CN112626038B - 伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用 - Google Patents

伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明采用基因同源重组的方法缺失PRV人工致弱株FB的gE/gI基因，具备了可供鉴别诊断野毒感染的基因标记，适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒，以缺失株作为种毒制备的灭活疫苗可对PRV新发变异超强毒株FJ‑2012的攻毒产生完全的免疫保护作用；FB gE/gI基因缺失株与Bartha‑K61疫苗株相比具有更高的安全性，因此FB gE/gI基因缺失株也适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的弱毒活疫苗候选株。

Description

伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用。
背景技术
伪狂犬病（Pseudorabies, PR），又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease, AD），是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。PRV感染许多哺乳动物，包括猪、牛、绵羊、山羊、狗、兔、野猪、貂、熊、猫、狐狸、鼠和野生小鼠，除过猪以外其余引起严重的神经症状和死亡。而猪是PRV感染后唯一可以存活的动物，因此也是该病毒的贮存宿主，并且是PRV唯一的储存库。该病给全世界生猪养殖业带来巨大的经济损失，但部分欧美国家对该病投入巨大的人力、物力及财力，通过gE-ELISA鉴别诊断技术已经在家猪净化和消灭了该病。多年来，我国普遍采用gE缺失的弱毒活苗免疫接种、野毒监测和净化等技术，该病也得到有效控制，其发病和流行情况趋于稳定，但是从2011年10月开始，我国大部分地区先后在Bartha-K61免疫的规模化猪场再次出现伪狂犬病暴发和流行，在2011年以后分离的变异PRV对于85日龄的育肥猪也具有致死性，给我国养猪业造成严重的经济损失，其主要特点为：(i) 免疫过Bartha-K61 疫苗的怀孕母猪发生高流产率；(ii) 生长猪出现中枢神经***紊乱并且高死亡率；(iii) 血清高gE阳性率。
PRV给世界各国生猪养殖业带来巨大困扰，特别是养猪量较大的国家，包括南美洲、欧洲和亚洲，但是通过大规模的使用gE缺失疫苗和DIVA（differentiating infectedfrom vaccinated animals, DIVA）鉴别诊断技术，美国和部分欧洲国家已经从家猪中根除了猪伪狂犬病，但在美国、德国等国家，PRV依然在野猪群中流行和传播。中国在1950s年代首次报道了伪狂犬病例，在1970s，Bartha-K61疫苗毒株被引进到中国，从1990s 到2011使用Bartha-K61疫苗株或本地gE缺失弱毒苗使PR得到了很好的控制。然而从2011年10月开始，我国免疫了Bartha-K61疫苗的规模化猪场史无前例的大面积的暴发猪伪狂犬病，并且席卷全国，快速的传播到中国其他省市，对中国养猪业造成了毁灭性打击。研究表明，与经典的PRV毒株相比，从不同流行地区规模化猪场分离到的PRV毒株均表现出毒力增加，对育肥猪和仔猪的致病性增加，并且可以引起育肥猪中大猪的死亡，而且现有疫苗对新发变异毒株不能提供很好的保护，为新发变异的PRV超强毒株。2011年以后分离的所有新发变异超强PRV毒株，与欧洲和美洲毒株或2000年以前分离的中国传统株相比，在基因组序列上具有明显的变异。近年来从我国不同地区分离了大量的新发PRV毒株，包括HNX, ZJ01, HeN1,SMX, TJ, JS, HNB、HN1201、FJ-2012等。因此，在我国PRV的变异和毒力增强给我国现阶段的养猪业带来了严重的困扰。
综上，开发可防控经典PRV和新发变异PRV感染的安全、有效，具备鉴别诊断的新疫苗是十分有必要的。本发明采用基因同源重组的方法缺失PRV人工致弱株FB的gE/gI基因，具备了可供鉴别诊断野毒感染的基因标记，适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒，以缺失株作为种毒制备的灭活疫苗可对PRV新发变异超强毒株FJ-2012的攻毒产生完全的免疫保护作用；FB gE/gI基因缺失株与Bartha-K61疫苗株相比具有更高的安全性，因此FBgE/gI基因缺失株也适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的弱毒活疫苗候选株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：
（1）将FB株的gE/I缺失位置的上下游同源片段依次***到质粒pUC19构建pUC19:H1:H2，再***EGFP表达盒，构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2，再将BAC序列引入到pUC19:H1:EGFP:H2，形成可构建PRV人工染色体的同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2；
（2）提取PRV FB毒株的感染性基因组DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+；
（3）提取重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因组，与转移质粒pUC19:H1:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC序列的无痕重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI。
所述上下游同源片段H1和H2的序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述EGFP表达盒序列如SEQ ID NO.3所示，所述BAC序列如SEQ ID NO.4所示。
步骤（2）所述重组病毒的构建方法包括以下步骤：
（1）环状PRV基因组DNA的提取：
1）将长满单层BHK-21细胞，接种PRV病毒，待出现30%细胞病变时，胰酶消化，离心，收集细胞；
2）将收集的细胞400μL PBS重悬后，加入裂解液，混匀后消化过夜；
3）加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；
4）取上清液再次加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；
5）重复4）一次；
6）将上清液转移到新的离心管中，加入1/10体积的3 M 醋酸钠和2倍体积的无水乙醇混匀，在-20℃沉淀过夜；
7）4℃下12000rpm离心10min，弃上清，加入预冷的75%乙醇洗涤沉淀一次，7600rpm离心5min，弃上清，晾干，加30μL ddH2O溶解DNA备用；
