CN104926945B - 一种具有fshr靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用 - Google Patents
一种具有fshr靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用,该多肽具有FSHR靶向性的肿瘤治疗作用,所述FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽为FSH33‑53‑IIKK靶向融合多肽,所述多肽具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性。本发明的FSH33‑53‑IIKK靶向融合多肽可以在制备治疗或预防肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及一种具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用。
技术背景
***受体(FSHR)是潜在的***癌靶向标志物。FSHR是一种由寡聚糖蛋白构成的膜受体,属G蛋白偶联受体家族。FSHR主要存在于人和动物睾丸的支持细胞、卵巢颗粒细胞,通过介导***(FSH)的信号影响雄性***生精的启动、成年期生精过程的维持及雌性***各阶段的发育。2010年《新英格兰医学杂志》(Radu A,Pichon C,CamparoP,et al.Expression of follicle-stimulating hormone receptor in tumorblood vessels.N Engl J Med.2010Oct 21;363(17):1621-30.)报道对1336例不同的肿瘤标本进行免疫组化、原位杂交等研究,发现FSHR在***癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、睾丸癌等多种癌组织的血管内皮细胞中高表达,因此肿瘤血管内皮FSHR的表达可能有助于肿瘤新生血管的形成。2013年《BMC Cancer》(Siraj A,Desestret V,Antoine M,Fromont G,Huerre M,Sanson M,Camparo P,Pichon C,Planeix F,Gonin J,Radu A,GhineaN.Expression of follicle-stimulating hormone receptor by the vascularendothelium in tumor metastases,BMC Cancer.2013;13:246.)报道对包括***癌在内的6类肿瘤在主要器官如骨、肝、***、脑和肺等的转移灶进行免疫组化分析,发现上述肿瘤转移灶中FSHR高度表达,而毗邻的正常器官无显著表达。提示,FSHR是***癌转移灶界定的靶向标志物之一。除此之外,FSHR也在人卵巢癌Caov-3、OVCAR-3,人***PC3等癌细胞中组成性表达。进一步研究发现将卵巢表面上皮细胞(OSE)转染FSHR质粒并过表达后,细胞的EGFR、HER-2/neu和c-Myc等蛋白表达上升,ERK1/2则持续磷酸化,细胞增殖速度加快,这些现象与卵巢癌细胞OVCAR-3细胞内情况相一致。推测过表达FSHR可能与肿瘤发生前卵巢上皮细胞的增殖和致癌途径水平的提高相关。研究还发现FSH/FSHR可通过调节经典的PI3K/Akt信号通路中的NF-κB的活性来增强卵巢癌细胞系3AO的增殖和侵袭能力。因此,FSHR与肿瘤的生长、转移、侵袭等息息相关,是一重要的研究、治疗靶点。
***(FSH)是FSHR内源性配体,由α和β两条亚基组成。研究表明人FSHβ链上33-53片段,81-95片段等均可与FSHR相结合,而其中FSH33-53(Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe)与FSHR的亲和力最强,可作为拮抗剂竞争FSH与FSHR的结合。徐宇平等对FSH33-53进行18F标记,制成18F-Al-NOTA-MAL-FSH33-53成功用于FSHR高表达的人***癌荷瘤裸鼠显像,为临床***癌的特异性诊断提供了基础。也有研究通过纳米颗粒连接FSH33-53与紫杉醇(PTX),构建了FSH33-53-NP-PTX复合物,提高了PTX对肿瘤细胞CAOV-3的靶向、治疗能力。可见,FSH33-53可作为FSHR的靶向载体,有益于FSHR高表达肿瘤的诊断及治疗。
多肽G(IIKK)nI-NH2(n=1-4),Gly-(Ile-Ile-Lys-Lys)n-Ile-NH2(n=1-4),是一类具有简单重复序列并包含α-螺旋结构的阳离子抗菌肽。随着IIKK序列重复次数的增加,能够通过与两性分子膜的连接,增强多肽IIKK的α-螺旋,使多肽结构趋于稳定。此外,在多肽羟基端增加异亮氨酸(Ile)能够进一步促进维持二级结构的能力,稳固多肽分子结构,引发并协调功能的发挥。经对比研究,发现G(IIKK)3I-NH2(IIKK)具有最佳的链长、抗肿瘤效果,结构简单,毒副作用小,抗肿瘤活性强,亦是理想的靶向肿瘤抑制药物。IIKK通过静电与疏水作用与肿瘤细胞膜结合,以膜透化方式进入并积累于肿瘤细胞,最终通过调控凋亡通路或细胞坏死来抑制肿瘤细胞生长。