CN104523762A - 具有抗过敏作用的副干酪乳杆菌的应用和功能食品组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在调节机体免疫功能中的应用，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。本发明还公开了含有如上所述的副干酪乳杆菌的功能食品组合物及其制备方法。相比于同属的其它副干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够更有效地调节机体的免疫功能，通过实验显示，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌对由β-乳球蛋白引起的过敏反应具有更好的疗效，并且能够更有效地促进树突状细胞的分化并降低其成熟度。
Description
技术领域
本发明涉及一种副干酪乳杆菌的应用，具体的，涉及一种具有抗过敏作用的副干酪乳杆菌CGMCC No.9800在调节机体免疫功能中的应用，本发明还涉及一种功能食品组合物及其制备方法。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，涉及非特异性免疫和特异性免疫，非特异性免疫不需要预先接触抗原，一旦病原体进入了机体，则会快速清除病原体。吞噬细胞和自然杀伤细胞都具有清除和杀伤作用，是非特异性免疫***中的重要成员。特异性免疫具有特异地识别外来异物并具有免疫记忆能力的免疫细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)。免疫***之间最首要的信息传导子就是细胞因子，每种细胞因子对不同的细胞类型具有不同的刺激功能，它们通过结合细胞表面的特异性受体而诱导细胞的生长发育和功能活性。人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康，抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所不希望的生物的侵入。
树突状细胞(derived dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力。体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，具有极强的抗原吞噬能力。
过敏是有机体对某些药物或外界刺激的感受性不正常地增高的现象。在正常的情况下，身体会制造抗体用来保护身体不受疾病的侵害，但过敏者的 身体却会将正常无害的物质误认为是有害的东西，产生抗体，从而导致过敏。这种物质被称为“过敏原”。
β-乳球蛋白对小牛具有类似免疫球蛋白的功能，但对于婴儿来说却是主要的过敏原，容易造成婴儿的过敏(婴儿的消化***尚未发育完全，β-乳球蛋白较容易“整颗”被吸收，而被免疫***判断为病原)。
干酪乳杆菌作为人体内的益生菌，对宿主的健康上起了重要的作用，干酪乳杆菌能够通过菌体及其组分来发挥对机体的免疫调节功能。
发明内容
本发明的目的是提供一株更具有免疫优势的副干酪乳杆菌的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在调节机体免疫功能中的应用，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
优选地，所述应用包括制备用于调节机体免疫功能的药物和/或食品。
优选地，所述应用包括制备用于预防和/或治疗机体过敏反应的药物和/或食品。
优选地，所述应用包括制备用于促进树突状细胞分化和/或降低树突状细胞成熟度的药物和/或食品。
另一方面，本发明还提供了一种功能食品组合物，其中，该功能食品组合物含有保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌的菌体。
再一方面，本发明还提供了一种制备功能食品组合物的方法，该方法包括：将保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌添加到食物中。
相比于同属的其它副干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够更有效地调节机体的免疫功能，通过实验显示，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌对由β-乳球蛋白引起的过敏反应具有更好的疗效，并且能够更有效地促进树突状细胞的分化并降低其成熟度。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明使用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2014年10月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9800。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