（2）重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的构建、纯化与鉴定；在6孔板中将长至80%的BHK-21细胞用opti-MEM培养基洗涤2次，将转染液全部加入到洗涤好的细胞中，转染6小时后，换含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48-72小时，依细胞形态收集细胞及其培养液，冻融3次后，在6孔板中将收集的转然后病毒液全部接种1孔BHK-21细胞，培养24-48小时后，在荧光显微镜下观察是否产生荧光以及细胞病变；
所述转染液配方包括：opti-MEM培养基 2mL；lipofectamine®2000 10μL；PRVDNA 10μL；pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 20μL。
进一步，利用上述方法制备获得伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株，所述毒株命名为伪狂犬病病毒FBΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202026。中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。
进一步，将上述缺失毒株应用于制备伪狂犬病毒FB株gE/I基因缺失灭活疫苗，包括制备双相佐剂灭活疫苗。
本发明的优点在于：
本发明采用基因同源重组的方法缺失PRV人工致弱株FB的gE/gI基因，具备了可供鉴别诊断野毒感染的基因标记，适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒，以缺失株作为种毒制备的灭活疫苗可对PRV新发变异超强毒株FJ-2012的攻毒产生完全的免疫保护作用；FB gE/gI基因缺失株与Bartha-K61疫苗株相比具有更高的安全性，因此FB gE/gI基因缺失株也适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的弱毒活疫苗候选株。
附图说明
图1为PRV FB株gE/gI基因上下游同源臂片段H1和H2的PCR扩增结果；
图2为质粒pUC19:H1:H2的双酶切鉴定结果；
图3为pUC19:H1:EGFP:BAC:H2质粒的EGPF和BAC序列PCR的鉴定结果；
图4为pUC19:H1:EGFP:BAC:H2与PRV FB毒株感染性DNA共转染BHK-21细胞后形成的带有EGFP序列的rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+重组病毒，左图为在荧光下的重组病毒，右图为明场下的病毒细胞病变；
图5为pUC19:H1:H2与rFB-ΔgE/gI:EGFP:BAC毒株的感染性DNA共转染BHK-21细胞后形成的删除EGFP:BAC序列的rPRV FB-ΔgE/gI重组病毒，左图为明场下的病毒细胞病变，右图为在荧光场下的重组病毒（显示无荧光）；
图6为绵羊临床症状；A）瘙痒症状。B）瘙痒部位脱毛，红肿。C）口吐白沫。
具体实施方式
实施例1 伪狂犬病毒FB株gE/I基因缺失株的构建
伪狂犬病毒FB株的制备方法参见魏振明，程由铨，李怡英，等. 伪狂犬病毒弱毒株培育的研究[J]. 中国兽医科技, 1986(08): 7-9；李怡英，魏振明，吴平，等. 伪狂犬病毒弱毒株若干生物学特性[J]. 福建省农科院学报, 1995，10(04): 20-25；魏振明，程由铨，翁文林，等. 伪狂犬病弱毒疫苗研究——哺乳仔猪被动免疫效果观察[J]. 中国兽医科技,1989(05): 7-9。
1.1 构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2
通过分子生物学技术以FB株DNA为模板将gE/I缺失位置的上下游同源片段依次***到质粒pUC19构建pUC19:H1:H2，再***EGFP表达盒，构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2，再将BAC序列引入到pUC19:H1:EGFP:H2，形成可构建PRV人工染色体的同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2。
1.1.1 转移质粒pUC19:H1:H2的构建
参照顾真庆（2014）博士论文中的PRV gE/gI基因缺失的引物序列设计引物（见表1），分别扩增同源重组臂上游片段H1与下游片段H2。
表1. PRV gE/gI基因缺失及缺失毒株鉴定引物序列及其酶切位点
Figure 910345DEST_PATH_IMAGE001
PCR扩增H1与H2的反应体系如下：
Figure 314782DEST_PATH_IMAGE002
反应程序如下：95 ℃5 min；95 ℃ 30s，60 ℃30s，68 ℃ 70s进行35个循环，最后68 ℃延伸10 min。
PRV gE/gI基因的上下游序列H1片段和H2片段PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，初步确认扩增结果正确后（图1），按照天根公司凝胶切胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，将H1和H2片段分别连接克隆入平末端克隆载体pCR®-Blunt II-TOPO ® 载体。所用试剂盒购自thermo Fisher公司，货号K280002，连接体系如下：
Figure 163789DEST_PATH_IMAGE003
上述反应体系于22.5 ℃连接30min，将连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴90s，然后加入250μL无抗LB培养基在37℃孵育45-60min，取200μL涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，Qiagenminiprep试剂盒提取质粒，进行PCR鉴定，阳性克隆送公司测序确认，选取测序正确的质粒pCR®-Blunt II-TOPO ® :H1和pCR®-Blunt II-TOPO ® :H2进行后续试验。
将含H1片段的质粒和pUC19质粒用限制性内切酶EcoRⅠ(NEB公司)和SacⅠ(NEB公司)进行双酶切，EcoRⅠ酶切反应体系如下：
Figure 944664DEST_PATH_IMAGE004
在37℃条件下，酶切2小时后，用天根公司DNA过柱纯化试剂盒纯化后，再进行SacⅠ酶切，反应体系如下：
Figure 195516DEST_PATH_IMAGE005
用上述酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，用天根公司凝胶切胶回收试剂盒进行目标DNA的纯化回收，回收后将H1片段和pUC19质粒用T4 DNA连接酶（NEB公司）连接，连接反应体系如下：
Figure 770854DEST_PATH_IMAGE006
上述反应体系于22.5 ℃连接1小时，将连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴90s，然后加入250μL无抗LB培养基在37℃孵育45-60min，取200μL涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，Qiagenminiprep试剂盒提取质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind III（NEB公司）进行双酶切鉴定，反应体系如下：
