CN101376878A - 猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株及由其制备的灭活疫苗 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株及由其制备的灭活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus)TJ株，其微生物保藏号是CGMCC NO.2129，公开了由该毒株制备的灭活疫苗及其制备方法。本发明猪繁殖与呼吸综合症病毒灭活疫苗具有良好的免疫保护效力，可有效预防猪繁殖与呼吸综合症。

Description

猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株及由其制备的灭活疫苗
技术领域
本发明涉及一种病毒毒株，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株。本发明还涉及由该猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株制备得到的灭活疫苗及其制备方法；属于动物疫苗领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)所引起的一种新的传染病，以母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道疾病和高死亡率为主要特症。该病1987年在北美首次爆发，迅速在全球蔓延，给世界养猪业造成严重的经济损失。在中国，PRRS的流行和分布也日益广泛，危害日趋严重。尤其是2006年，我国南方一些猪场暴发了被称为“无名高热”的疫病，对当地的养猪业造成了巨大的危害和恐慌。现已证实引起该无名高热病的主要病原为变异了的PRRSV，并将“无名高热”命名为“高致病性蓝耳病”。高致病性蓝耳病的暴发再次给人们敲响了警钟，如何快速、有效的控制疫情，最大限度降低经济损失已成为摆在人们面前亟待解决的问题。
国内外防治经验表明，疫苗免疫是防制该病和避免造成巨大经济损失的主要措施。目前，已有多种减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗问世，在PRRS的防制中发挥了重要作用。但国外研究表明，美国及其他北美洲国家最近爆发的由新出现的PRRSV毒株引起的非典型性和急性PRRS，用当前的疫苗并不能提供有效的保护。
为有效防止高致病性蓝耳病在我国乃至世界范围的蔓延，目前迫切需要能够有效预防引起所述病症的PRRS病毒疫苗。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的猪繁殖与呼吸综合症病毒毒株，由该毒株所制备的灭活疫苗能够有效预防猪繁殖与呼吸综合症。
本发明人从天津一发生高热的猪场病死猪所采病料中分离到一株PRRSV，经RT-PCR检测为PRRSV美洲型，将所分离病毒细胞培养物回归到动物产生PRRS特异性临床症状，高热，皮肤潮红，食欲减退，精神沉郁，后肢跛行甚至瘫痪，发病率100％。且从试验动物体内再次分离到该病毒。将所分离的毒株扩增后测序，基因序列分析结果表明，其基因组全长为15324bp(包括PolyA尾)(其基因序列见SEQ IDNO.1)，与PRRSV美洲型标准株(VR2332)和欧洲型标准株(LV)全基因序列同源性分别为89.7％、61.8％(PRRSV为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。病毒有囊膜、呈球形，基因组为单股正链RNA，大小约15kb，分为欧洲型和美洲型)；与其它具有代表性PRRSV比较表明，其Nsp2和GP5基因变异最大。序列分析表明该毒株为发生了变异的PRRSV，Nsp2与GP5基因同美洲标准毒株VR2332相比，核苷酸同源性分别为83.7％、89.2％，其编码的氨基酸同源性分别为77.9％，87.9％，本发明将所分离的毒株命名为猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV)TJ株，将该猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株毒株提交保藏，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2129；保藏时间：2007年8月9日；分类命名是：猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用上述猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)TJ株制备灭活疫苗的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种用上述猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株制备灭活疫苗的方法，包括：将本发明的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株进行大规模培养，收获病毒液，将病毒液灭活后制成水相，将水相与油相乳化后，即得。
上述制备方法中，优选的：所述的病毒液按照下述方法制备：培养Marc-145细胞；将本发明的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株经连续传代和多次噬斑克隆纯化后以感染剂量(MOI)接种到Marc-145细胞上进行培养，收获病毒液；更优选的，将本发明的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株经连续传代和多次噬斑克隆纯化后以感染剂量(MOI)0.01-0.5接种到Marc-145细胞上进行培养，培养3-5天，当细胞病变达到80％时收获病毒液；
优选的，所述的Marc-145细胞按照以下任意一种方法培养得到：(1)在转瓶中培养Marc-145细胞，使其细胞密度达到5-10×107/ml；(2)在生物反应器中添加附着载体的悬浮培养或无载体的悬浮培养，使其细胞密度达到5-10×107/ml--5-10×108/ml；(3)将Marc-145细胞在无血清或1-5％的低浓度血清中悬浮培养。
优选的，所述的油相按照以下方法制备：向65-90体积份注射用白油中加入5-15体积份司班80和5-25体积份吐温80，随加随搅拌至透明为止，灭菌后，备用。
优选的，所述的乳化方法包括以下步骤：取水相放于乳化缸内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入油相，加完后再以10000r/min～15000r/min搅拌10～30分钟，在终止搅拌前加入10％(W/V)硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％(W/V)。
优选的，所述的病毒液灭活方法是：向病毒液中加入二乙烯亚胺至终浓度为1mM-3mM，在37℃条件下灭活4-28h，将灭活后的病毒液用硫代硫酸钠中和。
