.1％和100.7±3.4％。与对照组相比，本发明的分子探针在14天期间，小鼠体重变化不明显，可见本发明的分子探针副作用较小，安全性高。

实施例12：实施例7的分子探针在MC-38小鼠模型中的试验

(1)实施例7的分子探针体内生物分布实验

结果参见图13A。本发明的分子探针在1、4、24、72小时的分布情况。从结果可知，本发明的分子探针随着时间的延长，显像剂在MC-38肿瘤中的摄取先升后降，其在4小时达到最高摄取量，其百分注射剂量率为32.51±4.95％ID/g。，且为所有器官中最高。可见，本发明的分子探针具有很高的肿瘤/其它器官的摄取比。

(2)实施例7的分子探针MC-38裸鼠SPECT/CT显像

结果参见图13B。本发明的探针在1、4、24小时采集时间点，肿瘤都能很好的成像，肿瘤处成像清晰、几乎无本底、对比度高。这表明，本发明的分子探针与改造前相比，有着更好的生物分布特性、药代动力学特性。

(3)注射实施例7的分子探针后，肿瘤体积和小鼠体重变化

结果参见图13C和13D。图13C为本发明的分子探针¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂在剂量18Mbq、9Mbq时，肿瘤尺寸随时间变化的趋势图。由图可见，本发明的分子探针在18Mbq剂量时，第12天后至20天，肿瘤完全被消除，而实施例11的图12A却并非如此。本实施例的MC-38鼠与实施例18的荷U87鼠相比，前者具有自身免疫功能，而后者是免疫缺陷鼠，因此前者更接近人类患者的机体状态，这可以说明本发明的分子探针在***可激发治疗者自身的免疫机能，使得治疗效果更好，能够高效抑制和消除肿瘤。图13D为本发明的分子探针在剂量18Mbq、9Mbq时，小鼠体重随时间变化的趋势图。由图可见，本发明的分子探针在20天期间，小鼠体重变化不明显，可见本发明的分子探针副作用较小，安全性高。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.A-(L)n-RGD多肽：

其中A为如下结构：

L代表连接臂分子，具有如下结构：其中m为1-8的整数，例如2-6，优选5；

所述L通过其羧基与A中的氨基反应键链，例如，通过L中标记为*的羧基与A键链；

n为0或1；

当n为0时，所述RGD多肽通过其氨基与A中的羧基反应键链；

当n为1时，所述RGD多肽通过其氨基与L中的另一羧基反应键链，例如当L中标记为*的羧基与A相连时，标记为**的羧基与RGD多肽反应键链；

RGD多肽为选自以下的RGD多肽：c(RGDfV)、c(RGDfK)，c(RGDfE)，c(RGDyk)、E[c(RGDyk)]₂、E[c(RGDfK)]₂、3PRGD₂。

2.含有权利要求1的RGD多肽的放射性核素标记的配合物，其具有如下定义的结构：

Nu-BFC-A-(L)n-RGD多肽

其中：

Nu为放射性核素，例如诊断显像核素：¹¹¹In、⁶⁴Cu、^99mTc、⁶⁸Ga，或者治疗核素：⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re；

BFC为双功能螯合剂(bifunctional chelating agent)，例如HYNIC、MAG₂、MAG₃、DTPA、DOTA、NOTA、TETA；

当n为0时，所述双功能螯合剂通过其结构中具有的羧基与A中的-NH₂反应键链；

当n为1时，所述双功能螯合剂通过其结构中具有的羧基与L中的-NH₂反应键链。

优选地，如上结构修饰的多肽RGD和配合物中：

RGD多肽选自：c(RGDfK)、3PRGD₂；

Nu选自：⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹¹¹In、⁶⁴Cu、^99mTc；

当Nu为⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu时，BFC选自DTPA、DOTA；当Nu为¹¹¹In、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、^99mTc时，BFC选自HYNIC、MAG₂、MAG₃、DTPA、DOTA、TETA和NOTA。

优选地，Nu为⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu，BFC选自DTPA、DOTA；Nu为¹¹¹In时，BFC选自DTPA、DOTA；Nu为⁶⁴Cu时，BFC选自TETA、DOTA；Nu为⁶⁸Ga时，BFC选自NOTA、DOTA；Nu为^99mTc时，BFC选自HTNIC、DTPA、MAG₂、MAG₃。

3.根据权利要求2的配合物，其如下所述：

⁶⁸Ga-DOTA-A-c(RGDfk)；

^99mTc-HYNIC-A-3PRGD₂；

¹⁷⁷Lu-DOTA-A-L-3PRGD₂。

优选地，所述配合物具有如下结构：

4.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的上述权利要求2-3任一项的标记配合物。

5.根据权利要求4的药物组合物，当Nu为诊断核素时，所述药物组合物是一种诊断药物，例如所述药物作为显像剂，用于整合素αvβ3阳性肿瘤的显像诊断。

6.根据权利要求4的药物组合物，当Nu为治疗核素时，所述药物组合物是一种治疗药物，所述药物用于整合素αvβ3阳性肿瘤的放射靶向治疗。

7.根据权利要求4-6任一项的药物组合物，其是一种可注射制剂，包含上述标记配合物和可注射的载体。优选地，是一种静脉注射剂；优选地，所述药物组合物含有0.05％吐温-20的PBS溶液。

8.权利要求1的多肽或者权利要求2-3任一项的配合物在制备药物中的用途，所述药物用于诊断或者治疗整合素αvβ3阳性肿瘤。所述肿瘤是指实体肿瘤，例如在血液、肝、腺体(例如乳腺、***、胰腺)、肠(例如结肠直肠)、肾、胃、脾、肺、肌肉、骨头等部位的恶性肿瘤。