CN102994419B - 一种短小芽孢杆菌lnxm12及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离于西藏具促生和防病作用的低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380及其在防治小麦赤霉病害中的应用。所述的短小芽孢杆菌是从西藏拉萨尼木县小麦根围土中分离获得的生防芽孢杆菌，其在低温条件下生长良好，利于促生和生防作用的发挥，对于小麦赤霉病的生防效果可达68%，增加产量12%，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物和农业病害防治技术领域，涉及短小芽孢杆菌，具体涉及一种低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12及其在防治小麦赤霉病害中的应用。
背景技术
小麦赤霉病别名麦穗枯、烂麦头、红麦头，是小麦和大麦的重要病害，遍及全世界，主要分布于潮湿和半潮湿区域，尤其以气候湿润多雨的温带地区受害严重。从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中又以穗腐为害最重。小麦赤霉病长期以来一直是我国淮河以南及长江中下游麦区发生最严重的病害之一，近年来在黄淮海平原麦区、西北麦区和东北春麦也多次发生过大流行，在大流行年份造成的产量损失可达10%-40%。赤霉病不仅造成麦类产量的减少，还使得病粒失去种用和工业价值，同时由于赤霉菌的低谢产物含有毒素，人畜食用后还会引起中毒。
目前防治小麦赤霉病的主要手段为喷洒化学农药，后者的大量应用不仅造成了空气、水源、土壤和食物的污染，更重要的是经过化学农药的定向选择使许多病原菌产生了抗药性，为该病的防治带来了更大的困难，严重威胁我国麦类生产安全。近年来，越来越多的地区采用综合防治的方法来防治小麦赤霉病，其中尤以生物农药发挥着重要的作用。根际微生物种类繁多，其中有很多种类能够促进植物生长、防治植物病害、增加作物产量，这类微生物一般被称为植物根围促生细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR）。PGPR与植物之间有很好的互利共生关系，不仅能使植物产生诱导抗病性，而且可以提高作物的产量和品质。所以，从PGPR分离和利用具有促生和防病作用的益生菌并应用于植物病害的防治和增加产量，具有很重要的理论意义和应用价值。
CN 101836638A公开了一种防治小麦赤霉病的杀菌剂，其有效成分为***酮和戊唑醇。该杀菌剂化学性质稳定，混合时***酮与戊唑醇两成份互容，不发生化学反应，用途广泛，增效显著，使用安全，对于目前田间不同类型的小麦赤霉群体有很好的抑菌活性，且明显高于***酮或是戊唑醇单剂，即两者复配有增效作用。该复配剂对于小麦生产上其他重要病害如小麦白粉病亦具有良好的防效，杀菌谱广，并能延缓病原菌对配方中的单剂产生抗药性，对于抗性治理具有重要的意义。
CN 101617698A公开了一种植物药剂防治小麦赤霉病的配制方法，松针5000克、烟叶2000克、马钱子3000克、茶枯8000克、雷公藤粉3000克、石硫合剂5000克。按比例取松针、烟叶、马钱子、茶枯、雷公藤粉分别碾碎组合到一起放入大铁锅内，加200斤温水浸泡5分钟，然后大火熬煮30分钟停火过滤取药液与石硫合剂充分混合搅拌10分钟即成成品。
CN 102405908A公开了一种用于抗小麦赤霉病的壳寡糖组合物及其用途和方法，具体地，涉及一种用于抗小麦赤霉病的农药组合物，该农药组合物中包含壳寡糖，壳寡糖占该农药组合物的重量百分比为0.003%-0.028%。该发明还提供了上述包含壳寡糖的农药组合物用于防治小麦赤霉病的用途，其特征在于包含壳寡糖的农药组合物中壳寡糖的重量百分比为0.003%-0.028%。该发明的组合物解决了抗小麦赤霉病的重要问题，尤其是用包含壳寡糖的农药组合物在处理小麦的种子和植株后，不仅抗小麦赤霉病，而且不会对作物产生药害，没有农药残留。
CN 1305721A公开了一种防治小麦赤霉病等作物病害的植物活性低聚寡糖农药，所述的植物活性低聚寡糖农药为以植物渣为原料，用以下工艺获得：在植物渣原料中以10-15万果胶酶单位/每公斤原料渣加入果胶酶，搅拌加热至30-48℃水解，灭活，灭活后的溶液经过滤、筛分后再经真空减压浓缩处理，灭菌罐封即得该产品。
目前尚未见有利用PGPR防治小麦赤霉病的详细报道。
发明内容
本发明目的之一在于针对当前小麦赤霉病防治中存在的问题，提供一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），其对小麦赤霉病等病原菌具有良好的抑菌效果，有潜在的生防价值。本发明目的之二在于提供该短小芽孢杆菌在防治小麦赤霉病中的应用。
为达到上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
一种短小芽孢杆菌，分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12，于2009年11月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3380。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380，是从西藏拉萨尼木县小麦根围土中分离获得。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的形态特征和生理生化特征：革兰氏染色阳性，杆状，能产芽孢，能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7%NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的分子鉴定特征：利用PCR技术扩增短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380的部分16S rRNA序列，获得长度为485bp的片段，其测序结果如序列表所示，在GenBank中经与已知的16S rRNA序列进行同源性比较，发现与Bacillus pumilus GQ911554.1的相似性为99%。
根据菌株的革兰氏染色、形态特征、生理生化特征以及16S rRNA序列分析的结果，参照《芽孢杆菌属》（蔡妙英等译，农业出版社，1988年）和《微生物分类学》（张继忠，上海复旦大学出版社，1995）的检索表进行检索，本发明的菌株经多相分类鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），命名为LNXM12。
含有短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的菌剂也属于本发明的保护范围。
为达到上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380在防治小麦赤霉病中的应用。具体的技术方案如下：