本发明方法所制备得到的灭活疫苗以3000r/min离心15分钟，无分层现象，表明本发明方法所制备的疫苗乳化效果好。
目前国内灭活苗制备几乎都用甲醛作为灭活剂，本发明人经过多次试验，发现采用BEI灭活病毒制备抗原，经检验是安全有效的，克服了甲醛作为灭活剂副作用大、灭活效果不彻底的缺点。
本发明方法所制备的疫苗为水包油型疫苗，克服了国内油包水型疫苗副作用大、注射难的缺点，乳化效果较好，同时也大大降低了成本，且易注射，副反应小，这对我国疫苗产业将会产生积极的推动作用。
本发明在用所分离的PRRSV TJ株制备灭活疫苗的同时，将其在Marc-145细胞上进行连续传代，每5代进行一次病毒噬斑分离，使其弱化成为细胞适应毒，再将所得到的弱毒疫苗株按照常规的弱毒疫苗制备方法可制备得到预防猪繁殖与呼吸综合症的弱毒疫苗。
附图说明
图1  PRRSV TJ株RT-PCR检测结果；M为Maker DL2000，1、2为分离样品，3、4为PRRSV美洲株阳性对照。
图2  PRRS病毒灭活动力学曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1  PRRSV TJ毒株的分离、获得
从天津一发生高热的猪场病死猪所采病料中分离到一株病毒，经Marc-145细胞盲传2代呈特症性PRRS细胞病变，经RT-PCR检测，2个样品均扩出了433bp和468bp的目的片段，证明该分离株为美洲型(见图1)。将所分离病毒细胞培养物回归到动物产生PRRS特异性临床症状，高热，皮肤潮红，食欲减退，精神沉郁，后肢跛行甚至瘫痪，轻度呼吸困难，发病率100％。从试验动物体内再次分离到该病毒，对其GP5和Nsp2基因进行扩增测序，结果表明该毒株为发生了变异的PRRSV，将该毒株命名为PRRSV TJ株，该毒株的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，将该毒株提交保藏，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2129。
实施例2  病毒的纯化分离
将PRRSV TJ株作10倍系列稀释，稀释度范围为10-2-10-6，稀释后接种长满单层Marc-145细胞的6孔细胞培养板，1ml/孔，吸附1h，弃病毒液，用无血清的MEM清洗2次，加入2×营养液与灭菌琼脂液的混合液，3ml/孔，室温冷却后置于37℃5％ CO2培养箱培养3-4d，观察噬斑，挑取噬斑较少孔内的单个噬斑进行传代。
实施例3  PRRSV灭活及灭活效果检验
(一)、PRRSV灭活
(1)细胞培养：在转瓶中培养Marc-145细胞，使其细胞密度达到5-10×107/ml；
(2)病毒接种：以感染剂量(MOI)为0.01-0.5将本发明PRRSV TJ株接种到步骤(1)所培养的Marc-145细胞中，培养3-5天，当细胞病变达到80％时收获病毒液；
(3)向步骤(2)所收获病毒液中加入BEI，终浓度分别为1mM、2mM和3mM，使其充分混合，然后置于37℃进行灭活，加入BEI前(0h)及加入BEI后30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，28h分别收集样品(10ml/次)，所收集样品用于病毒效价测定，绘制灭活动力学曲线。确定BEI终浓度及最佳灭活时间，病毒灭活动力学曲线见图2。
(二)、PRRSV灭活效果检验
PRRSV灭活后要进行灭活效果检验以确保PRRSV灭活彻底。
取生长良好长满90％单层Marc-145细胞的转瓶4个，其中2瓶接种步骤(一)所制备的灭活病毒液25ml，其余1瓶为阴性对照，另1瓶为阳性对照。于37℃培养5d。观察CPE，如检测瓶和阴性对照瓶无CPE，而阳性对照瓶出现典型的PRRSV病变，进行第二次盲传。收获转瓶内液体，冻融后接入相应的方瓶内，每瓶15ml，于37℃培养5d。观察CPE，如结果同上则认为病毒液灭活完全。
经检验，步骤(一)所制备的灭活病毒液，其病毒灭活完全。
实施例4  PRRSV灭活疫苗制备
将实施例2所灭活的病毒液进一步经过如下处理：
1)制备水相：取生理盐水适当量份，加入实施例2所制备的灭活的病毒(抗原)液适当量，充分摇振，使其混合均匀，得水相，备用；
2)制备油相：向65-90体积份注射用白油中加入5-15体积份司班80和5-25体积份吐温80，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌20分钟，得油相，备用；
3)取水相放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入油相，加完后再以10000r/min～15000r/min搅拌10～30分钟，在终止搅拌前加入10％(W/V)硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％(W/V)，即得。
乳化后，取10ml所制备的疫苗，以3000r/min离心15分钟，无分层现象。
实施例5  PRRS灭活疫苗安全性试验
取实施例4所制备的PRRS灭活疫苗3批，经颈部肌肉注射3-5周龄PRRS阴性猪，分别进行单剂量，单剂量重复接种和一次超剂量接种，2ml/剂量，15头猪/组。注苗后28天，观察接种部位，无不良反应。试验结果说明本发明PRRS灭活疫苗对免疫动物是安全的。
      表1 疫苗注射PRRS阴性猪的安全性试验结果
Figure A200710121202D00081
实施例6  PRRS灭活疫苗效力试验
试验共使用30-35日龄健康PRRS阴性断乳仔猪10头，试验分为2组，每组5只动物。
第一组(免疫组)免疫接种实施例4所制备的PRRS灭活疫苗，剂量为2ml/头猪，106.0TCID50/头份/2ml，颈部肌肉注射；
第二组为对照组，接种2ml Marc-145对照细胞培养液的乳化对照疫苗，2ml/头份。
免疫后观察动物临床反应及疫苗副作用，每周采血、分离血清、用于病毒分离和血清抗体检测；每周测量体重。
免疫后4周两组动物使用10-3稀释的PRRSV TJ株检验用强毒(效价为105.8TCID50/ml)攻击，攻击剂量为2ml病毒液/头猪，鼻内接种，1ml/鼻孔。动物接种强毒后，每天观察临床症状，包括食欲、精神状态等；每天测定直肠体温；每2天采血分离血清，用于病毒分离测定；试验于病毒接种后42天结束，试验结束前采血分离血清作中和及其它血清学测定。
试验结果：
1、疫苗接种后两组试验动物增重无明显差异；
2、攻毒后，免疫组2头猪发病，表现体温升高，食欲减退，皮肤潮红，精神沉郁，后肢跛行甚至瘫痪，发病率40％，其余3头表现正常；对照组5头猪全部发病，发病率为100％。
试验结果说明，本发明疫苗对于强毒的攻击，其保护率可达到60％，可有效预防猪繁殖与呼吸综合症病毒。
实施例7  PRRSV TJ毒株的弱化
在用所分离的PRRSV TJ株制备灭活疫苗的同时，将其在Marc-145细胞上进行连续传代，每5代进行一次采用噬斑分离纯化病毒，使其弱化成为细胞适应毒，再将该弱毒株按照弱毒疫苗的常规制备方法制备得到弱毒疫苗。