基于以上发现，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在调节机体免疫功能中的应用，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
本发明只保护在非疾病状态下需要调节机体免疫力的保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的应用，而对于需要调节免疫力以治疗疾病时，应用保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)并不在本发明的保护范围之内。
根据本发明，所述应用包括制备用于调节机体免疫功能的药物和/或食品。
本发明中，所述食品可以是任意类型的食品，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食品也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述食品中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。另外，所述药物可以根据给药途径的不同而制备成不同的形式，例如，可以制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等形式，所述药物中还可以包括药学上可接受的载体和/或佐剂，本领域技术人员能够 根据不同的剂型选择不同的载体和/或佐剂，本发明在此不再详细赘述。
尽管本发明提供的保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够有效地调节机体的免疫能力，但本发明的发明人发现，本发明提供的副干酪乳杆菌特别适用于对过敏性反应进行调节，并且也特别适用于对树突状细胞的分化和成熟度进行调节。
基于此，所述应用包括制备用于预防和/或治疗机体过敏反应的药物和/或食品。
尽管保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌对机体的过敏反应均能够起到调节作用，但本发明的发明人发现，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌对由β-乳球蛋白引起的过敏反应的调节最佳，能够对和该过敏反应相关的细胞因子和抗体的含量进行有效地调节，例如，提高IFN-γ/IL-4的比例，降低组胺和小鼠单核细胞趋化蛋白(mMCP-1)的水平，降低总IgE含量，对过敏诱导的BLG特异性IgE和IgG水平升高有显著的抑制效果。
其中，机体的特异性免疫主要有两类，即体液免疫反应(Th2型)和细胞介导免疫反应(Th1)。Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)可以促进细胞介导免疫反应，有助于机体抵抗肿瘤、细胞内细菌感染和病毒感染。Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6)可以介导体液免疫反应，有助于机体产生特定抗原的抗体，其中，当Th2型免疫过强时，容易诱发机体的自身免疫反应或过敏反应。IFN-γ/IL-4的比值表明Th1/Th2细胞的分化，IFN-γ/IL-4的比值越大，说明反应更倾向于Th1免疫，从而能够在一定程度上抑制Th2型免疫。
根据本发明，所述应用还包括制备用于促进树突状细胞分化和/或降低树突状细胞成熟度的药物和/或食品。其中，本文中，术语“分化”是指由骨髓源单核细胞在相关刺激因子的作用下，分化成树突状细胞(DC)的过程。
人体内大部分树突状细胞处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，未成熟树突状 细胞具有极强的抗原吞噬能力。
优选地，所述树突状细胞为来自骨髓的树突状细胞。
第二方面，本发明还提供了一种功能食品组合物，其中，该功能食品组合物含有保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌的菌体。
优选的，所述副干酪乳杆菌的菌体为副干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体。
本发明的发明人在研究中意外发现，在65-85℃下灭活0.5-1.5h后得到的菌体物质，具有更加显著的对树突状细胞的分化和成熟度进行调节。因此，优选的，当制备用于促进树突状细胞分化和/或降低树突状细胞成熟度的功能食品组合物时，所述功能食品组合物中含有的死菌体为经65-85℃，0.5-1.5h热致死的菌体。
尽管所述功能食品组合物中含有保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌即可实现本发明的目的，即食用后即可对机体的免疫起到调节作用，但优选情况下，相对于每克所述功能食品组合物，所述副干酪乳杆菌的菌体的含量为106-1010CFU时，所述功能食品组合物对机体的免疫调节作用更佳。
