CN105624329A - 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单纯疱疹病毒1型（humanherpesvirus1，HSV-1）实时荧光核酸恒温扩增检测盒，具体包括：捕获探针、HSV-1引物T7引物和nT7引物、HSV-1检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有单纯疱疹病毒1型的拭子、刮取液、脑脊液样品进行核酸扩增检测，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。

Description

单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒在全球分布广泛，人群中极易感染，潜伏和复发感染者较多，患者和病毒携带者都是该病毒的传染源，病毒可通过呼吸道、口腔、皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体，潜居在人体的正常粘膜、血液、唾液以及感觉神经节细胞内。原发性感染多为隐性，大多无临床症状或者呈亚临床表现，仅少数可出现临床症状。HSV-1型的原发感染常局限在口咽部尤以龈口炎最为多见。临床表现为牙龈和咽颊部成群疱疹、发热、咽喉痛，破溃后形成溃疡。此外还可引起脑炎、皮肤疱疹性湿疹。成人可引起咽炎和扁桃体炎。正常人群中约50%以上人为本病毒的携带者。该病毒可在鸡胚绒毛***上以及人、猴、鸡等的动物培养细胞中大量地增殖。HSV的动物感染宿主较多，包括家兔、豚鼠及小鼠等实验模型生物。HSV在多种细胞中能增殖，常用原代兔肾、人胚肾细胞以及地鼠肾等传代细胞培养分离病毒。

新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染，据相关统计死亡率高达50%，存活者中严重损伤者也超过50%。单纯疱疹病毒通过母体产道感染新生儿，包括皮肤、眼和口腔的局部损伤；脑炎；引起死亡的内脏脓毒血症等感染类型。早期抗感染能够有效的减少死亡率。妊娠妇女感染HSV-1型，病毒有可能经胎盘感染胎儿，会影响胚胎细胞的***和增殖，使之发生先天畸形。早孕时感染会使流产几率增大3倍，孕晚期感染会使早产明显增多，还会引起宫内发育迟缓、智力低下、小头、小眼、心脏异常、肢体畸形或痉挛性瘫痪、脑发育不良、脑积水等。

目前，HSV常用的检查有培养法、Real-TimePCR法、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法非常耗时，设备要求高，而且只能检查有症状的患者，无症状患者样本中，敏感度较低，不足50％，这使得大部分的HSV感染者直接被漏检，而且无法区分HSV-1与HSV-2；细胞学检查，不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，特异性差；酶联免疫法法(ELISA)需要过夜包被抗原，无法达到快速、定量检测的效果；免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度在35％～70％范围，结果判断很大程度依赖的临床主观经验。乳胶凝集试验(LA)敏感性较差。核酸检测主要是Real-TimePCR法，需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的检测试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

目前单纯疱疹病毒1型产品大部分选用单纯疱疹病毒1型的糖蛋白G（US4）的部分基因序列作为检测的靶标序列，作为HSV的保守区域，在此区域设计能够检测，并区分HSV两个亚型（1型与2型）；Gen-probe公司曾选用前体mRNA序列（US8.5转录）进行设计，其保守型较好，能有效区分HSV两种亚型，而且在发病前期前提mRNA异常活跃的，有助于病原体的低量检测。但两种方法都有一个共同的问题，GC含量较高。将荧光定量PCR技术应用于HSV-DNA检测的关键技术在于引物和荧光探针的设计，普通探针设计由于GC含量太高（70%以上），导致探针TM值太高，易形成非特异结合，导致假阳性，大大影响了检测的准确性。而本发明是由发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，选择了US5基因的mRNA作为检测靶标，开发出高特异性，高灵敏的专用引物对和探针。其DNA序列保守性较好，GC含量较低（45%左右），能够有效的避免GC含量过高带来的检测假阳性问题，有效提高检测的准确性，对HSV两个亚型以及其他感染部位相同和症状相似的病毒有较好的区分度。