IIKK体内外良好的抗肿瘤性能显示了其在临床开发应用中的巨大潜力。现有技术中缺少兼具FSHR靶向和更强抗肿瘤功能的融合多肽蛋白。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有技术中缺少兼具FSHR靶向和更强抗肿瘤功能的融合多肽蛋白。基于功能多肽联合应用的思路,设计了FSH33-53-IIKK及IIKK-FSH33-53靶向融合多肽,具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽,所述多肽具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性,其氨基酸序列选自下述(a)-(c):
(a)、其序列为α亚单位和β亚单位构成,其中α亚单位为能与FSHR相结合的亲合片段,β亚单位为具有简单重复序列并包含α-螺旋结构的阳离子抗菌肽,
所述的亲合片段包括FSHβ链上33-53片段或81-95片段,
所述的阳离子抗菌肽包括G(IIKK)nI-NH2或Gly-(Ile-Ile-Lys-Lys)n-Ile-NH2,其中n=1-4;
(b)、所述FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽为FSH33-53-IIKK靶向融合多肽
Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-NH2,以及Gly-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Gly-Gly-Gly-Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe;
(c)、所述序列为在(a)、(b)所示的氨基酸序列中,取代、缺失或添加1-10个氨基酸而得到的,且具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性的氨基酸序列。
所述重组融合多肽还包括,含有FSH33-53-IIKK靶向融合多肽、或其不丧失生物活性的片段、变体或衍生物。
本发明还在于:提供了一种编码权所述FSH33-53-IIKK靶向融合多肽的多核苷酸。
所述的多核苷酸还包括其不丧失生物活性的片段、变体或衍生物。
本发明还在于:提供了一种药物组合物,其用于治疗或预防肿瘤,包含所述FSH33-53-IIKK靶向融合多肽。所述的药物组合物,还包含药学上可接受的载体或所述组合物是冻干形式、单位剂型、固体剂型、液体形式。
本发明还在于:提供了通过调控凋亡通路或细胞坏死抑制肿瘤细胞生长的表达的方法,所述方法包括下述步骤:
a)提供上述定义的核酸序列、多肽或组合物,
b)将所述核酸序列、多肽或组合物应用于或施用至野生肿瘤细胞的表达***、细胞、组织或生物体。
本发明还在于:提供了将所述的FSH33-53-IIKK靶向融合多肽、多核苷酸在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
将所述的FSH33-53-IIKK靶向融合多肽、所述的多核苷酸在制备治疗或预防生殖***肿瘤、头颈部癌及肺癌、恶性淋巴瘤药物中的应用。
将所述的FSH33-53-IIKK靶向融合多肽、所述的多核苷酸在制备治疗或预防***癌药物中的应用。
通过构建多肽FSH33-53介导的FSHR靶向诊断和治疗的***并融合抗肿瘤多肽IIKK,期望能够将FSH33-53-IIKK应用于FSHR高表达肿瘤的治疗,改善治疗现状。
通过Western Blot检验FSHR在几种细胞中的表达,其中,L929细胞FSHR阴性表达。MTT法可检测药物对细胞抑制增殖的作用。采用该方法检测FSH33-53-IIKK在不同浓度下对PC3、Hela、SKOV3、MCF7、L929、293细胞的抑制作用,并与IIKK、顺铂的肿瘤细胞抑制率进行比较。结果显示,FSH33-53-IIKK与IIKK对肿瘤细胞有较强的抑制作用,两者对肿瘤细胞的IC50接近,且呈明显量效关系。而两种多肽对正常组织细胞的抑制作用明显减弱。相比之下,顺铂对肿瘤细胞的抑制作用相对降低,特别是在PC3细胞的抑制率,在50μM浓度下仅达到(48.13±3.89)%,与FSH33-53-IIKK的细胞抑制率(96.94±3.45)%相比差异显著(P>0.05)。而相同浓度的多肽与顺铂作用于正常组织细胞,顺铂对细胞的毒性作用明显增强。
肿瘤发生的主要特征为细胞生长和增殖失控。细胞在增殖、分化、凋亡等方面的异常都参与了肿瘤的发生和发展。常见的抗肿瘤作用机理的研究有:药物对细胞周期的影响;药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用;药物诱导细胞自噬的作用;药物对细胞DNA的影响(包括与DNA结合能力的检测、药物造成DNA损伤、药物对细胞核酸代谢的影响)等。文献报道IIKK能够通过改变细胞骨架结构、降低线粒体膜电位、促进细胞色素C的释放以及激活Fas通路诱导细胞凋亡。本发明从多肽对细胞周期分布的影响、细胞凋亡信号的转导及自噬体标记蛋白LC3的变化三个方面对融合肽FSH33-53-IIKK的抗肿瘤机制进行初步探讨。