Figure 372737DEST_PATH_IMAGE007
上述反应体系在37℃条件下，酶切2小时后，琼脂糖凝胶电泳检测，将鉴定正确的质粒命名为：pUC19:H1。
将含H2片段的pCR®-Blunt II-TOPO ® :H2质粒和pUC19:H1质粒用限制性内切酶PstⅠ（NEB公司）和HindⅢ（NEB公司）进行双酶切，酶切反应体系如下：
Figure 691723DEST_PATH_IMAGE008
在37℃条件下，酶切3小时后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，用天根公司凝胶切胶回收试剂盒对H2片段和线性pUC19:H1目标DNA进行纯化回收，回收后将H2片段和pUC19:H1质粒用T4 DNA连接酶（NEB公司）连接，连接反应体系如下：
Figure 62661DEST_PATH_IMAGE009
上述反应体系于22.5 ℃连接1小时，将连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴90s，然后加入250μL无抗LB培养基在37℃孵育45-60min，取200μL涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，Qiagenminiprep试剂盒提取质粒，用限制性内切酶Hind III和PstⅠ进行双酶切鉴定，酶切后片段大小约为4000bp和1100bp，将鉴定正确的质粒命名为：pUC19:H1:H2（酶切结果见图2）。
1.1.2 转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2的构建
采用下列引物，以pEGFP-N1为模板，扩增EGFP表达盒，扩增反应体系如下：
表2. EGFP表达盒扩增及其EGFP和BAC鉴定引物序列及其酶切位点
Figure 808900DEST_PATH_IMAGE010
备注：EGFP- D-F和EGFP- D-F扩增EGFP序列；BAC-D-F和BAC-D-R扩增BAC序列的sopA基因。
Figure 632500DEST_PATH_IMAGE011
反应程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30s，53℃30s，68℃ 2 min进行32个循环，最后68 ℃延伸10 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，初步确认扩增结果正确后，按照天根公司凝胶切胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，将回收的EGFP DNA片段和pUC19:H1:H2质粒用限制性内切酶PacⅠ（NEB公司）进行酶切，酶切反应体系如下：
Figure 755177DEST_PATH_IMAGE012
在37℃条件下，酶切15min后，在pUC19:H1:H2质粒的酶切体系中加入碱性磷酸酶（CIP）（NEB公司）1μL、10×Buffer 1μL、dd H2O 8μL，总体积60μL，在37℃条件下继续孵育30min。将CIP处理后的pUC19:H1:H2和酶切的EGFP用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，用天根公司凝胶切胶回收试剂盒对EGFP片段和线性pUC19:H1:H2质粒进行纯化回收，回收后将二者用T4 DNA连接酶（NEB公司）连接，连接反应体系如下：
Figure 980622DEST_PATH_IMAGE013
上述反应体系于22.5 ℃连接30min，将连接产物加入到DH10B大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴90s，然后加入700μL无抗LB培养基在37℃孵育45-60min，取200μL涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，进行菌落PCR鉴定，鉴定引物见表2，反应体系如下：
Figure 897762DEST_PATH_IMAGE014
反应程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30s，58℃30s，72℃ 30s进行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将鉴定正确的质粒命名为：pUC19:H1:EGFP:H2（PCR结果见图3A）。
1.1.3 pUC19:H1:EGFP:BAC:H2质粒的构建
将pUC19:H1:EGFP:H2和pBelo BAC II质粒用限制性内切酶Sph I（NEB公司）进行酶切，酶切反应体系如下：
Figure 474237DEST_PATH_IMAGE015
在37℃条件下，酶切1小时后，直接用天根公司DNA过柱纯化试剂盒进行纯化，回收酶切后的两个线性化质粒，回收后将二者用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系如下：
Figure 135025DEST_PATH_IMAGE016
上述反应体系于20-21 ℃连接2.5小时，取10μL连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴90s，然后加入250μL无抗LB培养基在37℃孵育45-60min，取200μL涂布含50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，进行菌落PCR鉴定，鉴定引物见表2，反应体系如下：
Figure 214977DEST_PATH_IMAGE017
反应程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30s，58℃30s，72℃ 30s进行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将鉴定正确的质粒命名为：pUC19:H1:EGFP:BAC:H2（PCR结果见图3B）。
1.2 构建重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+
提取PRV FB毒株的基因组感染性DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+。
1.2.1 环状PRV基因组DNA的提取
1）将长满单层BHK-21细胞（25 cm2），接种PRV病毒，待出现30%细胞病变时，胰酶消化，离心，收集细胞；
2）将收集的细胞400μL PBS重悬后，加入裂解液，混匀后消化过夜；
3）加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；
4）取上清液再次加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；
5）重复4）一次；
6）将上清液转移到新的离心管中，加入1/10体积的3 M 醋酸钠和2倍体积的无水乙醇混匀，在-20℃沉淀过夜；
7）4℃下12000rpm离心10min，弃上清，加入预冷的75%乙醇洗涤沉淀一次，7600rpm离心5min，弃上清，晾干，加30μL ddH2O溶解DNA备用。