第三方面，本发明还提供了一种功能食品组合物的制备方法，该方法包括：将保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。
本发明提供的制备功能食品组合物的方法包括将所述副干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体添加到食物中。
根据本发明，所述副干酪乳杆菌的死菌体的制备方法没有特别的限制，例如，可以将上述培养后的副干酪乳杆菌的活菌体加热致死，也可以将其辐射致死。所述加热致死的条件可以包括：温度为65-85℃，时间为0.5-1.5h。
根据本发明，尽管将所述副干酪乳杆菌的菌体添加到食物中，即可实现本发明的目的，即食用后即可对机体的免疫起到调节作用，但优选情况下，相对于每克所述功能食品组合物，所述菌体物质的添加量为106-1010CFU。 在上述优选情况下，功能食品组合物对机体的免疫调节作用更显著。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量，可以通过平板菌落计数法获得。本发明中，当以上副干酪乳杆菌的死菌体以CFU表示时，是指副干酪乳杆菌的活菌体死亡后得到相应数量的死菌体。
另外，当所述功能食品组合物为液体状态时，菌体物质为106-1010CFU的添加量也可以近似的认为是相对于每mL的液态的功能食品组合物的添加量。
本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。
以下的制备例、实施例和对比例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中所使用的试剂均具有本领域公知的含义，且其配方也为本领域技术人员所公知；
菌实验组所使用的菌株为保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌；
菌对照组所使用的菌株为Lactobacillus paracasei 01，购自科汉森。
实施例1
本实施例说明CGMCC No.9800对过敏反应的影响
1.1 动物模型的建立
实验动物：BALB/c小鼠，雌性，清洁级，6-8周龄，购自北京维通利华 实验动物技术有限公司。饲养于中国农业大学食品学院动物房，保持饲养环境温度25±2℃，每天12h光照交替，标准小鼠饲料喂养，自由饮水。采取随机分组的方法，分别设置空白组(CON)、过敏组(BLG)、菌对照组(D)和菌实验组(A)，每组各8只小鼠。
菌株的培养：保藏编号为CGMCC No.9800和对照用的菌均使用MRS液体培养基进行培养，培养条件为37℃，12小时，培养结束后将菌液4500rpm离心10min收集菌体。然后用无菌生理盐水重悬，调整菌体浓度为1×1010CFU/mL。
过敏组(BLG)、菌对照组(D)和菌实验组(A)的小鼠于第1、7、14、21和28天灌服过敏原β-乳球蛋白BLG(1mg/mL)与霍乱毒素CT(10μg/mL)，0.2mL/只；空白组(CON)小鼠灌服无菌生理盐水0.2mL/只。其中，霍乱毒素CT属于黏膜免疫佐剂，以便于β-乳球蛋白的致敏。
第1至49天，菌对照组(D)每天灌服对照菌株，0.2mL/只，菌实验组每天灌服本发明的保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌，0.2mL/只；空白组与过敏组小鼠灌服无菌生理盐水0.2mL/只。
第50天，过敏组(BLG)、菌对照组(D)和菌实验组(A)小鼠分别灌服50mg/mL BLG 0.2mL/只，激发致敏。空白组小鼠灌服无菌生理盐水0.2mL/只。
激发致敏后的过敏组的小鼠全身肿胀、呼吸减弱、体温下降，空白组小鼠无显著变化，由此证明建模成功。
1.2 ELISA法检测血清中细胞因子水平
末次激发致敏2小时后，对各组小鼠进行内眼窝取血，2000r/min离心10min分离血清，检测血清中组胺、小鼠单核细胞趋化蛋白(mMCP-1)及TGF-β、IL-4和IFN-γ浓度。
各细胞因子的检测按照各自的ELISA试剂盒(R&D公司，Minneapolis,USA)说明书进行操作，结果见表1。
表1
注:表中a,b,c表示差异显著性，字母不同表示差异显著，相同则表示差异不显著(p<0.05)
由表1可以看出，灌服本申请提供的保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌后组胺及mMCP-1的水平相比于过敏组分别下降了23.07％和32.02％，并且下降水平明显高于同属的Lactobacillus paracasei 01，说明保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够有效的缓解由BLG引起的过敏反应，并且缓解效果优于同属的其它菌株。