通过流式细胞仪检测分析多肽对细胞周期调节及凋亡的影响。结果显示,不同浓度多肽作用于PC3细胞24h后,细胞的G0/G1、S、G2/M周期分布差异不显著(P>0.05),即FSH33-53-IIKK对PC3细胞的周期无明显影响。利用Hoechst 33258染色法考察FSH33-53-IIKK对PC3细胞凋亡的影响,从形态学上验证了多肽能够诱导PC3细胞凋亡。FSH33-53-IIKK通过诱导细胞凋亡发挥肿瘤抑制功能。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主死亡的过程,是自体损伤的一种现象。癌症的发生及耐药性的产生与细胞出现凋亡抑制密切相关。Hoechst 33258染色法中7.5μM、15μM、30μM的FSH33-53-IIKK能够诱导PC3细胞出现典型的凋亡特征,如细胞体积缩小,核质浓缩,呈现不规则的核裂解等,并且呈明显的浓度依赖性。相同浓度梯度下用流式细胞仪检测融合肽和多肽IIKK诱导细胞凋亡的凋亡率。FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞的凋亡率高于IIKK相应浓度下的细胞凋亡率,并且30μM浓度的FSH33-53-IIKK对PC3细胞的凋亡率显著高于IIKK(P<0.05)。以上证明,FSH33-53-IIKK能够诱导PC3细胞凋亡,并且其诱导细胞凋亡的趋势优于IIKK。
细胞凋亡的发生和发展涉及一系列基因的激活、表达和调控。其主要途径可分为:死亡受体介导途径、内质网介导途径、线粒体介导途径。内源性的线粒体凋亡途径是细胞受到内部或者外部的刺激,线粒体的外膜通透性改变,向胞质基质释放相关的凋亡因子,引发凋亡的发生。
Bcl-2家族蛋白在线粒体参与的细胞凋亡途径中起重要的调控作用,能促进或干扰细胞色素C的释放来调控细胞的凋亡。目前已知的Bcl-2同源蛋白大概有20余种,根据其结构和功能的不同可分为两大类:促凋亡蛋白Bax、Bad和Bak等;抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xl等。Bcl-2干扰细胞色素C的释放,阻断上游Caspase蛋白的激活,保护细胞不发生凋亡;而Bax/Bad促进细胞色素C释放,诱导细胞凋亡。
半胱氨酸天冬氨酸酶(cysteine aspartic specific protease,Caspase)家族是一组存在于胞浆中的天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶,能够选择性切割某些蛋白质,激活靶蛋白或使之失活,是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者。在细胞凋亡过程中,有多种Caspase共同参与。在正常情况下,Caspase以无活性的前体形式合成与贮存,而凋亡信号可激活Caspase级联反应。其中,Caspase-8,Caspase-9位于联级反应上游,是主要的凋亡启动者;Caspase-3等位于联级反应的下游,是凋亡的执行者。在Fas或TNF诱导的凋亡中,Caspase-8是凋亡的“发起者”。Caspase-8收到凋亡信号后,通过自剪切的形式激活,直接或间接激活下游的效应分子Caspase-3等,而激活的Caspase-3等分解Lamins、PARP(polyADP-ribose polymeras)等,激活核酸内切酶,导致DNA片段化。Caspase-3的激活是凋亡下游信号传导的关键。
利用Western Blot法检测了FSH33-53-IIKK作用PC3细胞24h后,凋亡相关蛋白Procaspase-8、Procaspase-3、Bcl-2、Bad、Bax的表达水平。结果表明,Procaspase-8、Procaspase-3、Bcl-2蛋白表达降低,Bad蛋白表达不变,Bax/Bcl-2增加。说明FSH33-53-IIKK作用于细胞后,通过线粒体凋亡通路降低Bcl-2的表达,抑制细胞色素C的释放,进而激活PC3细胞中的Caspase级联反应,活化了Caspase-8和Caspase-3,引起细胞凋亡,与IIKK诱导细胞凋亡机理一致。
细胞自噬(Autophagy)是细胞应对外界环境变化的一种反应,对细胞自身维持代谢平衡及细胞内环境稳定起到重要作用。细胞自噬一方面可以为肿瘤提供丰富的营养,促进肿瘤生长;另一方面,细胞自噬可以对抗细胞的癌变。因此,在肿瘤发生发展的过程中,细胞自噬的作用具有两面性。大多数研究者认为,细胞自噬在对抗肿瘤生成的过程中同样扮演重要角色。
采用AO染色法从细胞形态学检测细胞自噬。PC3细胞经0、7.5、15、30μM浓度的FSH33-53-IIKK处理后,荧光显微镜下可观察到,随着药物浓度的增加,出现自噬体结构的细胞增多,且荧光增强。表明多肽FSH33-53-IIKK亦可诱导细胞发生自噬。
细胞发生自噬的过程由一系列自噬相关蛋白(Atg蛋白)介导完成。微管相关蛋白质1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的转变是自噬发生的标志。LC3蛋白可被Atg4蛋白酶切割变成LC3-Ⅰ,当自噬体形成后,LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)偶联形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ可稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合,因此可被用来作为自噬体的标记。