Claims (11)

1、猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproduct ive and RespiratorySyndrome Virus)TJ株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2129。
2、按照权利要求1的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株，其特症在于：该毒株的基因序列为SEQ ID NO:1所示。
3、一种制备预防猪繁殖与呼吸综合症的灭活疫苗的方法，包括：将权利要求1的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株进行大规模培养，收获病毒液，将病毒液灭活后制成水相，将水相与油相乳化后，即得。
4、按照权利要求3的方法，其特症在于，所述的病毒液按照下述方法制备：培养Marc-145细胞；将权利要求1的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株经连续传代和多次噬斑克隆纯化后以感染剂量(MOI)接种到Marc-145细胞上进行大规模培养，收获病毒液。
5、按照权利要求4的方法，其特症在于：将权利要求1的猪繁殖与呼吸综合症病毒TJ株经连续传代和多次噬斑克隆纯化后以感染剂量(MOI)0.01-0.5接种到Marc-145细胞上进行培养，培养3-5天，当细胞病变达到80％时收获病毒液。
6、按照权利要求4的方法，其特症在于，所述的Marc-145细胞按照以下任意一种方法培养得到：(1)在转瓶中培养Marc-145细胞，使Marc-145细胞密度达到5-10×107/ml；(2)在生物反应器中添加附着载体的悬浮培养或无载体的悬浮培养，使Marc-145细胞密度达到5-10×107/ml--5-10×108/ml；(3)将Marc-145细胞在无血清或1-5％的低浓度血清中悬浮培养。
7、按照权利要求3的方法，其特症在于，所述的油相按照以下方法制备：向65-90体积份注射用白油中加入5-15体积份司班80和5-25体积份吐温80，随加随搅拌至透明为止，灭菌后，备用。
8、按照权利要求3的方法，其特症在于，所述的乳化包括以下步骤：取水相放于乳化缸内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入油相，加完后再以10000r/min～15000r/min搅拌10～30分钟，在终止搅拌前加入10％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。
9、按照权利要求3的方法，其特症在于，所述的病毒液灭活方法是：向病毒液中加入二乙烯亚胺至其终浓度为1mM-3mM，在37℃条件下灭活4-28h；病毒液灭活后再用硫代硫酸钠中和。
10、一种预防猪繁殖与呼吸综合症的弱毒疫苗，其特症在于，其按照以下方法制备得到：将权利要求1的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus)TJ株在Marc-145或相关细胞传代致弱得到弱毒疫苗株，将该弱毒疫苗株按照制备常规弱毒疫苗的方法制备得到。
11、猪繁殖与呼吸综合症病毒的灭活疫苗，其特症在于：由权利要求3-10任何一项方法所制备得到的产品。
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100085 ROOM B418, 4/F, ZONE B, ZHONGGUANCUN BIOMEDICAL PARK, NO.5, KAITUO ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING TO: 100176 2/F, BAOJI'AN BUILDING, NO.6, KANGDING STREET, YIZHUANG ECONOMIC DEVELOPMENT ZONE, BEIJING