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对于赤霉菌具有显著的抑菌效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12C GMCC No.3380对于水稻白叶枯病菌具有显著的抑菌效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对于酵母菌具有显著的抑菌效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对于小麦具有显著的促进生长效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对于拟南芥具有显著的促进生长效果。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380菌株的应用方法为：发酵培养→稀释→喷洒→效果测定。
所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380菌株的发酵培养，其培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl0.5g/L，KH2PO4 1g/L，Fe2SO4·6H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5.0mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，其余为过滤水，调节至pH7.0。
本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380是一种对小麦赤霉病有良好防治效果的芽孢杆菌，并且是一种低温适生菌，可以在10℃的温度下生长，对环境无污染，能够显著抑制赤霉菌、水稻白叶枯病菌和酵母菌，还能够显著促进小麦和拟南芥生长，具有潜在的生防价值。
附图说明
图1是实施例2的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380的芽孢照片。
图2是实施例6的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380对赤霉菌的抑菌作用照片。
图3是实施例7的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380对水稻白叶枯病菌的抑菌作用照片。
图4是实施例8的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380对酵母菌的抑菌作用照片。
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1：
采用五点取样法，于西藏拉萨尼木县小麦根围土中深5-25mm处采取土样装入采样袋内，标记好采样时间、地点、植被。称取土样5g，溶于45ml生理盐水，摇床上震荡混匀30min，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl涂LB平板，37℃过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线纯化后编号保存，筛选得到短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380。
实施例2：
参照《芽孢杆菌属》（蔡妙英等译，农业出版社，1988年）和《微生物分类学》（张继忠，上海复旦大学出版社，1995）的试验方法，对实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的形态特征和生理生化特征进行检测。
结果表明，该菌革兰氏染色阳性，杆状，能产芽孢如图1所示，能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7%NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
实施例3：
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380接种于液体LB培养基，180rpm，37℃震荡培养10h，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA。
以基因组DNA为模板，用正向引物PRB1601（5’-GGATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3’）（SEQ ID NO:1）和反向引物PRB1602（5’-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGGC-3’）（SEQ ID NO:2）对16S rRNA进行PCR扩增。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。回收PCR产物后送测序，经确认16S rRNA部分基因序列长度为485bp，其结果如序列表所示，在GenBank中与Bacillu spumilus GQ911554.1相似性为99%。
实施例4：
按照表1配方配制1C培养基：
表1
| 组成成分 | 浓度 | 1×1C | 5×1C |
| 蛋白胨 | 0.7 | 4.2g | 21g |
| 氯化钠 | 0.5 | 3g | 15g |
| 大豆粉 | 0.3 | 1.8g | 9g |
| 终体积 | 600ml | 600ml |
按照如下方法配制土壤浸出液：
将500g土壤加入到1L蒸馏水中，98℃加热45min，滤纸过滤，高压灭菌后于4℃保藏。
按照表2配方配制主要培养基：
表2
| 组成成分 | 终浓度 | 体积（ml） |
| 5×1C | 1× | 50 |
| 20%葡萄糖 | 0.1% | 1.25 |
| 土壤浸出液 | 10% | 25 |
| 水 | 173.75 |
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380接种到上述主要培养基中，37℃培养过夜，取5μl菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培养箱中培养，每天记录菌株生长情况，记录15天。
结果表明，本发明的的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380能够在温度≤10℃的环境中生长。将在10℃的温度下能够在一周内显现菌落的菌株记为低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380，进一步测试的结果表明其可以在4℃的条件下生长。
实施例5：
将实施例1获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380接种到接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时，得到短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的发酵液。
其中发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl0.5g/L，KH2PO4 1g/L，Fe2SO4·6H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5.0mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，其余为过滤水，调节至pH7.0。