利用Western Blot检测在FSH33-53-IIKK作用下PC3细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达水平的变化,以此来反应自噬体的数量。实验结果表明,PC3细胞经药物处理后,随着药物浓度的增加,LC3-Ⅰ的表达减少,而LC3-Ⅱ蛋白表达水平在低浓度药物下呈现增加趋势,在高浓度药物作用下又降低。说明FSH33-53-IIKK在适当浓度范围内能一定程度的诱导细胞发生自噬,而在高浓度多肽作用下通过其他途径抑制肿瘤细胞增殖。
考虑到体外难以模拟体内复杂的生化环境,多肽对实体瘤的作用受到多重因素的影响,如在体内易被多种酶降解,肿瘤内部供血不足造成的酸性环境影响多肽的性能等,所以需要建立体内抗肿瘤模型考察多肽在实体瘤的靶向及治疗作用的发挥。采用皮下细胞移植法建立PC3肿瘤模型,成瘤率达到95%,在裸鼠体内生长状况良好。
在验证FSH33-53-IIKK体内抑制肿瘤作用实验中,设计了生理盐水阴性对照组、IIKK(5mg/Kg)实验组、FSH33-53-IIKK(5mg/Kg、10mg/Kg)实验组、顺铂(3mg/Kg)阳性对照组,通过比较FSH33-53-IIKK、顺铂等治疗药物对PC3肿瘤的抑制率及对裸鼠体重变化的影响来考察多肽在体内的抑制肿瘤增殖的性能。顺铂(DDP)是重金属络合物,属于广谱的细胞周期非特异性抗肿瘤药物。DDP可抑制肿瘤细胞DNA复制过程,破坏细胞膜结构,阻止肿瘤细胞增殖,是目前临床治疗恶性肿瘤常用的化学药物,多用于生殖***肿瘤、头颈部癌及肺癌、恶性淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗。但DDP在杀伤肿瘤细胞的同时,也能产生较大的毒副作用,并产生耐药性。而***癌细胞对顺铂敏感性差,限制了其在***癌治疗中的应用。查阅文献得知,顺铂的最大耐受剂量为9mg/kg,每6天一次给药。以顺铂3mg/kg,每周3次给药作为阳性对照组与FSH33-53-IIKK的抑瘤作用进行比较。实验结果显示,相同浓度的FSH33-53-IIKK表现出比IIKK更高的平均肿瘤抑制率,FSH33-53-IIKK 10mg/kg实验组与顺铂组的平均肿瘤抑制率相近,而FSH33-53-IIKK对肿瘤鼠体重的影响显著低于顺铂组,说明多肽的毒副作用小。
发明的有益效果:
FSH33-53-IIKK与IIKK对肿瘤细胞有较强的抑制作用,两者对肿瘤细胞的IC50接近,且呈明显量效关系;FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞的凋亡率高于IIKK相应浓度下的细胞凋亡率,FSH33-53-IIKK能够诱导PC3细胞凋亡,并且其诱导细胞凋亡的趋势优于IIKK;FSH33-53-IIKK作用于细胞后,通过线粒体凋亡通路降低Bcl-2的表达,抑制细胞色素C的释放,进而激活PC3细胞中的Caspase级联反应,活化了Caspase-8和Caspase-3,引起细胞凋亡;FSH33-53-IIKK表现出比IIKK更高的平均肿瘤抑制率,10mg/kgFSH33-53-IIKK与顺铂表现出相近的肿瘤抑制作用,但FSH33-53-IIKK对肿瘤鼠体重的影响明显低于顺铂组,说明多肽的毒副作用小。
附图说明:
以下将结合附图和具体实例对本发明进行进一步的阐述。
图1、Western blot检测FSHR在MCF7、Hela、PC3、293、SKOV3、L929细胞中的表达。
图2、FSH33-53-IIKK、IIKK和顺铂对细胞的增殖抑制作用。
图3、不同浓度FSH33-53-IIKK作用下PC3细胞周期拟合图及统计结果。
A:0μM;B:7.5μM;C:15μM;D:30μM;E:细胞周期统计结果(P>0.05)
图4、FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞24h,Hoechst 33258染色观察诱导细胞凋亡作用。
A:0μM;B:7.5μM FSH33-53-IIKK;C:15μM FSH33-53-IIKK;D:30μM FSH33-53-IIKK
图5、Annexin V-FITC/PI双染法检测FSH33-53-IIKK与IIKK对PC3细胞的诱导凋亡作用。
A:0μM;B:7.5μM FSH33-53-IIKK;C:15μM FSH33-53-IIKK;D:30μM FSH33-53-IIKK
E:7.5μM IIKK;F:15μM IIKK;G:30μM IIKK
图6、FSH33-53-IIKK对PC3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。
图7、FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞24h,AO染色观察诱导细胞自噬作用。