1.2.2 重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的构建、纯化与鉴定
经转染验证的pUC19:H1:EGFP:BAC:H2质粒和提取的环状PRV DNA按照下述方法配制转染液：
Figure 568598DEST_PATH_IMAGE018
在6孔板中将长至80%的BHK-21细胞用opti-MEM培养基洗涤2次，将上述混合好的转染液全部加入到洗涤好的细胞中，转染6小时后，换含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48-72小时，依细胞形态收集细胞及其培养液，冻融3次后，在6孔板中将收集的转然后病毒液全部接种1孔BHK-21细胞，培养24-48小时后，在荧光显微镜下观察是否产生荧光以及细胞病变。在培养48小时后，在荧光显微镜下可以观察到细胞产生的荧光，且在相应的荧光位置可以观察到明显的细胞病变，细胞变圆形成合胞体（见图4），收获该病毒液，冻融3次后，进行噬斑纯化。按照病毒噬斑纯化方法，选取稳定的荧光斑，连续进行5-7轮纯化后，获得的重组病毒命名为rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+。提取重组病毒基因组DNA为模板，以表1中的PRV-gE-632-F和PRV-gE-632-R引物进行PCR扩增，未能扩增出特异性PCR扩增产物，而原始毒株DNA均能扩增出特异性条带，说明gE/gI基因已经被转移质粒的相应序列替换，也进一步说明经噬斑纯化后的重组病毒已经无野毒污染，可以进行后续BAC的构建或无痕缺失病毒的构建。
1.3 rPRV FB-ΔgE/gI无痕病毒的构建
提取重组病毒rPRV FB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因组，与转移质粒pUC19:H1:H2共转染细胞，转染方法以及病毒纯化参照1.2中的方法进行。通过噬斑纯化技术筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC序列的无痕重组病毒FB-ΔgE/gI（不含荧光）（图5），测定病毒的稳定性和滴度。
对FB-ΔgE/gI重组病毒进行稳定性传代测定，连续传代20代，每个代次之间的细胞病变一致，对P1、P5、P10、P20代的病毒进行滴度测定，其TCID50均在108/ml以上，证明构建的缺失重组病毒具有良好的遗传稳定性。
实施例2 伪狂犬病毒FB株gE/I基因缺失灭活疫苗的初步试制
2.1 病毒增殖与灭活
病毒增殖：采用静置培养的方式，对FB-ΔgE/I缺失株按照常规病毒培养方式进行病毒大量增殖，增殖后冻融3次，15000rpm 4℃下高速离心30min除去蛋白碎片，收集上清作为灭活前抗原备用，并按照实验室常规方法测定TCID50，将病毒原液用无血清DMED培养基作10倍连续稀释，在长满单层BHK21细胞的96孔板中，将10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀释病毒液分别接种细胞（弃去培养液后）0.1ml/孔，每个稀释度接种8孔细胞，继续培养7天，连续观察每孔细胞是否出现PRV感染后的典型细胞病变，按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。经测定，FB-ΔgE/I缺失株的TCID50分别为108.6/ml。
抗原灭活：在上述备用抗原病毒液中缓慢加入适量10%的甲醛，使甲醛终浓度为0.1%，摇匀后全部转移到一个新的无菌三角瓶中，在37℃条件下灭活36h，灭活过程中不断振荡200rpm，使灭活完全。灭活结束后，取灭活后病毒液5ml，分别接种5瓶长满单层的BHK-21细胞（25cm2），每瓶1ml，37℃继续培养7天，观察是否有细胞病变出现，确定病毒是否灭活完全。经检验，病毒灭活完全。
2.2 PRV FB-ΔgE/I缺失株灭活疫苗的制备
准备适量的双相佐剂ISA 206VG（200ml）和采用2.1所述方法灭活的水相抗原（200ml），在31℃水浴锅将两相分别加热30~40min，将装有佐剂的烧杯置于搅拌器下，搅拌速度350rpm，从水浴锅中拿出加热后的水相抗原，擦干烧杯外壁，向佐剂中快速加入水相（约3s），350rpm搅拌5min后，停止搅拌冷却，在20℃静置1小时，疫苗制备完毕后室温放置过夜。制备完成后，分装，对分装的疫苗外观和质量进行检测，均符合要求，将疫苗置于玻璃瓶中，分别储存在4℃和20℃下，进行稳定性观察，均符合要求。。
实施例3 PRV FB-ΔgE/gI株灭活疫苗的免疫原性评价
3.1 试验动物及分组和处理
体重15-20kg的绵羊15头，分3组，每组5头。使用ISA 206VG佐剂制备的PRV FB-ΔgE/I缺失灭活疫苗免疫绵羊，免疫方式为颈部皮下免疫疫苗5ml，免疫4周后用PRV FJ-2012强毒株，攻毒剂量为1ml/头，含病毒104 TCID50。试验动物分组及免疫见表3。
表3. 试验动物分组及处理
Figure 101210DEST_PATH_IMAGE019
3.2临床观察
攻毒后，每日测量体温两次，观察动物精神状态以及是否发病，包括是否啃咬接种部位，是否出现神经症状，攻毒后14天，解剖存活动物，观察病理变化。
3.3结果
FJ-2012株强毒攻毒后第四天， G2组5只绵羊出现卧地划水样、撕咬后肢、口吐白沫、精神沉郁、喜卧，并有2只绵羊于当天死亡。G1、G3组未出现明显临床症状。
攻毒后第五天，G2组3只绵羊均表现为四肢划水样、倒地不起、口吐白沫，3只绵羊均于当天死亡。G1、G3组未出现明显临床症状。
攻毒后第六至十四天，G1、G3组未出现明显临床症状。具体发病及死亡结果见表4及图6。
表4. ISA 206VG佐剂制备的PRV FB-ΔgE/I缺失灭活疫苗免疫绵羊后对PRV FJ-2012强毒株攻毒的保护率
Figure 565690DEST_PATH_IMAGE020
对绵羊免疫前、后采集的血清进行ELISA检测，免疫前G1、G2、G3组gB和gE抗体均为阴性，显示无PRV感染。免疫后7d、14d、21d、28d ELISA结果显示G1组羊的gB抗体全部为阳性，gE抗体全部为阴性，表明疫苗接种效果良好，PRV FB-ΔgE/gI株基因缺失彻底。
实施例4 PRV不同毒株对兔致病力的比较
4.1 试验动物及分组
体重1.5 kg的普通级健康的新西兰兔20只，分4组，每组5头。
4.2 攻毒毒株
FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株，攻毒剂量均为104 TCID50/只，攻毒方式为颈部皮下注射。
4.3 临床观察
攻毒后，每日观察动物精神状态以及是否发病，主要观察兔是否出现呼吸症状和神经症状，以及接种部位是否发生啃咬和死亡，记录发病死亡情况。
4.4 结果
攻毒后连续观察14天，FB株还有3只兔存活，而FBΔgE/gI株攻毒组全部存活，但Bartha-K61毒株组全部死亡，因此FB株或FBΔgE/gI株与Bartha-K61毒株相比，具有更低的毒力或致病力，表明其安全性更高，可以作为安全有效的弱毒疫苗候选株。
表5. 不同攻毒毒株的对兔的死亡率
Figure 234568DEST_PATH_IMAGE021
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用
<130> 16
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1291