本发明的目的是提供一种快速，高灵敏度、高特异性，污染易控，设备简单，成本低的HSV-1mRNA扩增检测试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的HSV-1的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的检测引物T7和nT7，和一条用于所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针。

进一步，所述的试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HSV-1检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5'端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

再进一步，所述的试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

更进一步，所述的试剂盒还包含有HSV-1内标和内标检测探针；所述HSV-1内标为单纯疱疹病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5'端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

具体的，所述的试剂盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HSV-1扩增检测液、SAT酶液、HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照、HSV-1内标，其中：

裂解液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES；

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

HSV-1扩增检测液：含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HSV-1检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

HSV-1阳性对照；含单纯疱疹病毒1型US5基因核酸的稀释物或者单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物，所述单纯疱疹病毒1型的体外转录RNA序列为序列8所示；

HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

HSV-1内标：HSV-1ICRNA的稀释物。

再具体的，所述的试剂盒中一个反应单位的各种试剂组成如下：

（1）裂解液：25-250mMHEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄；

（2）病毒核酸提取液：HEPES250-800mM，LLS4-10%，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

（3）洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

（4）HSV-1扩增检测液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10%，KCl5-40mM，HSV-1引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（5）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mMEDTA、0.1-1%(v/v)TritonX-100和20-50%(v/v)glycerol；

（6）HSV-1阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL单纯疱疹病毒1型US5基因核酸稀释液或含单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物；

（7）HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

（8）HSV-1内标：含10⁴-10⁸拷贝/mLHSV-1ICRNA的稀释物。

更具体的，所述的试剂盒，其HSV-1扩增检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HSV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。

更为具体的，所述单纯疱疹病毒1型核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

（1）用于扩增HSV-1靶标核酸的HSV-1检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

（2）用于与在T7RNA聚合酶作用下HSV-1靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针，所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5'端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

（3）用于与HSV-1核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有HSV-1检测相比，具有以下优点：

（1）本发明试剂盒针对HSV-1的US5基因进行靶标筛选、引物设计，具有高准确度、高特异性，可以实现对拭子、刮取物、脑脊液等样本中的单纯疱疹病毒1型进行快速、准确测定；

（2）本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果；

（3）本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本；

（4）本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图3为特异性样本的靶标荧光检测结果；

图4为特异性样本的内标荧光检测结果；

图5为临床样本检测的靶标荧光检测结果；

图6为临床样本检测的内标荧光检测结果。

具体实施方式

HSV包含多个基因型，本发明人经过长期而深入的研究与对比，选择单纯疱疹病毒1型US5基因的保守区域片段作为检测靶标，再经过大量筛选和验证，开发了高特异性，高灵敏的专用引物对，和相应的检测探针，使用该特定的引物序列可对单纯疱症病毒1型的核酸同时进行扩增，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测单纯疱疹病毒1型。

引物和探针

如本文所用，术语“扩增单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的特异性引物”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的mRNA链。

在引物设计上，为了能够更好地满足目前对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）检测的需要，本发明人选择了HSV-1病毒的US5基因中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)。优选的引物序列包括如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4组成的引物对。

在本发明的扩增方法中，除引物外，反应体系中还可以包括一个或多个探针，如检测探针，捕获探针等。

如本文所用，术语“单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的捕获探针”指可与单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶标核酸(HSV-1RNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶标核酸(HSV-1RNA)序列。在另一优选例中，当所述单纯疱疹病毒1型（HSV-1）含有HSV-1内标(HSV-1ICRNA)时，所述捕获探针还可以与所述HSV-1内标序列特异结合，用于设计阴性对照组。

HSV-1检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的一种优选的检测探针具有如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。

本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的专用引物和探针序列。

对照物

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

本发明中可以设置的参照物包括：HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照和HSV-1内标中的一个或多个对照物。

HSV-1阳性对照可以是为体外转录的RNA，也可以是单纯疱疹病毒1型双链DNA。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

HSV-1内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。HSV-1内标作为HSV-1RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