A:0μM;B:7.5μM FSH33-53-IIKK;C:15μM FSH33-53-IIKK;D:30μM FSH33-53-IIKK
图8、FSH33-53-IIKK对PC3细胞LC3-Ι、LC3-Π蛋白表达的影响。
图9、FSH33-53-IIKK对PC3裸鼠移植瘤模型肿瘤生长曲线的影响。
图10、给药21天后,各实验组荷瘤鼠体重变化及肿瘤体积对比图。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
Western Blot检测FSHR在几种细胞中的表达
人***癌细胞株PC3、人***细胞株Hela、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳腺癌细胞株MCF7、人胚肾细胞293、小鼠成纤维细胞L929,购自中科院上海细胞库。
雄性BALB/c-nu裸鼠,体重18~19g,江苏常州卡文斯实验动物有限公司,SPF级,鼠龄5周。合格证号:NO.0026328,许可证号:SCXK(苏)2011-0003。
实验所用PC3、MCF7、Hela、PC3、293、SKOV3、L929等细胞培养方法一致,在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养传代,用含10%胎牛血清及100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基培养。
收集细胞,用含蛋白酶抑制剂的RIPA试剂,按照常规方法提取细胞蛋白并用BCA蛋白分析测试试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白定量后,取等量蛋白,加入上样缓冲液,样品70℃变性10min,SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE),每孔上样40-50μg,后转膜于PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温下摇床封闭1小时,加入一抗(FSHR:Rabbit-anti-FSHR,1:1000;Actin:mouse-anti-Actin,m、h,1:1000),密封,4℃摇床摇荡过夜。TBST洗膜3次,每次10min。加入二抗(Anti-Rabbit-HRP,Anti-mouse-HRP,1:1000,二抗稀释液稀释),封装,置于摇床上室温孵育1h。再次按上述方法洗膜,ECL曝光显影。
FSHR在多种细胞中的表达
用Western Blot检测细胞中FSHR蛋白表达情况。如图1,Hela、MCF7、PC3细胞株有高水平的FSHR表达,L929细胞无FSHR表达。
实施例2
MTT法测定多肽FSH33-53-IIKK对多种细胞存活率的影响
将对数期生长的细胞按照5×103个/孔接的密度种于96孔板中。培养过夜,细胞贴壁后,每孔分别加入含有不同浓度FSH33-53-IIKK、IIKK和顺铂的培养基100μl(浓度梯度为0,1,2,5,10,15,20,40,50μM),每个浓度设3个复孔。孵育24h后,每孔加入40μl浓度为2mg/ml的MTT溶液,继续培养,4h后弃上清;每孔加入150μl的DMSO,震荡10min充分溶解结晶。酶标仪测定样品在570nm波长的OD值。计算生存率、绘制生存曲线,并求出IC50。生存率=(实验孔OD值/空白对照组OD值)×100%。
FSH33-53-IIKK的体外细胞毒性检测
采用MTT法测定多肽FSH33-53-IIKK、IIKK和顺铂对PC3、Hela、SKOV3、MCF7和293、L929细胞中的细胞毒性。如图2,FSH33-53-IIKK、IIKK以及顺铂对肿瘤细胞的增殖均有较明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性。多肽FSH33-53-IIKK、IIKK与顺铂比较,前两者对肿瘤细胞表现出更强的抑制作用,而两种多肽给药组间差异无统计学意义。多肽FSH33-53-IIKK、IIKK对正常组织细胞的毒性均低于顺铂。比较FSH33-53-IIKK、IIKK以及顺铂对几种细胞的IC50,结果如表1。
表1 药物对细胞株的IC50对比
*p<0.05vs FSH33-53-IIKK,**p<0.01vs FSH33-53-IIKK,***p<0.001vs FSH33-53-IIKK
p-values were determined by Student’s t-test between the IC50values ofboth cell lines
实施例3
FSH33-53-IIKK对PC3细胞周期的影响
细胞周期指细胞从前一次***结束到下一次***结束为止的活动过程,分为***间期和***期两个阶段。其中,***间期又分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)。M期为有丝***期。G0期为细胞休眠期。碘化丙啶(PI)是一种可对DNA和RNA染色的细胞核染色试剂,可在嵌入DNA或RNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对细胞核进行染色。冰乙醇可以增加细胞膜通透性。用RNase裂解RNA,使PI进入细胞内与DNA选择性结合,细胞内染料的荧光量与细胞核内的DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度可得到细胞的DNA相对含量,再根据各个时相DNA含量的不同,将细胞分为不同的周期。