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgggccctc tagatgcatg ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gcagaattcg 60
cccttgtacc cgtacaccga gtcgtggcag ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc 120
gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg 180
ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc 240
acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac 300
tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc 360
acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg 420
ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc 480
gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg 540
ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc 600
ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac 660
cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc 720
gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg 780
cccaggcccc ggccccggcc ccggccgaag cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc 840
cccggccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg gaccacgccg ccgggggccg ccccacgccg 900
cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc 960
gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg 1020
cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg 1080
tgcgtctaca tcttcttccg cctgaggggg gcgaaggggt atcgcctcct gggcggtccc 1140
gcggacgccg acgagctaaa agcgcagccc ggtccgtagc ctccgcagta ccggcgtcga 1200
tgatgaaagg gcgaattcca gcacactggc ggccgttact agtggatccg agctcggtac 1260
caagcttgat gcatagcttg agtattctat a 1291
<210> 2
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccgacatgg acacgttcga ccccagcgcc cccgtcccga cgagcgtctc gaacccggcc 60
gccgacgtcc tgctggcccc caagggaccc cgctccccgc tgcgccccca ggacgactcg 120
gactgctact acagcgagag cgacaacgag acgcccagcg agttcctgcg ccgcgtggga 180
cgccggcagg cggcgcgtcg gagacgccgc cgctgcctga tgggcgtcgc gatcagcgcc 240
gccgcgctgg tcatctgctc gctgtccgcg ctactcgggg gcatcgtcgc caggcacgtg 300
tagcgagcga gcgaacggga gcgggggccc gctcccatcc gccgcgccca ggagaggggg 360
gagggcgcgg ggggttgagc gcgccacgtg gtgtgggcac ggactcggac ttgtcacaat 420
aaatgggccc cggcgcgtcc gggcgcacac agcagccttc ctctcctccg cgtctctgtt 480
ccgcccgtct ctcgccggac tcttcttctc caccgcctcc accgtcgcag ttgccgcgag 540
cgcgttcgca ccatgggggt gacggccatc accgtggtca cgctgatgga cggggccggg 600
cgcatccccg ccttcgtggg cgaggcgcac ccggacctgt ggaaggtgct caccgagtgg 660
tgctacgcgt cgatggtgca gcagcggcgc gccgccgacg agaactcgcc gcggcagcac 720
gtggtgctgc gctcctcgga gatctccccc ggctcgctgg ccctgctgcc gcgcgccgtg 780
cgccccgtcg tgcggacgcg gtccgacccc acggcgccgt tctacatcac caccgagacg 840
cacgagctga cgcggcgccc cccggcggac ggctcgaagc ccggggagcc cctccggatc 900
agcccgcccc cgcggctgga cacggagtgg tcgtccgtcc tgaacgggat ccagtacctg 960
aactcggggg cccggggcac ggcccccgtc cacctgtgga tcctgggtgc cgccgacctc 1020
tgcgaccagg tgctcctggc cgcctcccgc agcaccgccg ccggagcctc ccacgcccag 1080
acgggcgcgc gcctgacccg gcgccggccc gggctgacgg acgccgacgc cctggacgtg 1140
atcgtcgccg ggatccaggc gacccgcgcc atgttcgcgg gtccacaa 1188
<210> 3
<211> 1640
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660
gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 720
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 960
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 1020
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1080
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1140
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1200
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1260
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1320
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1380
gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg 1440
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 1500
tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1560
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1620
ccaaactcat caatgtatct 1640
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<211> 7507
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcggccgcaa ggggttcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 60
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 120
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 180
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 240
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 300
ccagtgaatt gtaatacgac tcactatagg gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct 360
ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg agtattctat agtgtcacct aaatagcttg 420
gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 480
aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 540
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 600
cattaatgaa tcggccaacg cgaacccctt gcggccgccc gggccgtcga ccaattctca 660
tgtttgacag cttatcatcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc 720
gtagcaacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg 780
ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca 840
aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata 900
tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa 960
actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt 1020
agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa 1080
ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg 1140
gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc 1200
catacggaat tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata 1260
aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt 1320
ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca 1380
ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc 1440
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ccgccgctgc tgctgacggt gtgacgttct ctgttccggt cacaccacat acgttccgcc 1800
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tcgggaaaat ctcccattat cgtagagatc cgcattatta atctcaggag cctgtgtagc 2160
gtttatagga agtagtgttc tgtcatgatg cctgcaagcg gtaacgaaaa cgatttgaat 2220
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tcagcaatgg acagaacaac ctaatgaaca cagaaccatg atgtggtctg tccttttaca 2340
gccagtagtg ctcgccgcag tcgagcgaca gggcgaagcc ctcgagtgag cgaggaagca 2400
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gttatccact tatccacggg gatattttta taattatttt ttttatagtt tttagatctt 2520
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aattgccctt tcagtgtgac aaatcaccct caaatgacag tcctgtctgt gacaaattgc 2640
ccttaaccct gtgacaaatt gccctcagaa gaagctgttt tttcacaaag ttatccctgc 2700