另外，Th1、Th2细胞的比例与机体内IFN-γ和IL-4的水平密切相关，所以IFN-γ/IL-4可以代表乳酸菌对淋巴细胞Th1/Th2平衡的影响。由表1可知，与过敏组和菌对照组相比，菌实验组小鼠IL-4浓度显著下降(P<0.05)，而IFN-γ分泌明显增高(P<0.05)，因此IFN-γ/IL-4升高，表明保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够纠正过敏机体中淋巴细胞Th1/Th2的失衡，并且纠正水平明显高于同属的其他菌株，从而更有效地对过敏反应进行缓解。
此外，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌还能增加过敏小鼠血清TGF-β水平，TGF-β水平越高，对Th1/Th2的调节越有效。
1.2 流式细胞术检测淋巴中Foxp3+Treg细胞比例
提取各组小鼠肠组织派氏***(PP)和肠系膜***(MLN)中淋巴细胞， 调细胞密度为2×106个/mL。细胞分别与FITC标记的CD4、APC标记的Foxp3抗体反应(4℃避光，30min)。PBS缓冲液清洗后，细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪检测其表面抗原分子的表达情况，分别分析肠组织派氏***(PP)和肠系膜***(MLN)中Foxp3+Treg细胞比例。结果见表2。
表2
| Foxp3+Treg细胞比例(％) | CON | BLG | A | D |
| PP | 2.77±0.11a | 1.64±0.43b | 2.41±0.24ab | 2.05±0.24b |
| MLN | 8.37±0.13a | 6.68±0.40b | 8.32±0.29a | 7.22±0.59ab |
注:表中a,b表示差异显著性，字母不同表示差异显著，相同则表示差异不显著(p<0.05)
由表2可以看出，相比于过敏对照组和菌阳性对照组，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够显著升高Foxp3+Treg细胞比例，Foxp3+Treg细胞为TGF-β细胞因子的分泌细胞。从而更可以看出，保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够有效地调节Th1/Th2的平衡。
1.3 ELISA法检测血清中抗体水平
末次激发致敏2小时后，对各组小鼠进行内眼窝取血，2000r/min离心10min分离血清。检测血清中总IgE和BLG特异性IgE和IgG水平，按照各自的ELISA试剂盒说明书进行操作，结果见表3。
表3
注:表中a,b,c表示差异显著性，字母不同表示差异显著，相同则表示差异不显著(p<0.05)
由表2可以看出，CGMCC No.9800灌服后，过敏小鼠血清中总IgE含 量下降27.61％，同时对过敏诱导的BLG特异性IgE和IgG水平升高有显著的抑制效果。由结果可以看出，CGMCC No.9800可以有效降低过敏相关抗体的产生，且降低效果优于同属的其他菌株。
实施例2
本实施例说明CGMCC No.9800对树突状细胞分化和成熟度的影响
菌株的培养：保藏编号为CGMCC No.9800和对照用的菌均使用MRS液体培养基进行培养，培养条件为37℃，12小时，培养结束后将菌液4500rpm离心10min收集菌体，85℃热致死0.5小时。
2.1 骨髓来源的树突状细胞的制备
取6-8周龄，体重18-22g的BALB/c小鼠，雌雄各半。经脱颈椎处死，立即浸入75％酒精中浸泡5min，于超净台内无菌分离股骨和胫骨，将肌肉和肌腱尽量去除干净后放入pH7.2的无菌PBS缓冲液中。剪掉股骨两端，以无菌注射器吸取1mL pH7.2的RPMI 1640培养液，冲洗骨髓，可冲洗出绝大部分的骨髓细胞。经pH7.4的Tris-NH4Cl裂解红细胞后，悬浮于含有10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，该培养液中还含有重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF，终浓度20ng/mL)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4，终浓度10ng/mL)，37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后倾去悬浮的细胞，更换新的培养液，同时补足rmGM-CSF和rmIL-4，96h后半量换液，在第6d收集疏松贴壁的细胞为小鼠骨髓来源的树突细胞(BM-DCs)。
2.2 诱导BM-DCs细胞因子分泌
用无菌吸管将培养6d的半贴壁的树突细胞轻轻吹下，在300×g条件下离心5min收集细胞，重新悬浮于RMPI 1640完全培养基中，并补足 rmGM-CSF和rmIL-4，调整细胞浓度为1×106个/mL，按每孔1mL的剂量加入到细胞24孔板中，添加牛乳β-乳球蛋白(BLG，终浓度20μg/mL)。然后加入热致死的CGMCC No.9800，浓度分别为106CFU/mL和107CFU/mL，即为菌实验组1和菌实验组2；以加入适量的RPMI1640完全培养液的孔作为空白组；以分别加入106CFU/mL和107CFU/mL的Lactobacillus paracasei01的孔作为菌对照组1和菌对照组2。将6孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h，收集细胞上清液。