将对数生长期的PC3细胞,以2×105个/孔接种于6孔板中,每孔加1.5ml的培养液。培养过夜,细胞贴壁后,分别加入终浓度为0μM、7.5μM、15μM、30μM的FSH33-53-IIKK。药物作用24h后,收集培养液并消化贴壁细胞,用PBS洗培养皿3遍,收集PBS,合并细胞,1500r/min离心4min;将细胞重悬,加入到4℃预冷的70%乙醇中固定,封口膜封口,4℃过夜。2000r/min离心4min,吸去固定液,PBS洗2遍。将细胞转移至1ml离心管中,加入含有PI(50μg/ml)、RNaseA(50μg/ml)和曲拉通(1%)的工作溶液,室温避光孵育30min,用流式细胞仪检测细胞周期的,并分析细胞周期时相分布。
FSH33-53-IIKK对PC3细胞周期的影响
将PC3细胞经不同浓度的FSH33-53-IIKK处理24小时候后,检测药物对细胞周期的影响。结果显示,7.5、15、30μM的FSH33-53-IIKK作用于细胞后,与对照组细胞周期分布相比,差异无统计学意义(图3)。即,FSH33-53-IIKK对细胞的周期分布无影响,多肽抑制肿瘤增殖的作用不是通过改变细胞周期分布来实现。
实施例4
Hoechst 33258染色检测细胞凋亡
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜,与细胞核结合的蓝色荧光染液。虽然Hoechst能与所有的核酸结合,但更倾向于与富含A/T(腺嘌呤/胸腺嘧啶)的DNA链结合,在350nm左右的紫外光激发,荧光强度显著增强。因此,经Hoechst 33258染色后,用荧光显微镜可观察细胞核的形态变化。
将对数生长期的PC3细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,加培养液到2ml,十字摇晃六孔板,使细胞均匀散开。将六孔板置于培养箱中,培养过夜。待细胞贴壁后,分别加入终浓度为0μM、7.5μM、15μM、30μM FSH33-53-IIKK。作用24h后,吸除旧培养液,然后用PBS小心荡洗2次;每孔加入终浓度为10μg/ml Hoechst 33258染液(含0.2%曲拉通X-100)1ml,放入培养箱继续孵育30min。弃染液,用PBS洗2次,注意动作要轻,不要将细胞吹掉;在荧光显微镜下观察,并拍照记录细胞核形态。
Hoechst 33258染色法观察FSH33-53-IIKK对PC3细胞凋亡的影响
采用Hoechst33258荧光染色法检测FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞后细胞核的形态变化。细胞分别经0、7.5、15、30μM浓度的FSH33-53-IIKK处理细胞24h后,Hoechst染色,荧光显微镜下观察。如图4,空白对照组细胞的细胞核大部分呈现均一、饱满的圆形或椭圆形。因细胞自身存在程序性死亡的过程,有极少数细胞呈现强荧光染色和异形细胞核。随着药物浓度的增加,出现明显的细胞体积缩小,细胞核染色质皱缩,形成半月形或帽状附于核膜,荧光变得致密,并且伴有明显的粒状荧光体聚集,呈现不规则的核裂解现象(箭头所示为发生核固缩、核碎裂的典型凋亡形态)。当浓度达到30μM时,细胞贴壁能力下降、裂解成碎片。
实施例5
流式细胞仪检测FSH33-53-IIKK对PC3细胞的凋亡诱导作用
AnnexinV-FITC/PI双染流式检测法是检测细胞凋亡的常规方法。在细胞凋亡的早期,特异性分布在细胞膜的脂质双分子层内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会伴随着细胞膜的外翻而暴露在细胞表面。AnnexinV与PS高度亲和,经过荧光素FITC标记后,通过荧光可以检测早期细胞凋亡的发生。而在细胞凋亡的中晚期,细胞膜的完整性被破坏,PI可以透过细胞膜与细胞核结合。两种荧光染料联合使用,即可用流式细胞仪区分细胞的不同状态。
将对数生长期的PC3细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,加培养液到2ml,十字摇晃六孔板,使细胞均匀散开。将六孔板置于培养箱中,培养过夜。待细胞贴壁后,分别加入终浓度为0μM、7.5μM、15μM、30μM的FSH33-53-IIKK、IIKK肽。作用24h后,收集细胞(包括培养液中漂浮的死细胞),然后用PBS小心荡洗培养皿2次,收集PBS,将细胞悬液1500r/min离心4min,弃去上清,重悬细胞并转至1.5ml离心管中。PBS洗2次,2000r/min离心4min,弃去上清。每个样品加入100μl事先配好的含有Annexin V-FITC和PI的binding buffer(每1ml bindingbuffer加入Annexin V-FITC和PI各20μl,震荡,使染色液混合均匀),15-25℃避光孵育10-15min。检测样品前,每管样品再加入适量的binding buffer稀释(1000个细胞/微升稀释液)。流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并分析结果。