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ctgcgagatc catgttgcta aatatgctga aatattcgga ttgacctctg cggaagccag 3000
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tgaagaggat gccggcgatg aaaaaggcta tgaatctttt ccttggttta tcaaacgtgc 3120
gcacagtcca tccagagggc tttacagtgt acatatcaac ccatatctca ttcccttctt 3180
tatcgggtta cagaaccggt ttacgcagtt tcggcttagt gaaacaaaag aaatcaccaa 3240
tccgtatgcc atgcgtttat acgaatccct gtgtcagtat cgtaagccgg atggctcagg 3300
catcgtctct ctgaaaatcg actggatcat agagcgttac cagctgcctc aaagttacca 3360
gcgtatgcct gacttccgcc gccgcttcct gcaggtctgt gttaatgaga tcaacagcag 3420
aactccaatg cgcctctcat acattgagaa aaagaaaggc cgccagacga ctcatatcgt 3480
attttccttc cgcgatatca cttccatgac gacaggatag tctgagggtt atctgtcaca 3540
gatttgaggg tggttcgtca catttgttct gacctactga gggtaatttg tcacagtttt 3600
gctgtttcct tcagcctgca tggattttct catacttttt gaactgtaat ttttaaggaa 3660
gccaaatttg agggcagttt gtcacagttg atttccttct ctttcccttc gtcatgtgac 3720
ctgatatcgg gggttagttc gtcatcattg atgagggttg attatcacag tttattactc 3780
tgaattggct atccgcgtgt gtacctctac ctggagtttt tcccacggtg gatatttctt 3840
cttgcgctga gcgtaagagc tatctgacag aacagttctt ctttgcttcc tcgccagttc 3900
gctcgctatg ctcggttaca cggctgcggc gagcgctagt gataataagt gactgaggta 3960
tgtgctcttc ttatctcctt ttgtagtgtt gctcttattt taaacaactt tgcggttttt 4020
tgatgacttt gcgattttgt tgttgctttg cagtaaattg caagatttaa taaaaaaacg 4080
caaagcaatg attaaaggat gttcagaatg aaactcatgg aaacacttaa ccagtgcata 4140
aacgctggtc atgaaatgac gaaggctatc gccattgcac agtttaatga tgacagcccg 4200
gaagcgagga aaataacccg gcgctggaga ataggtgaag cagcggattt agttggggtt 4260
tcttctcagg ctatcagaga tgccgagaaa gcagggcgac taccgcaccc ggatatggaa 4320
attcgaggac gggttgagca acgtgttggt tatacaattg aacaaattaa tcatatgcgt 4380
gatgtgtttg gtacgcgatt gcgacgtgct gaagacgtat ttccaccggt gatcggggtt 4440
gctgcccata aaggtggcgt ttacaaaacc tcagtttctg ttcatcttgc tcaggatctg 4500
gctctgaagg ggctacgtgt tttgctcgtg gaaggtaacg acccccaggg aacagcctca 4560
atgtatcacg gatgggtacc agatcttcat attcatgcag aagacactct cctgcctttc 4620
tatcttgggg aaaaggacga tgtcacttat gcaataaagc ccacttgctg gccggggctt 4680
gacattattc cttcctgtct ggctctgcac cgtattgaaa ctgagttaat gggcaaattt 4740
gatgaaggta aactgcccac cgatccacac ctgatgctcc gactggccat tgaaactgtt 4800
gctcatgact atgatgtcat agttattgac agcgcgccta acctgggtat cggcacgatt 4860
aatgtcgtat gtgctgctga tgtgctgatt gttcccacgc ctgctgagtt gtttgactac 4920
acctccgcac tgcagttttt cgatatgctt cgtgatctgc tcaagaacgt tgatcttaaa 4980
gggttcgagc ctgatgtacg tattttgctt accaaataca gcaatagtaa tggctctcag 5040
tccccgtgga tggaggagca aattcgggat gcctggggaa gcatggttct aaaaaatgtt 5100
gtacgtgaaa cggatgaagt tggtaaaggt cagatccgga tgagaactgt ttttgaacag 5160
gccattgatc aacgctcttc aactggtgcc tggagaaatg ctctttctat ttgggaacct 5220
gtctgcaatg aaattttcga tcgtctgatt aaaccacgct gggagattag ataatgaagc 5280
gtgcgcctgt tattccaaaa catacgctca atactcaacc ggttgaagat acttcgttat 5340
cgacaccagc tgccccgatg gtggattcgt taattgcgcg cgtaggagta atggctcgcg 5400
gtaatgccat tactttgcct gtatgtggtc gggatgtgaa gtttactctt gaagtgctcc 5460
ggggtgatag tgttgagaag acctctcggg tatggtcagg taatgaacgt gaccaggagc 5520
tgcttactga ggacgcactg gatgatctca tcccttcttt tctactgact ggtcaacaga 5580
caccggcgtt cggtcgaaga gtatctggtg tcatagaaat tgccgatggg agtcgccgtc 5640
gtaaagctgc tgcacttacc gaaagtgatt atcgtgttct ggttggcgag ctggatgatg 5700