在另一优选例中，所述体外转录的HSV-1RNA通过以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成HSV-1US5基因片段(HSV-1阳性片断，其核苷酸序列如序列表中序列1所示)；

(2)将HSV-1US5基因片段***到pGEM?-T载体中，构建HSV-1阳性对照质粒；

(3)HSV-1阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM?-T-HSV-1菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM?-T-HSV-1菌株中提取pGEM?-T-HSV-1质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

在另一优选例中，所述HSV-1内标中的体外转录的HSV-1ICRNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HSV-1靶标序列区域(HSV-1内标片断，其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

(2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建HSV-1内标质粒；

(3)HSV-1内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM?-T-HSV-1IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM?-T-HSV-1IC菌株中提取pGEM?-T-HSV-1IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

试剂盒

本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型的核酸检测试剂盒，包括：

捕获探针，一对扩增单纯疱疹病毒1型的特异性T7和nT7的引物对，以及一条检测探针。

所述的捕获探针（TCO，TargetCaptureOligo），可与单纯疱疹病毒1型的靶标核酸序列特异结合，在有HSV-1内标时，其还可与该HSV-1内标序列特异结合；所述捕获探针，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，所述引物对是一对产生HSV-1靶标核酸的检测引物，由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示。

所述检测探针是一条根据所述HSV-1靶标核酸产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，5'端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，试剂盒还包括：一条内标检测探针和HSV-1内标，HSV-1内标为单纯疱疹病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，在扩增体系引入内标，可以预防由于样本中可能存在的干扰物质导致的假阴性，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5'端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HSV-1扩增检测液、SAT酶液、稀释液、HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照、HSV-1内标和稀释液，各组分说明如下：

（1）裂解液：为表面活性剂，含5-50mM(NH₄)₂SO₄和25-250mMHEPES的水溶液。

（2）病毒核酸提取液：用于提取和纯化单纯疱疹病毒1型核酸DNA和RNA，为含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

（3）洗涤液：用于磁珠水相清洗，NaCl50-500mM和1wt%SDS的水溶液；

（4）HSV-1扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP0.1-10mM、NTP1-20mM、引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；

（5）SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应；

（6）HSV-1阳性对照：含单纯疱疹病毒1型US5基因核酸的稀释液或单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物，所述单纯疱疹病毒1型体外转录RNA序列如序列8所示；

（7）HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

（8）HSV-1内标：10⁴-10⁸拷贝/mlHSV-1ICRNA的稀释物；

在优选例中，所述试剂盒中HSV-1扩增检测液中的T7引物5pmol/反应、nT7引物5pmol/反应、HSV-1检测探针5pmol/反应和内标检测探针5pmol/反应，其他不变。

与现有的HSV-1检测相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对HSV-1靶核酸设计的低GC含量的引物和探针，可高效、特异性扩增形成HSV-1的RNA拷贝，由于采取封闭式的恒温放大检测***，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要40分钟。

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够检测疱疹溃疡部位刮片或生殖泌尿道分泌物棉拭子或脑脊液中的HSV-1核酸，具有特异性高、灵敏度高(可达50copies/mL)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(40分钟完成扩增检测)的特点，将在单纯疱疹病毒1型早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1用于实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的专用引物和探针的设计

本发明选择HSV-1US5基因中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQIDNo.:1所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的靶标核酸(HSV-1RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，TargetCaptureOligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为:5’TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’(SEQIDNo.:2)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HSV-1靶标核酸(HSV-1RNA)的DNA拷贝的HSV-1扩增引物，所述HSV-1扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGACGATAGTGTC

ACACGGCCGGGCTA3'(SEQIDNo.:3)，nT7引物序列为5’CCAAACCATGTCCGGCAGG3’(SEQIDNo.:4)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述HSV-1靶标核酸(HSV-1RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针，所述HSV-1检测探针的核苷酸序列为5'CACCGGGCUAACCAGGAAAUCGGUG3’(SEQIDNo.:5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，如选自HSV的US4基因保守区域进行引物、探针序列筛选获得：T7引物序列：5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGGCTACCGCGATCT

TTATTG3'，nT7引物序列：5'CCGGCAGGGGGATGGGGGG3’，检测探针序列为5’CGACCACCGAGCUAACCAGGGUCG3’，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。将上述各序列用专利200810111479.0中所述的反应体系进行扩增，比对5个梯度的灵敏度检测并选取较优者。

结果如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)，从结果可看出，比对组的灵敏度仅在100copies/反应时得出检测结果，而本发明组的灵敏度至少提高了二个数量级，可达1copies/反应或更低。从曲线形状可明显看出，本发明组优于比对组。

通过筛选、比对各设计引物对、探针序列，可挑选出检测灵敏度高的最佳引物、探针序列作为本发明相应序列。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的HSV-1内标(SEQIDNo.:6)，设计了内标检测探针，HSV-1内标与HSV-1靶标核苷酸拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述HSV-1内标可通过HSV-1靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与HSV-1检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5'CCGACAGUGAUACGAGAGTCGG3’(SEQIDNo.:6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2制备单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，TargetCaptureOligo)、T7引物、nT7引物、HSV-1检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等组分，其中：

捕获探针核苷酸序列为SEQIDNO:2、T7引物序列SEQIDNO:3、nT7引物序列为SEQIDNO:4、检测探针核苷酸序列为SEQIDNO:5。

所述的捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和HSV-1检测探针存在于HSV-1扩增检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中。具体地将，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HSV-1扩增检测液、SAT酶液、HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照，具体为：

裂解液：含5-50mM(NH₄)₂SO₄和25-250mMHEPES的水溶液;

病毒核酸提取液：含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

洗涤液：含NaCl50-500mM和1wt%SDS的水溶液；

HSV-1扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP0.1-10mM、NTP1-20mM、HIV-1引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；

SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应；

HSV-1阳性对照；含单纯疱疹病毒1型US5基因核酸的稀释物或者单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物；

HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

再具体的，本试剂盒组成如下：

（1）裂解液：25-250mMHEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄；

（2）病毒核酸提取液：HEPES250-800mM，LLS4-10%，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

（3）洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

（4）HSV-1扩增检测液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10%，KCl5-40mM，HSV-1引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（5）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mMEDTA、0.1-1%(v/v)TritonX-100和20-50%(v/v)glycerol；

（6）HSV-1阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL单纯疱疹病毒1型US5基因核酸稀释液或含单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物；

（7）HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液。

实施例3试剂盒的特异性检测

用本发明制成的试剂盒检测与单纯疱疹病毒1型分类近似、症状类似、易发生交叉反应的微生物进行特异性检测，具体1-9号样本为水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒（EBV）、巨细胞病毒(CMV）、猿猴B病毒（simianherpesBvirus）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、人***瘤病毒（HPV）、沙眼衣原体（CT）、淋病奈瑟菌（NG）、***（UU）。试剂盒组成及具体方法如下：

1、对照品准备

1.1内标：取400μL稀释液，加入10μLHIV-1内标（10⁵HSV-1ICRNA稀释物），混匀备用。

1.2阳性对照：取250μL阴性对照，加入10μL阳性对照品（10⁶拷贝/mL单纯疱疹病毒1型体外转录RNA的稀释物），混匀备用。

1.3阴性对照：取250μL阴性对照（生理盐水）备用。

2、核酸提取

2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200μl裂解液(HEPES50mM，(NH₄)₂SO₄35mM)和200μl待测样本(不足以生理盐水补足)。

2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100μl核酸提取液(HEPES200mM，EDTA100mM，LiCl800mM，捕获探针15μΜ，磁珠150mg/L)和10μl内标溶液，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES25mM，NaCl150mM，1%SDS，EDTA2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