FSH33-53-IIKK与IIKK对PC3细胞诱导凋亡作用的比较
流式细胞术检测FSH33-53-IIKK与IIKK对PC3细胞诱导凋亡的作用。如图5所示:7.5、15、30μM浓度的FSH33-53-IIKK作用24h后,PC3细胞凋亡率依次为:(9.1±1.35)%、(18.5±1.50)%、(51.1±2.00)%。对应浓度的IIKK作用下,凋亡率分别为(7.3±1.08)%、(16.9±0.81)%、(41.2±2.61)%。两组凋亡率的增加均具有显著性差异(P<0.01)。15、30μM浓度的作用下,FSH33-53-IIKK实验组的细胞凋亡率较IIKK对照组的凋亡率有所增加(P<0.05)。说明FSH33-53-IIKK诱导PC3细胞凋亡呈剂量依赖性,并且作用较IIKK增强。
实施例6
Western blot检测Procaspase-3、Procaspase-8、Bcl-2、Bax等蛋白的表达
将对数生长期的PC3细胞以2×105个/孔接种于培养皿中,待细胞生长至80-90%时,加入0μM、7.5μM、15μM、30μM的FSH33-53-IIKK,处理细胞24h。弃培养液用PBS荡洗3次,将200μl含蛋白酶抑制剂的RIPA加入到培养皿中,冷孵化5分钟,刮板收集细胞蛋白并进行蛋白定量。取等量蛋白,加入上样缓冲液,将蛋白样品在70℃变性10min后,SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE),每孔上样量为40-50μg,电泳结束后进行转膜操作。用5%脱脂奶粉室温下摇床封闭1h,加入一抗(Bcl-2、Bax、Procaspase-3、Procaspase-8、Actin,1:1000),4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10min,加入1:1000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗,室温摇床孵育一小时。再次按上述方法洗膜,ECL曝光显影。以Actin做内参对各蛋白条带进行灰度分析,并以比值为纵坐标作柱状图。
FSH33-53-IIKK对PC3细胞凋亡相关蛋白的影响
Western blot分别检测不同浓度FSH33-53-IIKK作用下PC3细胞凋亡相关蛋白的表达变化。药物作用24h后,Procaspase-8、Procaspase-3、Bcl-2、Bad、Bax蛋白表达的变化如图6。随着药物浓度的增加,Procaspase-8、Procaspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达均降低,且具有浓度依赖性。Bad蛋白表达无明显变化。虽然Bax蛋白表达也呈下降趋势,但Bax/Bcl-2仍呈上升趋势。结果表明,FSH33-53-IIKK可以通过线粒体途径激活PC3细胞的Caspase级联反应,并最终诱导细胞凋亡。
实施例7
AO染色检测细胞自噬
吖啶橙(acridine orange,AO)是一种可渗透细胞的荧光染液,能将DNA及胞质染成亮绿色。当PH降低时,AO能发出红色荧光,且荧光强度与酸性程度正相关。当细胞发生自噬时形成自噬溶酶体结构。自噬溶酶体呈酸性,可利用AO标记溶酶体检测细胞自噬。
将对数生长期的PC3细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,加培养液到2ml,十字摇晃六孔板,使细胞均匀散开。将六孔板置于培养箱中,培养过夜。待细胞贴壁后,分别加入终浓度为0μM、7.5μM、15μM、30μM的FSH33-53-IIKK。作用24h后,吸除旧培养液,然后用PBS小心荡洗2次;每孔加入终浓度为10μg/ml AO染液1ml,放入4℃冰箱继续孵育30min。弃染液,用PBS洗1次,注意动作要轻,不要将细胞吹掉,在荧光显微镜下观察,并拍照记录细胞荧光状况。
AO染色检测细胞自噬
采用AO染色法检测FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞后细胞自噬溶酶体发生的变化。细胞分别经0、7.5、15、30μM浓度的FSH33-53-IIKK处理细胞24h后,AO染色,荧光显微镜下观察。如图7,空白对照组细胞的细胞核及胞质呈现亮绿色。7.5μM浓度的FSH33-53-IIKK给药处理后,可观察到部分细胞中分布在细胞质的酸性囊泡呈现橘红色。随着药物浓度的增加,出现自噬体结构的细胞数量增加,且荧光强度增强。当浓度达到30μM时,细胞贴壁能力下降,几乎所有贴壁细胞的细胞质中均分布有亮红色荧光。
实施例8
Western Blot检测自噬蛋白的表达
