CN102978128A - 一种与amf协同抗病促生的拮抗菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌及其应用，该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491。通过在新疆阜康郊区多年种植的农田中采取土壤样品进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，并通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及***发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌的发酵液的抑菌率、稳定性等特性进行了深入研究，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌提供了新的选择，其拮抗作用对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解决具有突出的技术效果，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体说，本发明涉及一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌及其在防治蔬菜土传病害中的应用技术领域。
背景技术
在新疆由于其独特的地理及气候条件，设施农业成为蔬菜种植的主要模式之一，并且随着国家及自治区对菜篮子工程的重视，设施农业的发展速度及规模逐年提高和扩大，但由于设施农业病虫害易发、难控制的现实情况，因此对于病虫害的防控也提出了更高的要求，尤其是设施农业中的蔬菜病害尤为严重，而土传病害是防控的主要目标之一；土传病害是指生活在土壤中的病原体或者土壤中病株残体中的病菌，从作物根部或茎部侵害而引起的病害；设施农业蔬菜土传病害主要有蔬菜根结线虫病、瓜类枯萎病、黄萎病、苗期的立枯、猝倒病等；设施农业蔬菜栽培，由于受地理条件限制，轮作倒茬困难，连作周期长，加上温度、湿度等条件有利于各种病害的发生、传播，土传病害防治难度较大，近年来，其发病率高、危害性大，已成为影响设施农业蔬菜生产效益的主要障碍因素，严重制约着蔬菜产业的发展；AM真菌丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，简称AMF，AM真菌，旧称VA菌)普遍存在于世界各地的土壤中，其宿主包括苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物；据统计，地球上90％ 的维管植物和农业生态***中大多数作物都能形成丛枝菌根；丛枝菌根真菌与植物共生可以增加植物根部的吸收面积，增加对矿质营养特别是对磷素的吸收，因此能促进植物地上部和根部的吸收，同时还能提高植物的抗逆性；针对单个AMF对于作物的生长、病害的防治，AM真菌与PGPR相互作用的效应与机制等的报道、研究较多，但是能与AM真菌协同抗病促生的拮抗菌还未见公开报道。
发明内容
针对现有技术中针对与AMF协同抗病促生的拮抗菌的未有报道及防控土传病害拮抗菌的研究的现状，本发明旨在提供一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其作为防治蔬菜土传病害拮抗菌中的应用，通过试验验证，采用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有拮抗作用的细菌对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病的解决具有突出的技术效果，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌具有广泛而适用的价值。
本发明采用主要的技术方案：
通过在新疆阜康郊区多年种植的农田中采取土壤样品进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得一株编号为S-13。通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及***发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌S-13的发酵液的抑菌率、稳定性等特性进行了深入研究，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌提供了新的选择，其拮抗作用对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解决具有突出的技术效果。
本发明具体提供的一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），通过在新疆阜康郊区多年种植的农田土壤中分离、筛选和培养，获得一批作为防治蔬菜土传病害的微生物菌株，从中筛选出一株编号为S-13的菌株，防治蔬菜土传病害具有稳定而显著的效果，经微生物学分类与鉴定，属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
具体的，本发明提供的一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名为S-13。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2012年 9月3日，保藏号是CGMCC No. 6491。经微生物学鉴定为芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。该菌株最适生长条件为：温度32°C, 培养基为固体LB，培养条件：pH 7.0-7.2,时间14-16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皱，边缘不整齐，不透明；显微观察其菌体呈短杆状，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏***细菌学鉴定手册》（《Bergey,s Manual of Systematic Bacterio-logy》）和《常用细菌***鉴定手册》对S-13菌株进行形态学测定，生理生化检测确定S-13菌株为芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中的成员。通过BLAST同源比对，菌株S-13的16S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建***进化树，参见附图2所示, 菌株S-13与Bacillus amyloliquefaciens GU323369.1处于最小分支, 是其近似种；菌株16S rRNA序列提交至GeneBank中获得基因登录号为：JN676212。因而将菌株S-13确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
