CN102994641A - 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 - Google Patents
一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102994641A CN102994641A CN2012105458676A CN201210545867A CN102994641A CN 102994641 A CN102994641 A CN 102994641A CN 2012105458676 A CN2012105458676 A CN 2012105458676A CN 201210545867 A CN201210545867 A CN 201210545867A CN 102994641 A CN102994641 A CN 102994641A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- dna
- ppe
- plasmid
- quantitative pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括猪胞内劳森氏菌DNA的提取﹑引物设计﹑PCR扩增PPE的aspA基因片段﹑猪增生性肠炎的aspA基因的克隆与鉴定﹑标准质粒模板的制备﹑荧光定量PCR的扩增并获得扩增动力学曲线和标准曲线﹑特异性试验﹑敏感性试验﹑重复性和稳定性试验及临床病料样品检测。本发明方法具有良好的特异性﹑敏感性﹑重复性和稳定性，能够简便﹑快速﹑特异﹑敏感的对临床疑似PPE感染或发病猪进行准确的鉴别诊断和早期感染的检测监控。
Description
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。
背景技术
猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis，PPE）是由猪胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis，LI）引起的猪的接触性传染病。胞内劳森氏菌是一种弯曲的专性胞内寄生菌，主要寄生在猪以及其他动物的回肠、结肠、盲肠部位，造成未成熟的肠道上皮细胞腺瘤样增生。目前，该病已呈全球性流行，隐性感染猪较多，损失易被忽视，亚洲地区的中国、日本、韩国及台湾地区近年来多次发生猪增生性肠炎，猪感染率后，导致顽固性腹泻，造成猪只生长发育迟缓，严重降低饲料报酬率。另外该病经常存在混合感染其它病毒和细菌性疾病，致使临床症状表现更加复杂化，很难做出准确判断，特别是不易与仔猪副伤寒﹑猪传染性胃肠炎（TGEV）﹑猪流行性腹泻（PEDV）腹泻性疾病相区别等。因此，建立有效的鉴别诊断方法和检测***成为进行其他研究的前提条件。
荧光染料定量PCR技术是在反应管中加入荧光染料，这种染料可嵌入双链DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激发产生荧光。随着扩增反应的延伸，荧光信号会因为DNA产物的增加而增加，因此SYBR GreenⅠ荧光信号的积累与扩增出的双链DNA的数量成正相关。目前将该方法应用到猪增生性肠炎胞内劳森氏菌检测上的尝试还不多见，本发明旨在建立针对猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的荧光定量PCR快速检测诊断方法，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持，同时为PPE的分子检测试剂盒的研制打下良好的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR GreenI荧光定量PCR检测方法，该方法具有操作简便，敏感性高，重复性好，污染少，用时短和可自动定量分析等优点，能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持。
本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：
（1）将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS进行研磨，加入浓度均是1000U/ml的青﹑链霉素各1ml，将组织悬液放入-20℃条件下，反复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5min，取上清，加入SDS、蛋白酶K混匀，50℃下裂解1.5h，加入体积比酚:氯仿为1:1的酚和氯仿，使病料组织变性，利于DNA的释放，取下层抽提，取上清液加体积比氯仿:异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇，提取和纯化DNA，去除其它杂质，再抽提1次，取上清液加1/10体积3M/L 的NaAc，2倍体积无水乙醇，于-20℃下沉淀1h，4℃下12000rpm，离心10min，弃上清液，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量ddH2O溶解DNA，于-20℃保存或立即做PCR检测。
（2）根据GenBank中的LI aspA基因（AY280626），设计一对特异性引物，引物序列如下：
PPE-1-F：5--TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG--3
PPE-1-R：5--TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC--3
其中PPE-1-F／R预期扩增片段为227bp。
（3）加入PCR Mix 12.5 μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rnase Free water 8.5 μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收﹑纯化。
（4）将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18- T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定。
（5）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度：102,103,104,105,106,107，将其作为标准质粒模板。
（6）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线。
（7）分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。验证本发明方法的特异性。
（8）将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10-9、10-10、10-11、10-12﹑10-13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性。
（9）将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中方法的稳定性和重复性。
（10）对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。
其中本发明所述步骤6-10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积25uL，其中ddH2O 10.5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，2×One Step SYBR Green I Premix预混酶12.5ul，质粒模板1ul；荧光定量PCR反应条件如下：94℃ 预变性3 min；94℃30 s，56℃30s，72℃30s ，同时在72℃延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s。
其中将提取的质粒经紫外分光光度计量，标准质粒以10倍梯度稀释为1.75×109--1.75×104拷贝/ uL的阳性质粒模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。