在上述检测操作中，所述步骤2.1中的待测样品为实验动物细胞培养物。

3、SAT核酸扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。HSV-1扩增反应液具体包含Tris15mM，MgCl₂15mM，dNTP2.5mM，NTP3mM，PVP401%，KCl10mM；HSV-1检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HSV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用ABI7500型PCR仪60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7RNA聚合酶1000U/反应、10mMHEPESpH7.5、15mMN-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mMzincacetate(乙酸锌)、20mMtrehalose(海藻糖)、100mMTris-HClpH8.0、80mMKCl、0.25mMEDTA、0.5%(v/v)TritonX-100和30%(v/v)glycerol(丙三醇)。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪)，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

①阳性结果判定：

F1通道：dt≤35的样本为阳性。

②阴性结果判定：F1通道dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35，则为阴性。

从图3、图4检测结果可见，除阳性对照外，1-9号、阴性对照的扩增曲线（F1荧光通道）皆为阴性，并且相应内标（F2荧光通道）都出现扩增信号，表明检测样本不受反应体系抑制，结果可靠，可明确与水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、猿猴B病毒、单纯疱疹病毒2型、人***瘤病毒、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、***区分，本发明试剂盒特异性好。

实施例4临床样本的实时荧光核酸恒温扩增检测

用实施例3中所用试剂盒检测7个临床样本中的HSV-1，同步比对传代细胞培养，样本包括2个疱疹溃疡部位刮片（样本1^#、2^#）、1个男性生殖道分泌物拭子（3^#）、1个脑脊液样本（4^#）、1个女性生殖道分泌物拭子（5^#）、2个女性尿道分泌物拭子（6^#、7^#）。SAT检测的具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

样本采集

1.1疱疹溃疡部位刮片：用刮片刮取溃疡病灶处脱落细胞，置入无菌玻璃管，密闭送检。

1.2男性生殖泌尿道分泌物棉拭子：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便)。

1.3女性生殖道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子***宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

1.4女性尿道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子***尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

1.5脑脊液：按常规标准方法抽取脑脊液0.5-1ml，加入无菌离心管，密闭送检。

标本运输和保存

所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，-20℃保存期为6个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用0℃冰壶。

核酸提取、SAT扩增检测及结果判断同实施例3。

根据图5(F1荧光通道)和图6(F2荧光通道)检测结果确定，样本1、3、4、6、7为阳性，样本2、5为阴性，与传代细胞培养结果一致，表明本发明试剂盒可用于多类型单纯疱疹病毒1型的检测，且产品准确性高，上机扩增检测时间仅需40分钟，具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

SEQUENCELISTING

<110>上海仁度生物科技有限公司

<120>单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

<130>

<160>9

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>384

<212>DNA

<213>humanherpesvirus1

<400>1

gcgttaccatccctacatggacccagttgtcgtataatttcccccccccccccccttctc60

cgcgtgggtgatgtcgggtccaaactcccgacaccaccagctggcatggtataaatcacc120

ggtgcgccccccaaaccatgtccggcagggggatgggggggcgaatgcggagggcaccca180

acaacaccgggctaaccaggaaatccgtggccccggcccccaataaagatcgcggtagcc240

cggccgtgtgacactatcgtccataccgaccacaccgacgaatcccccaagggggagggg300

ccattttacgaggaggaggggtataacaaagtctgtctttaaaaagcaggggttagggag360

ttgttcggtcataagcttcagcgc384

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>捕获探针序列

<400>2

tgcacaccggatggccaatccaataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa54