实施例6：
采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径1cm的赤霉菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上打5μl的实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12CGMCC No.3380的发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观察短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12CGMCC No.3380对赤霉菌的抑菌效果。
结果如附图2所示，可见抑菌圈平均直径为10mm，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对赤霉菌具有显著的抑菌作用。
实施例7：
采用平板对峙法，在150ml的NA培养基中加入培养好的水稻白叶枯病菌5ml，倒NA平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，吸取5μl的实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12CGMCC No.3380的发酵液打在滤纸片上，28℃培养3天，观察短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对水稻白叶枯病菌的抑菌效果。
结果如附图3所示，可见左面和下面菌落的抑菌圈平均直径为16.5mm，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对水稻白叶枯病菌具有显著的抑菌作用。
实施例8：
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380接种到1C培养基中培养8h，然后以1：100的比例转接到10ml的Landy培养基中，发酵约40小时，离心收集上清液，于4℃贮藏备用。
将待测真菌菌株酵母菌接种到适宜培养基中培养过夜，测定OD值后将菌液稀释到107cfu/ml，混合培养基制成含菌平板。待冷却完全后，十字交叉打孔（距平板中心2.5cm），接种低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12CGMCC No.3380于Landy培养基发酵上清液。放置室温下培养2d，观察对于酵母菌的抑菌效果。
结果如附图4所示，可见抑菌圈平均直径为28mm，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380对酵母菌具有显著的抑菌作用。
实施例9：
小麦种子用清水浸泡2h，于28℃潮湿条件下催芽，播种于装有无菌土壤的周转箱，待小麦苗长到5片真叶的时候灌根，平均每株小麦苗浇20ml实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的发酵液（浓度为108cfu/ml），用清水做对照。两周后抽取10株苗，测定株高、根长和植株鲜重。
结果表明，经菌液处理过的小麦苗明显比对照组的长势好。经测定，株高增加率达到61.5%，根长增加率达到3.4%，鲜重增加率达到124.5%。即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380能够显著促进小麦生长。
实施例10：
拟南芥种子经次氯酸钠（有效Cl含量为5%）表面消毒后，播种到MS培养基平板（9cm）上，温室培养一周备用。
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将菌液浓度定量为105cfu/ml。
拟南芥种苗用上述菌液浸根5min后，种到MS平板（20×20cm）上，每个平板4颗苗，每个菌株设置3个重复。温室培养21d，取出平板称量每颗拟南芥的鲜重。阴性对照为新鲜液体培养基浸根。
结果表明，用菌液处理的拟南芥平均鲜重为0.04935g，阴性对照0.039444g，即本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380能够显著促进拟南芥生长。
实施例11：
将实施例5的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCC No.3380的发酵液稀释100倍，在抽穗前15天前开始向小麦喷雾施发酵液，之后每间隔7天喷1次，共喷3次。
结果表明，本发明的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LNXM12 CGMCCNo.3380的发酵液具有显著的防治小麦赤霉病和提高小麦产量的效果，其生防效果可达68%，增加产量12%。
应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的原料配比及制备步骤，但本发明并不局限于上述配比及制备步骤，即不意味着本发明必须依赖上述制备步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表：（SEQ ID NO:3）
TGAGCGTAGTTGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGTAGCTTTACGATCCGAAGACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGATCCA
Claims (1)
1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LNXM12CGMCC No.3380在抑制酵母菌中的应用；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LNXM12于2009年11月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.3380，是从西藏拉萨尼木县小麦根围土中分离获得；其形态特征和生理生化特征为：革兰氏染色阳性，杆状，能产芽孢，能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7％NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵试验和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
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| 高寒草甸根围拮抗芽孢杆菌筛选鉴定及脂肽化合物分析;谢永丽,等;《中国生物防治学报》;20120831;第28卷(第3期);367-374 * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN102994419A (zh) | 2013-03-27 |
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