其中本发明中Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现出良好的线性关系，相关系数为为R2=0.9979，斜率为-4.0055，截距为41.1919，从而可以得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线方程式：Ct = -4.0055×lgX +41.1919，而待测样品的Ct 值可以从实验结果中直接读取；把待测样品的Ct值代入表达式就可以计算出其初始拷贝数（X）。
其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度Tm为85.0-85.3℃，无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定。
其中分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑PPE阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。这2次扩增PEE质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PEDV﹑大肠杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方法具有较好的特异性。
其中分别进行批内、批间重复试验。批内重复实验验的变异系数CV值平均为0.76%，批间重复实验的变异系数CV值平均为1.41%，表明建立荧光定量检测方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均远小于小于3.0％，批间重复性试验CV值均小于4.0％，试验误差极小，符合统计学规律，充分证实该检测方法具有良好的重复性，这就为PPE在动物体内分布规律即组织嗜性研究、致病机制、PPE早期感染的准确定量研究提供了一种精确、简便、可靠的研究方法
另外PPE荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。在20份疑似PPE病料中，常规PCR检出率为35%，而荧光定量PCR检出率为60%以上，检出率大大高于常规PCR。
附图说明
图1为PPE质粒标准品荧光PCR扩增动力学曲线。
图2为PPE荧光定量PCR标准曲线。
图3为扩增产物的溶解曲线分析。
图4为PPE﹑TGEV、RV、PEDV荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲线。
图5为PPE﹑大肠杆菌、沙门氏菌荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
（1）引物设计
根据根据GenBank登录的LI aspA基因（AY280626），使用Primer5.0分子生物学软件设计1对引物，送上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：
PPE-1-F：5--TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG--3
PPE-1-R：5--TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC--3
其中PPE-1-F／R预期扩增片段为227bp。
（2）DNA模板的提取
将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入适量的PBS进行研磨，加入抗生素（双抗）将组织悬液放入-20℃反复冻融3次，融化后12000 rpm离心5min。取上清进行DNA的提取；取上清537μL，加入60μL10％SDS至浓度为1％，加入3μL20mg/mL蛋白酶K至浓度为100μg/mL，将其混匀，总体积为600μL，50℃，裂解1.5h；加入等体积（600μL）酚:氯仿(取下层)抽提：12000rpm，5min；取上清加等体积氯仿:异戊醇再抽提1次；取上清加1/10体积3M/L NaAc，2倍体积无水乙醇，沉淀DNA：-20℃，1.0h；4℃、12000rpm，离心10min,弃上清，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，（注意：缓慢倒出乙醇，勿将DNA倒掉）室温晾干；加入适量ddH2O溶解DNA，-20℃保存或立即做PCR检测。
（3）RNA模板的提取
分别取300μl的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）病毒液，置于无RNA酶的1.5mlEP管中；在无RNA酶的1.5mlEP管中，加入800μl Trizol裂解液，混匀，静置5min；加入200μl氯仿，振荡混匀，静置15min，4℃，12000rpm 离心15min；管内液体分为三层，取上清550μl，加入等量预冷的异丙醇（-20℃），混匀后-20℃放置30min，12000rpm 离心10min，弃去所有液体；加入1000μl 75%乙醇（预冷）洗涤1－2次，4℃ 8000rpm离心5min；弃上清（离心管在吸水纸上控干），加入20μl DEPC水溶解RNA，-70℃保存或立即使用。
（4）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因PCR扩增
PPE PCR扩增采用25 µL反应体系，其组份如下: PCR Mix 12.5μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rnase Free water 8.5μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环；72℃ 延伸10 min。反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
（5）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因的克隆与鉴定
①将回收纯化的PCR产物与pMD18- T Vector载体相连，连接反应体系为：
将上述反应体系混合均匀后于4℃连接过夜，连接后的产物直接用于转化。
②取50µL感受态细胞，加入连接产物5µL，冰浴30 min，42℃热休克90-120s，冰浴15 min，加入950µL不含抗生素的LB液体培养基，37℃ 250rpm振荡培养45 min至1 h，使菌液复苏并表达抗性，8000rpm离心5 min，弃上清液，加入200µL液体培养基重悬沉淀，再加入4µL IPTG（200mg/mL的异丙基硫代一ß -D半乳糖苷）和20µL X-gal（20mg/mL），混匀，均匀涂布于含50µg/mL Amp的LB固体平板上，37℃培养14-16h。
③上述转化培养的平板中挑取白色单菌落，接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，取1.5 mL菌液12 000rpm离心30s，弃上清液，收集菌体，按质粒提取与回收试剂盒说明书进行质粒的提取，质粒命名为pMD18- T-PPE。
（6）标准品模板的制备
阳性质粒(命名为pMD18- T-PPE) ， 由上海生物工程有限公司测序鉴定。用碱裂解法提取质粒DNA。用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度，参照以下公式计算拷贝数：
经计算得pMD18- T-PPE浓度为1.75×1011copies∕µL，根据得到的结果，将质粒稀释成1.75×109--1.75×104拷贝/ uL，即：1.75×104，1.75×105，1.75×106，1.75×107，1.75×108，1.75×109拷贝∕µL的浓度，作为标准样品模板，进行定量PCR反应，制作标准曲线。
（7）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌SYBR Green I荧光PCR检测
①分别取浓度为1.75×104，1.75×105，1.75×106，1.75×107，1.75×108，1.75×109拷贝∕µL的pMD18- T-PPE重组质粒作为模板进行SYBR Green I荧光PCR扩增，获得扩增动力学曲线和标准曲线（如附图1、附图2），标准曲线的相关系数为0.9979，斜率为-4.0055。
其中PCR扩增体系为：
总反应体积25uL：ddH2O10.5ul,上游引物0.5ul,下游引物0.5ul，2×One Step SYBR Green I Premix预混酶12.5ul，质粒模板1ul。