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cacttcaaaa agcctttaca gataaagagg aattacttaa gcagcaggca tctaaccttc 6000
atgagcagaa aaaagctggg gtgatatttg aagctgaaga agttatcact cttttaactt 6060
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cctgatgcga ccacgtttta gtctacgttt atctgtcttt acttaatgtc ctttgttaca 6300
ggccagaaag cataactggc ctgaatattc tctctgggcc cactgttcca cttgtatcgt 6360
cggtctgata atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc 6420
tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac 6480
tcgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga 6540
ttattagtct gggaccatgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca 6600
cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggaa ccacggtccc actcgtatcg 6660
tcggtctgat tattagtctg ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt 6720
ctgggaccac gatcccactc gtgttgtcgg tctgattatc ggtctgggac cacggtccca 6780
cttgtattgt cgatcagact atcagcgtga gactacgatt ccatcaatgc ctgtcaaggg 6840
caagtattga catgtcgtcg taacctgtag aacggagtaa cctcggtgtg cggttgtatg 6900
cctgctgtgg attgctgctg tgtcctgctt atccacaaca ttttgcgcac ggttatgtgg 6960
acaaaatacc tggttaccca ggccgtgccg gcacgttaac cgggctgcat ccgatgcaag 7020
tgtgtcgctg tcgacgagct cgcgagctcg gacatgaggt tgccccgtat tcagtgtcgc 7080
tgatttgtat tgtctgaagt tgtttttacg ttaagttgat gcagatcaat taatacgata 7140
cctgcgtcat aattgattat ttgacgtggt ttgatggcct ccacgcacgt tgtgatatgt 7200
agatgataat cattatcact ttacgggtcc tttccggtga tccgacaggt tacggggcgg 7260
cgacctcgcg ggttttcgct atttatgaaa attttccggt ttaaggcgtt tccgttcttc 7320
ttcgtcataa cttaatgttt ttatttaaaa taccctctga aaagaaagga aacgacaggt 7380
gctgaaagcg agctttttgg cctctgtcgt ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga 7440
acaatggaag tccgagctca tcgctaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 7500
attcgat 7507
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
attgaattcg tacccgtaca ccgagtcgt 29
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actgagctcg gttaattaat catcatcgac gccggtact 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caactgcagc gttaattaag ccgacatgga cacgttcga 39
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tccactcgca gctcttct 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcacgtcatc acgaagga 18
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcgttaatta agcatgctag ttattaatag taatcaatta c 41
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gacttaatta aagatacatt gatgagtttg gaca 34
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aggacgacgg caactacaag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctcgttggg gtctttgctc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atctggctct gaaggggcta 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcacatcagc agcacatacg 20

Claims (1)

1.一种伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株在制备针对新发变异毒株FJ-2012的伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失灭活疫苗中的应用，其特征在于：所述基因缺失株命名为伪狂犬病病毒FBΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V202026；所述的伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失灭活疫苗为双相佐剂灭活疫苗，所述的伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失灭活疫苗可对新发变异毒株FJ-2012的攻毒提供100%的保护力。
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