<210>3

<211>53

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>T7引物序列

<400>3

aatttaatacgactcactatagggagagacgatagtgtcacacggccgggcta53

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>nT7引物序列

<400>4

ccaaaccatgtccggcagg19

<210>5

<211>25

<212>RNA

<213>Unknown

<220>

<223>检测探针序列

<400>5

caccgggcuaaccaggaaaucggug25

<210>6

<211>381

<212>RNA

<213>Unknown

<220>

<223>内标RNA序列片段

<400>6

gcguuaccaucccuacauggacccaguugucguauaauuucccccccccccccccuucuc60

cgcgugggugaugucggguccaaacucccgacaccaccagcuggcaugguauaaaucacc120

ggugcgccccccaaaccauguccggcagggggaugggggggcgaaugcggagggcaccca180

acaacaccgagugauacgagaccguggccccggcccccaauaaagaucgcgguagcccgg240

ccgugugacacuaucguccauaccgaccacaccgacgaaucccccaagggggaggggcca300

uuuuacgaggaggagggguauaacaaagucugucuuuaaaaagcagggguuagggaguug360

uucggucauaagcuucagcgc381

<210>7

<211>22

<212>RNA

<213>Unknown

<220>

<223>内标探针序列

<400>7

ccgacagugauacgagagucgg22

<210>8

<211>384

<212>RNA

<213>Unknown

<220>

<223>靶标RNA序列

<400>8

gcguuaccaucccuacauggacccaguugucguauaauuucccccccccccccccuucuc60

cgcgugggugaugucggguccaaacucccgacaccaccagcuggcaugguauaaaucacc120

ggugcgccccccaaaccauguccggcagggggaugggggggcgaaugcggagggcaccca180

acaacaccgggcuaaccaggaaauccguggccccggcccccaauaaagaucgcgguagcc240

cggccgugugacacuaucguccauaccgaccacaccgacgaaucccccaagggggagggg300

ccauuuuacgaggaggagggguauaacaaagucugucuuuaaaaagcagggguuagggag360

uuguucggucauaagcuucagcgc384

<210>9

<211>381

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>内标DNA片段序列

<400>9

gcgttaccatccctacatggacccagttgtcgtataatttcccccccccccccccttctc60

cgcgtgggtgatgtcgggtccaaactcccgacaccaccagctggcatggtataaatcacc120

ggtgcgccccccaaaccatgtccggcagggggatgggggggcgaatgcggagggcaccca180

acaacaccgagtgatacgagaccgtggccccggcccccaataaagatcgcggtagcccgg240

ccgtgtgacactatcgtccataccgaccacaccgacgaatcccccaagggggaggggcca300

ttttacgaggaggaggggtataacaaagtctgtctttaaaaagcaggggttagggagttg360

ttcggtcataagcttcagcgc381

Claims (8)

1.一种单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的HSV-1的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的检测引物T7和nT7，和一条用于所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HSV-1检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有HSV-1内标和内标检测探针；所述HSV-1内标为单纯疱疹病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

5.根据权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HSV-1扩增检测液、SAT酶液、HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照、HSV-1内标，其中：

裂解液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES；

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

HSV-1扩增检测液：含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HSV-1检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

HSV-1阳性对照；含单纯疱疹病毒1型US5基因核酸的稀释物或单纯疱疹病毒1型的体外转录RNA稀释物，所述单纯疱疹病毒1型的体外转录RNA序列为序列8所示；

HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

HSV-1内标：HSV-1ICRNA的稀释物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

（1）裂解液：25-250mMHEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄；

（2）病毒核酸提取液：HEPES250-800mM，LLS4-10%，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

（3）洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

（4）HSV-1扩增检测液：Tris10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10%，KCl5-40mM，HSV-1引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（5）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mMEDTA、0.1-1%(v/v)TritonX-100和20-50%(v/v)glycerol；

（6）HSV-1阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL单纯疱疹病毒1型US5基因核酸的稀释物或单纯疱疹病毒1型的体外转录RNA的稀释物

（7）HSV-1阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒1型的溶液；

（8）HSV-1内标：含10⁴-10⁸拷贝/mLHSV-1ICRNA的稀释物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述HSV-1扩增检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HSV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。

8.权利要求1至7任一所述单纯疱疹病毒1型核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

（1）用于扩增HSV-1靶标核酸的HSV-1检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

（2）用于与在T7RNA聚合酶作用下HSV-1靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针，所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

（3）用于与HSV-1核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。