其反应程序为：
94℃下预变性3min；94℃下30s，56℃下30s，72℃下30s，同时在72℃延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，检测荧光信号，获得扩增产物的溶解曲线（如附图3），标准品的溶解温度都在85.0-85.3℃之间；
②以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑PPE阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，这2次扩增PEE质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PEDV﹑大肠杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方法具有较好的特异性（如附图4、附图5）。
③将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10-9、10-10、10-11、10-12﹑10-13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定量PCR的敏感性。结果显示，当浓度为17.5拷贝∕µL时，仍能够获得S型的荧光曲线。
④批内重复实验验的变异系数CV值平均为0.76%，批间重复实验的变异系数CV值平均为1.41%，表明建立荧光定量检测方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均远小于小于3.0％，批间重复性试验CV值均小于4.0％，误差极小，符合统计学规律，充分证实该检测方法具有良好的重复性（如表1和表2所示）。
表1 荧光定量检测方法批内重复试验
表2 荧光定量检测方法批间重复试验
⑤PPE荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。
表3 PPE荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较
| 样品 | 常规PCR方法电泳结果 | 荧光定量PCR循环阈值 |
| 1# | - | 24.68 |
| 2# | - | 0 |
| 3# | - | 19.75 |
| 4# | + | 18.22 |
| 5# | - | 24.38 |
| 6# | - | 0 |
| 7# | - | 24.05 |
| 8# | + | 26.07 |
| 9# | + | 16.33 |
| 10# | + | 18.19 |
| 11# | + | 17.52 |
| 12# | - | 0 |
| 13# | - | 0 |
| 14# | - | 23.64 |
| 15# | + | 26.87 |
| 16# | - | 0 |
| 17# | - | 0 |
| 18# | + | 20.31 |
| 19# | - | 0 |
| 20# | - | 0 |
| 阳性对照 | + | 16.79 |
| 阴性对照 | - | - |
在20份疑似PPE病料中，常规PCR检出率为35%，而荧光定量PCR检出率为60%以上，检出率大大高于常规PCR（如表3所示）。
Claims (3)
1.一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下:
（1）提取猪胞内劳森氏菌的DNA，制备检测液；
（2）根据GenBank中的LI aspA基因（AY280626），设计一对特异性引物，引物序列如下：
PPE-1-F：5--TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG--3
PPE-1-R：5--TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC--3
其中PPE-1-F／R预期扩增片段为227bp；
（3）加入PCR Mix 12.5 μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rnase Free water 8.5 μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收﹑纯化；
（4）将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18- T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定；
（5）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度：102,103,104,105,106,107，将其作为标准质粒模板；
（6）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线；
（7）分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，,验证本发明方法的特异性；
（8）将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10-9、10-10、10-11、10-12﹑10-13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性；
（9）将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中方法的稳定性和重复性；
（10）对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。
2.根据权利要求1所述的一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于提取DNA的方法为：将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS进行研磨，加入浓度均是1000U/ml的青﹑链霉素各1ml，将组织悬液放入-20℃条件下，反复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5min，取上清，加入SDS、蛋白酶K混匀，50℃下裂解1.5h，加入体积比酚:氯仿为1:1的酚和氯仿，
取下层抽提，取上清液加入体积比氯仿:异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇再抽提1次，取上清液加1/10体积3M/L 的NaAc，2倍体积无水乙醇，于-20℃下沉淀1h，4℃下12000rpm，离心10min，弃上清液，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量ddH2O溶解DNA，于-20℃保存或立即做PCR检测。
3.根据权利要求1所述的一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤6-10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积25uL，其中ddH2O 10.5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，2×One Step SYBR Green I Premix预混酶12.5ul，质粒模板1ul；荧光定量PCR反应条件如下：94℃ 预变性3 min；94℃30 s，56℃30s，72℃30s ，同时在72℃延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105458676A CN102994641A (zh) | 2012-12-14 | 2012-12-14 | 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105458676A CN102994641A (zh) | 2012-12-14 | 2012-12-14 | 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102994641A true CN102994641A (zh) | 2013-03-27 |
Family
ID=47923746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012105458676A Pending CN102994641A (zh) | 2012-12-14 | 2012-12-14 | 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102994641A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105177166A (zh) * | 2015-10-26 | 2015-12-23 | 四川农业大学 | 猪胞内劳森氏菌的lamp与pcr非诊断检测方法 |
| CN107385047A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-24 | 河南农业大学 | 一种用于检测胞内劳森菌的rpa引物及其检测方法 |
| CN110317888A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-10-11 | 云南农业大学 | 一种猫血巴尔通氏体SYBR Green I荧光PCR检测方法及引物 |
| CN113215292A (zh) * | 2021-06-05 | 2021-08-06 | 山东新希望六和农牧科技有限公司 | 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及方法 |
| CN113528683A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-10-22 | 南京农业大学 | 一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453762A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-05-16 | 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 | 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法 |
-
2012
- 2012-12-14 CN CN2012105458676A patent/CN102994641A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453762A (zh) * | 2010-12-31 | 2012-05-16 | 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 | 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105177166A (zh) * | 2015-10-26 | 2015-12-23 | 四川农业大学 | 猪胞内劳森氏菌的lamp与pcr非诊断检测方法 |
| CN107385047A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-24 | 河南农业大学 | 一种用于检测胞内劳森菌的rpa引物及其检测方法 |
| CN110317888A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-10-11 | 云南农业大学 | 一种猫血巴尔通氏体SYBR Green I荧光PCR检测方法及引物 |
| CN113215292A (zh) * | 2021-06-05 | 2021-08-06 | 山东新希望六和农牧科技有限公司 | 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及方法 |
| CN113528683A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-10-22 | 南京农业大学 | 一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100469895C (zh) | 用于乙肝病毒的荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| Hosmillo et al. | Development of universal SYBR Green real-time RT-PCR for the rapid detection and quantitation of bovine and porcine toroviruses | |
| CN102234693B (zh) | 用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法 | |
| CN106916910A (zh) | 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 | |
| CN102994641A (zh) | 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 | |
| CN101979666B (zh) | 快速检测单纯疱疹病毒ⅱ型的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN112941189B (zh) | ***早筛分子标志物znf671基因甲基化检测的引物探针组合物及试剂盒和使用方法 | |
| CN105420373A (zh) | 同时检测三种气单胞菌的多重pcr引物组及探针和检测方法 | |
| CN105624329A (zh) | 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN103725794B (zh) | 检测prrsv的荧光定量rt‑pcr引物、探针及其方法 | |
| CN108913812A (zh) | 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建 | |
| CN103725793A (zh) | 检测prrsv的多重荧光定量rt-pcr方法及其应用 | |
| ITVT20110002A1 (it) | Metodo di determinazione dell'origine di fluidi o tracce biologiche e kit di reagenti per la loro identificazione in un campione. | |
| CN102108405A (zh) | 快速检测***的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN102140549A (zh) | 腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN101705310A (zh) | 猪星状病毒的荧光定量pcr检测方法 | |
| CN103276099A (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
| CN105238880A (zh) | 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒 | |
| CN105567802A (zh) | 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN105506186A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 | |
| CN104342487B (zh) | 支原体核酸恒温扩增方法 | |
| CN101613752A (zh) | 快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN102559861A (zh) | 沙眼衣原体核酸快速检测试剂盒 | |
| CN115976286A (zh) | 一种通用型猪蓝耳病毒检测引物组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN110042175A (zh) | 基于rpa技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130327 |