使用ELISA试剂盒(R&D公司，Minneapolis,USA)检测细胞培养上清液中IL-10和TGF-β的含量，结果见表4。
表4
注:表中a,b,c表示差异显著性，字母不同表示差异显著，相同则表示差异不显著(p<0.05)
对比空白组，CGMCC No.9800显著提高了细胞上清中IL-10和TGF-β的含量，并且表现出呈剂量效应。IL-10的升高表明保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够降低树突状细胞的成熟度，TGF-β的升高表明保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌能够降促进树突状细胞的分化，且降低效果优于同属的其他菌株。
2.3 诱导BM-DCs分化与成熟
用无菌吸管将培养6d的半贴壁的树突细胞轻轻吹下，在300×g条件下离心5min收集细胞，重新悬浮于RMPI 1640完全培养基中，并补足 rmGM-CSF和rmIL-4，调整细胞浓度为1×106个/mL，按每孔3mL的剂量加入到细胞6孔板中，添加BLG(终浓度20μg/mL)。然后加入热致死的CGMCC No.9800(107CFU/mL)；以加入适量的RPMI1640完全培养液的孔作为空白对照；加入107CFU/mL的Lactobacillus paracasei 01的孔作为菌对照组。将6孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h，300×g条件下离心5min收集细胞用于流式细胞术分析。
加入荧光标记的单克隆抗体CD11c(FITC)，CD103(PE)，MHCII(PerCP-eFluor710)，所加抗体的量根据说明书所提示的量加入，将抗体与细胞悬液混匀后。在4℃下避光反应30min。通过流式细胞仪检测其表面抗原分子的表达情况，结果见表5。
表5
| 组别 | CD11c+CD103+DCs％ | MHC-II％ |
| 空白组 | 0.74±0.10b | 66.76±4.77a |
| 菌实验组 | 2.60±0.47a | 56.6±1.59b |
| 菌对照组 | 0.93±0.27b | 72.94±1.81a |
注:表中a,b表示差异显著性，字母不同表示差异显著，相同则表示差异不显著(p<0.05)
由表5所示，相对于空白组，CGMCC No.9800促进CD11c+CD103+DCs数量增长了2.33倍，表明CGMCC No.9800具有促进骨髓来源的树突细胞分化的作用；相对于空白组，CGMCC No.9800显著降低了MHC-II的表达，表明CGMCC No.9800可以降低BM-DCs的成熟度。并且CGMCC No.9800对骨髓来源的树突细胞的分化和成熟度的调节均优于同属的其他菌株。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)在调节机体免疫功能中的应用，所述应用不包括治疗人体或动物体的疾病。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述应用包括制备用于调节机体免疫功能的药物和/或食品。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述应用包括制备用于预防和/或治疗机体过敏反应的药物和/或食品。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述过敏反应为由β-乳球蛋白引起的过敏反应。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，所述应用包括制备用于促进树突状细胞分化和/或降低树突状细胞成熟度的药物和/或食品。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述树突状细胞为来自骨髓的树突状细胞。
7.一种功能食品组合物，其特征在于，该功能食品组合物含有保藏编号为CGMCC No.9800的副干酪乳杆菌的菌体。
8.根据权利要求7所述的功能食品组合物，其中，所述副干酪乳杆菌的菌体为副干酪乳杆菌的活菌体和/死菌体；优选地，相对于每克所述功能食品组合物，所述副干酪乳杆菌的菌体的含量为106-1010CFU。
9.一种功能食品组合物的制备方法，该方法包括：将保藏编号为CGMCCNo.9800的副干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述副干酪乳杆菌的菌体为副干酪乳杆菌的活菌体和/死菌体；优选地，相对于每克所述功能食品组合物，所述副干酪乳杆菌的菌体的添加量为106-1010CFU。
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