进一步，本发明提供与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌S-13（Bacillus amyloliquefaciens）作为防治蔬菜土传病害的应用。
同时，本发明证明，提供的与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌S-13（Bacillus amyloliquefaciens）作为番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病拮抗菌的应用，具有良好的拮抗能力、广谱拮抗作用。
本发明进一步提供了菌种的保存条件，采用培养基成分：蛋白胨 1%（W/V），酵母膏 0.5%（W/V），氯化钠 1% （W/V），琼脂 2%（W/V），pH 7.0-7.2，121°C灭菌20分钟。 培养条件：在其LB培养基斜面上32°C条件下，培养14-16小时，后采用无菌的脱脂牛奶为保护剂，真空冷冻干燥后低温保存；平时使用保存在LB培养基的斜面上，4°C 冰箱保存备用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。
（1）本发明提供了分离得到的芽孢杆菌CGMCC No. 6491 ,是一种解淀粉芽孢杆菌，作为防治蔬菜土传病害的应用具有较高的价值，尤其是能够针对本地生境分离出的适应本地气候及生长环境的拮抗菌对于提高作物产量，减少农药使用量，构建良好的生态环境具有积极作用。
（2）本发明针对设施农业中几种常见的蔬菜病害筛选出一株具有较好拮抗能力、广谱拮抗作用的芽孢杆菌CGMCC No. 6491，经过16S rRNA序列扩增、比对、进化树的建立初步鉴定为芽孢杆菌属，Bacillus amyloliquefaciens GU323369.1的近似种。拮抗菌S-13具有广谱抗真菌活性，能够抑制番茄枯萎病原菌、辣椒疫霉病病原菌、辣椒炭疽病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌等真菌，在平板对峙培养条件下表现良好，对于病原菌菌丝的生长具有明显的抑制作用，并且拮抗菌S-13经过抗生素诱导后的定殖研究表明，S-13能够在植株的根部土壤、根、茎、叶等不同部位都有定殖，是一株优良的拮抗菌株。同时为了能在今后方便、高效的利用，优化了其发酵培养基及发酵工艺，使芽孢率与产量得到大幅提高，对于产业化发展具有积极作用。该菌种芽孢杆菌S-13与AMF作为协同抗病促生的拮抗菌，具有良好的效果，作为防治蔬菜土传病害的应用具有潜在的应用价值，特别是作为番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病的应用，具有良好的拮抗能力、广谱拮抗作用。
附图说明
图1显示为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491 的菌落形态图。
图2显示为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491 的生长曲线图。
图3显示为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491 的16S rRNA***发育树图。
图4显示为黄瓜枯萎病发病率统计结果图。
图5 显示为平板对峙培养与番茄育苗实验图。
图6 显示为番茄发病率统计结果图。
图7显示为辣椒疫霉病植株死亡率统计结果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：
本发明采用的植物病原菌：番茄枯萎病菌株（Fusarium oxysporum）、黄瓜枯萎病原菌（Fusarium oxysporium f. sp. cucumerinum）、辣椒疫霉病原菌（Phytophthora cap-sici Leonian）都由ACCC (中国农业微生物菌种保藏中心) 提供，本发明选用的AM真菌，本领域技术人员都可以通过公众渠道获得。
培养基及其它材料：培养基选用： LB固体、液体培养基；作物种子采用番茄、黄瓜、辣椒作为蔬菜类中代表性试验种类。
主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-100。PCR仪 Eppendorf No:5345，电泳仪Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio,GK-330C plus，PCR预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。
本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491的分离、筛选及鉴定
（1）拮抗菌的分离和筛选
从农田土样中通过梯度稀释法分离出多株细菌，采用平板对峙法，根据有无抑菌圈判断其是否具有拮抗作用，初步筛选出对番茄枯萎病原菌、黄瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌具有一定拮抗能力的菌株。对具有拮抗作用的菌株进行二次对峙实验，筛选出拮抗能力较强的菌株以备后续实验。
复筛获得一株具有良好拮抗番茄枯萎病原菌、黄瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌作用的细菌分离物，命名为S-13，培养72小时其能够明显的抑制病原菌菌丝的生长，经多次实验验证其抑菌效果较为稳定。
参见附图1，获得的S-13菌在培养基培养，该菌株最适生长条件为：温度 32 °C, 培养基为LB固体培养基，培养条件： pH7.0,温度32°C条件下培养14-16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皱，边缘不整齐，不透明；显微观察其菌体呈短杆状，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏***细菌学鉴定手册》（《Bergey,s Manual of Systematic Bacterio-logy》）和《常用细菌***鉴定手册》对S-13菌株进行形态学测定，生理生化检测确定S-13菌株为芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中的成员。通过上述对S-13菌株进行形态学测定，并对菌株S-13的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的S-13菌株生物学特性如表1所示。
（2） PCR 扩增拮抗菌16S rRNA 序列及其测序
挑取少量单菌落，放入盛有25μL无菌水的EP管中, 100°C煮沸8-10 min，后迅速放入冰水混合物中5 min。离心10000 r/min、5 min，4°C保存，用时取上清。PCR扩增16S rRNA序列。
引物1 (27F)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
引物2 (1492R)：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
PCR扩增反应体系为50μL,含有24μL premix Taq,引物1 1μL，引物2 1μL，模板2μL，无菌水22μL。扩增条件: 94°C 4 min，94°C 55 s，53°C 30 s，72°C 90 s，30个循环；72°C 7 min。扩增产物（约1500 bp）经1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。
（3）16S rRNA 序列比对及***发育分析
将测序得到的16S rRNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rRNA序列，用Clustal X软件和MEGA 4.1Neighbor-joining 法构建***进化树，参见附图3。菌株16S rRNA序列提交利用GeneBank中的 BankIt 软件进行在线提交，获得基因登录号。
结合S-13的形态结构特征及生理生化特性，确定其为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491。
将S-13的16S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建***进化树。参见附图3所示,菌株S-13与Bacillus amyloliquefaciens GU323369.1之间进化距离最短，是Bacillus amyloliquefaciens的近似种。结合S-13的形态结构特征及生理生化特性，确定其为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
表 1 ：菌株S-13的生理生化特性
[0033] 实施例二：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.6491的生长因子
参见如下方式，但是应根据本发明提供的芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491特性确定其具体的生长因子。
把菌株S-13接种培养。结果见表2。
由表3得出, 菌株S-13最适合生长因子。
| 温度（℃） | 4 | 15 | 25 | 30 | 32 | 35 |
| 生长情况 | — | + | + | +++ | ++++ | +++ |
| 温度（℃） | 38 | 45 | 50 | |||
| 生长情况 | ++ | + | — | |||
| pH | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 生长情况 | — | — | — | — | + | ++ |
| pH | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| 生长情况 | +++ | + | — | — | ||
| NaCl浓度 | 0.5％ | 1％ | 2％ | 3％ | 4％ | 5％ |
| 生长情况 | + | ++ | +++ | +++ | +++ | + |
| NaCl浓度 | 6％ | 7％ | 8％ | 9％ | 10％ | |
| 生长情况 | — | — | — | — | — | |
| 氨苄青霉素μg/ml | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
| 生长情况 | — | — | — | — | — | — |
表2：温度、pH、盐、抗生素对菌株S-13生长的影响
实施例三：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491的发酵工艺研究
拮抗菌S-13为一株芽孢杆菌，为了在生产实践中更好的应用和发挥其作用，我们期望能够通过培养基与培养条件的优化，能偶使其产生大量芽孢，不但有利于节省后处理成本，更有助于其活性的保持。通过碳、氮源、pH值等的优化来实现产芽孢的目的。
(1)培养基、pH的确定
按pH值6.0,6.5, 7.0, 7.5,8.0，在220 r/min，温度 30℃条件下发酵得出最适生长pH值。
（2）生长曲线及培养条件
表3 pH优化结果
| 6.0 | 6.5 | 7.0* | 7.5 | 8.0 | |
| S-13 | 0.288 | 1.357 | 1.463 | 1.421 | 0.088 |
参见附图2拮抗菌S-13生长曲线，及见表3的 pH优化结果，从以上结果得出S-13作为种子的最佳培养时间为16h，最适生长pH为7.0，大量产芽孢时间为24h。
(3) 碳源和氮源的优化
种子液体培养基：白砂糖 2.0%，酵母膏 0.5%，玉米浆 7.5％，KH2PO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，在种子培养基的基础上继续优化；
A．碳源优化：
碳源分别为葡萄糖，蔗糖，玉米粉，可溶性淀粉，其他成分为KH2PO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH7.0；
B. 氮源优化：
氮源分别为蛋白胨，酵母膏，(NH4)2SO4，其他成分同碳源优化试验。试验均为 3 次重复。
通过不同碳源和氮源OD值检测，得出菌株的最适碳源和氮源。
OD值：取发酵液0.5mL，加2.5M HCL 1mL，加13.5mL去离子水，混匀，用分光光度计，在540nm波长下测定。
（4）发酵培养基、碳、氮源优化结果
表4 试验设计优化发酵培养基中最佳碳源—OD值
| 葡萄糖 | 蔗糖 | 玉米粉 | 可溶性淀粉 | |
| S-13 | 1.596 | 1.643 | 1.685* | 1.644 |
表5 试验设计优化发酵培养基中最佳氮源—OD值
| 蛋白胨 | 酵母膏 | （NH4）2 SO 4 | |
| S-13 | 1.476 | 1.621* | 1.395 |
根据以上结果确定最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为酵母膏。
（5） 10L发酵罐发酵结果
在以玉米浆和玉米粉为主要原料的培养基中，发酵条件为：温度32℃，转速250rpm，通气1:0.3，时间在24h。其结果如下：
表6 10L发酵实验结果
| 菌株 | 发酵时间 | 稀释倍数 | OD 540nm |
| S-13 | 24h | 30 | 0.575 |
发酵结束后镜检结果表明，几乎全部产芽孢，经热处理涂板计数表明，产芽孢率达到95%以上，经冻干处理，芽孢存活率高于90%。
优化发酵结果表明，菌株S-13作为种子的最佳培养时间为16h，最适生长pH为7.0，大量产芽孢时间为24h；确定最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为酵母膏，经10L发酵结束后镜检结果表明，几乎全部产芽孢，经热处理涂板计数表明，产芽孢率达到95%以上，经冻干处理，芽孢存活率高于90%。
实施例四：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491与AM真菌协同作用结果
1 实验设置：
1.1 本试验每种病原菌设置三个实验处理，一组为只加病原菌的对照组，另外一组为加入病原菌与AM真菌的处理组，其余一组为同时加入本发明拮抗菌S-13与AM真菌的处理组，每30株苗为一个实验处理。在接种完的第50天进行统计，计算作物死亡率。
1.2 病原菌处理与本发明拮抗菌接入
用灭菌后的大田土在育苗床上培育作物苗，分为家AM真菌和不加AM真菌两组，待苗长至一叶一芯时进行分苗，采用蘸根接种法，将根部稍加损伤放入106 个孢子/mL的病原菌的孢子悬浮液中浸根接种15min，然后栽入直径为8 cm、装有灭菌大田土的营养钵中，每钵一株，实验组继续在营养钵中加入AM真菌。温室中培育1天后，采用灌根方式加入拮抗菌悬液，灌根处理组将根系周围的土扒开，浇灌拮抗菌浓度为108cfu/mL的菌悬液10mL，其余组则灌溉相同量的清水。
2 协同作用研究及结果
2.2 对黄瓜抗病性协同作用研究
参见附图4 黄瓜枯萎病发病率统计结果图。在黄瓜育苗协同研究中，在接种黄瓜枯萎病病原菌和拮抗菌50天后调查显示：两对照组的死亡率均超过80%，最低的是接种拮抗菌S-13的实验组，黄瓜植株死亡率30%左右，由此结果分析来看，本发明拮抗菌S-13与AM真菌在抵抗、防治黄瓜枯萎病方面具有较好的协同增效作用；
2.3 对番茄抗病性协同作用研究
参见附图5平板对峙培养与番茄育苗实验及附图6番茄发病率统计结果。在番茄育苗协同研究中，在接种番茄枯萎病病原菌和拮抗菌50天后调查显示：
对照组发病率超过70%，其余组发病率均较低，最低的为加入拮抗菌S-13的实验处理，其发病率仅为2.4%。番茄枯萎病的拮抗协同作用以本发明菌株S-13效果较好，于AM真菌共同作用后具有显著的协同抗番茄枯萎病的作用。
2.4 辣椒疫霉病协同拮抗结果
参见附图7 辣椒疫霉病植株死亡率统计结果。从对辣椒疫霉病的拮抗合协同作用研究来看，未加拮抗菌的处理辣椒植株在调查时的死亡率均超过60%，不加AM真菌和拮抗菌的对照组最高达到80%以上，而加入拮抗菌的实验组发病率较低，发病率低于20%，说明拮抗菌与AM真菌能够协同抗辣椒疫霉病病原菌。
在与AM真菌共同育苗研究来看，本发明拮抗菌S-13与AM真菌在抵抗、防治黄瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒疫霉病方面具有较好的协同作用，能够有效降低植株死亡率和发病率。表明本发明提供的芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491作为防治蔬菜土传病害的应用具有潜在的应用价值，拮抗菌S-13解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No.6491作为防治蔬菜土传病害中的应用中具有很好的作用。
Claims (5)
1.一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌，其特征在于，拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491。
2.如权利要求1所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491作为防治蔬菜土传病害中的应用。
3.如权利要求1所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491作为番茄枯萎病拮抗菌的应用。
4.如权利要求1所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491作为黄瓜枯萎病拮抗菌的应用。
5.如权利要求1所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC No. 6491作为辣椒疫霉病拮抗菌的应用。
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102978128B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232509A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-12-24 | 海南万绿宝生物科技有限公司 | 一种解淀粉芽孢杆菌菌株Bg-1及其应用 |
| CN104651273A (zh) * | 2015-01-29 | 2015-05-27 | 青岛农业大学 | 一种球囊霉属真菌与芽孢杆菌的组合菌剂及其应用 |
| CN105907683A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-08-31 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一株解淀粉芽孢杆菌cd5bc及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101659933A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-03-03 | 南京农业大学 | 防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN101948771A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-19 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN102154156A (zh) * | 2010-12-28 | 2011-08-17 | 南京农业大学 | 能防治番茄青枯病或根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN102153618A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法 |
| CN102485880A (zh) * | 2010-12-01 | 2012-06-06 | 中国农业科学院研究生院 | 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN102604864A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-25 | 陕西加伦多作物科学有限公司 | 一种微生物杀菌剂及其应用 |
-
2012
- 2012-11-01 CN CN 201210430252 patent/CN102978128B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101659933A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-03-03 | 南京农业大学 | 防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN101948771A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-19 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN102485880A (zh) * | 2010-12-01 | 2012-06-06 | 中国农业科学院研究生院 | 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN102154156A (zh) * | 2010-12-28 | 2011-08-17 | 南京农业大学 | 能防治番茄青枯病或根结线虫的拮抗菌及其微生物有机肥料 |
| CN102153618A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法 |
| CN102604864A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-25 | 陕西加伦多作物科学有限公司 | 一种微生物杀菌剂及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 杨胜远 等: "一株产抗菌活性物质解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定", 《食品科学》, vol. 31, no. 21, 1 November 2010 (2010-11-01), pages 208 - 212 * |
| 王英国 等: "解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究", 《中国生物工程杂志》, vol. 27, no. 12, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 41 - 45 * |
| 陈成 等: "一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究", 《现代食品科学》, vol. 27, no. 1, 31 January 2011 (2011-01-31), pages 36 - 41 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232509A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-12-24 | 海南万绿宝生物科技有限公司 | 一种解淀粉芽孢杆菌菌株Bg-1及其应用 |
| CN104232509B (zh) * | 2014-07-25 | 2016-09-21 | 海南万绿宝生物科技有限公司 | 一种解淀粉芽孢杆菌菌株Bg-1及其应用 |
| CN104651273A (zh) * | 2015-01-29 | 2015-05-27 | 青岛农业大学 | 一种球囊霉属真菌与芽孢杆菌的组合菌剂及其应用 |
| CN105907683A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-08-31 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一株解淀粉芽孢杆菌cd5bc及其应用 |
| CN105907683B (zh) * | 2016-06-02 | 2019-07-12 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一株解淀粉芽孢杆菌cd5bc及其应用 |
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|---|---|
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