细胞的自噬过程是由一系列自噬相关蛋白(Atg蛋白)介导完成的。其中,微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3,LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式的LC3蛋白。当自噬体形成后,LC3-Ⅰ可与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)偶联形成LC3-Ⅱ,定位于自噬体内膜和外膜。通过测定、比较LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的水平,可在某种程度上反映自噬体的数量。
细胞的培养、加药处理、蛋白样品的收集、浓度测定及凝胶电泳的步骤,如前。用5%脱脂奶粉室温下摇床封闭1h后,加入一抗(LC3,1:1000),4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10min,加入1:1000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗,室温摇床孵育1h。再次按上述方法洗膜,ECL曝光显影。以Actin做内参对各蛋白条带进行灰度分析,并以比值为纵坐标作柱状图。
细胞自噬蛋白检测
Western Blot检测不同浓度FSH33-53-IIKK作用下PC3细胞自噬相关蛋白的表达变化。药物作用24h后,LC3-Ι、LC3-Π蛋白表达的变化如图8。随着药物浓度的增加,LC3-Ι蛋白的表达变现出下降趋势,而LC3-Π蛋白在7.5-15μM药物浓度作用下呈现增加趋势,而在30μM浓度下表达减少。结果表明,FSH33-53-IIKK在低浓度作用环境下,可以诱导肿瘤细胞发生自噬,而在高浓度时通过凋亡或其他方式抑制细胞增长。
实施例9
FSH33-53-IIKK对PC3裸鼠移植瘤抑制作用的鉴定
PC3裸鼠移植瘤模型的建立及对PC3裸鼠移植瘤抑制作用的鉴定。按SPF级动物常规饲养裸鼠,所有饮用水、笼具均经无菌消毒处理。无菌条件下收集PC3细胞,用无菌生理盐水稀释至5×107个/ml,采用皮下接种方法,接种PC3细胞于裸鼠右侧腋窝皮下,每只接种1×107个细胞,待其成瘤。当肿瘤体达到50~100mm3时,将PC3移植瘤裸鼠分成五组,每组5只,每组平均肿瘤体积较一致。分别设FSH33-53-IIKK 5mg/kg和10mg/kg给药组,IIKK 5mg/kg给药组,顺铂3mg/kg对照组和生理盐水对照组。采用尾静脉注射方式给药,每周给药3次,给药前称量体重、测量瘤径。计算各组相对肿瘤体积(将不同组的肿瘤体积标准化),绘制瘤体的增殖曲线,比较各组肿瘤生长情况。给药三周后,颈椎脱臼处死,分离出肿瘤,称量瘤重,计算抑瘤率(%)。
肿瘤体积:
V=a×b2×1/2
(a:长径,b:短径)
相对肿瘤体积:
RTV=Vn/V0
(Vn为第n天测得的肿瘤体积,V0为给药前测得的肿瘤体积)
抑瘤率=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%
FSH33-53-IIKK在体内的抑制肿瘤作用
通过比较FSH33-53-IIKK、IIKK、顺铂等药物在体内抑制PC3移植瘤的作用,以评价FSH33-53-IIKK、IIKK的体内抑瘤效果。PC3细胞接种于荷瘤鼠,14天后,平均肿瘤体积达到80mm3,成瘤率95%。肿瘤增长以相对肿瘤增值率RTV计算。肿瘤增长曲线如图9,FSH33-53-IIKK 5mg/kg、10mg/kg,IIKK 5mg/kg,顺铂3mg/kg,生理盐水,五组肿瘤抑制率的比较。给药21天后,处死荷瘤鼠,分离出肿瘤,如图10。
通过称量体重,监测药物对裸鼠的毒性。根据荷瘤裸鼠体重的变化曲线(见图10),顺铂组体重明显下降,而FSH33-53-IIKK 5mg/kg、10mg/kg,IIKK 5mg/kg实验组体重与生理盐水组比较,无统计学差异(P>0.05)。即多肽毒性小于顺铂。
表2 PC3裸鼠移植瘤在几种药物作用下抑瘤率的比较
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽,其特征在于,所述多肽具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性,所述FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽为FSH33-53-IIKK靶向融合多肽Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-NH2。
2.一种重组融合多肽,其特征在于,含有权利要求1所述的FSH33-53-IIKK靶向融合多肽。
3.一种编码权利要求1或2所述FSH33-53-IIKK靶向融合多肽的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种药物组合物,其用于***,其特征在于,包含权利要求1或2所述FSH33-53-IIKK靶向融合多肽。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,还包含药学上可接受的载体或所述组合物是单位剂型、固体剂型或液体形式。
7.根据权利要求1-2所述的FSH33-53-IIKK靶向融合多肽在制备治疗***癌或卵巢癌药物中的应用。
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