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Effective date of registration: 20101116

Address after: 100176, Yizhuang Economic Development Zone, Beijing, Kangding street, No. 6, Paul Ji'an building, 2 floor

Patentee after: Wu Hua

Address before: 100085 B418 room four, B District, Zhongguancun biomedicine Park, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee before: Beijing Jianxiang Hemu Biotechnology Co., Ltd.

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Owner name: BEIJING HUAWEITE BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: WU HUA

Effective date: 20110627

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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100176 2/F, PAGINA BUILDING, NO. 6, KANGDING STREET, YIZHUANG ECONOMIC DEVELOPMENT ZONE, BEIJING TO: 100085 ROOM B302, 3/F, AREA B, NO. 5, KAITUO ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING, CHINA

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Effective date of registration: 20110627

Address after: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee after: Beijing Huaweite Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100176, Yizhuang Economic Development Zone, Beijing, Kangding street, No. 6, Paul Ji'an building, 2 floor

Patentee before: Wu Hua

C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME: VITAL CHINA TECHNOLOGY CO., LTD.

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Address after: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee after: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee before: Beijing Huaweite Biotechnology Co., Ltd.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SINOVET (JIANGSU) BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20120507

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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100085 HAIDIAN, BEIJING TO: 225300 TAIZHOU, JIANGSU PROVINCE

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Effective date of registration: 20120507

Address after: Xinshengyuan 1 Building No. 225300 Jiangsu city of Taizhou Province medicine City Avenue room 1002

Patentee after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee before: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

CI01 Correction of invention patent gazette

Correction item: Patentee

Correct: Warwick (Beijing) Biological Technology Co., Ltd.| 100085, Haidian District, Beijing Road, No. 5, B District, room three, B302|Sinovet (Jiangsu) Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

False: Sinovet (Jiangsu) Biological Pharmaceutical Co., Ltd.|Xinshengyuan 1 Building No. 225300 Jiangsu city of Taizhou Province medicine City Avenue room 1002

Number: 31

Volume: 27

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: PATENTEE; FROM: SINOVET (JIANGSU) BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.:225300 TAIZHOU, JIANGSU PROVINCE TO: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.:100085 HAIDIAN, BEIJING; SINOVET (JIANGSU) BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.

ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: SINOVET (JIANGSU) BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.

Effective date: 20130617

Owner name: BEIJING JIANXIANG HEMU BIO-TECH CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20130617

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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100085 HAIDIAN, BEIJING TO: 100176 DAXING, BEIJING

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Effective date of registration: 20130617

Address after: 100176, Yizhuang Economic Development Zone, Beijing, Kangding street, No. 6, Paul Ji'an building, 2 floor

Patentee after: Beijing Jianxiang Hemu Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee before: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

Patentee before: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

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Owner name: SINOVET (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: BEIJING JIANXIANG HEMU BIO-TECH CO., LTD.

Effective date: 20140122

Owner name: SINOVET (JIANGSU) BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.

Effective date: 20140122

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Effective date of registration: 20140122

Address after: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Patentee after: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

Patentee after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 100176, Yizhuang Economic Development Zone, Beijing, Kangding street, No. 6, Paul Ji'an building, 2 floor

Patentee before: Beijing Jianxiang Hemu Biotechnology Co., Ltd.

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Effective date of registration: 20170904

Address after: Xinshengyuan 1 Building No. 225300 Jiangsu city of Taizhou Province medicine Avenue room 1002

Patentee after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 100085 B302 room, three floor, B District, 5 Haidian District Road, Beijing, China

Co-patentee before: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Patentee before: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

CP02 Change in the address of a patent holder
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Address after: 225300, 409 Gao Jiang Road, Jiangsu, Taizhou

Patentee after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: Xinshengyuan 1 Building No. 225300 Jiangsu city of Taizhou Province medicine Avenue room 1002

Patentee before: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD.