CN101948771A

CN101948771A - 防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN101948771A
Application number: CN2010102645205A
Authority: CN
Inventors: 张淑梅; 王玉霞; 李晶; 赵晓宇; 孟利强; 张先成; 张云湖
Original assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: CN101948771B

Abstract

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用，它涉及解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28，为解淀粉芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属，保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月26日。应用：一、制备活化菌液；二：活化菌液接种于NYD培养液中培养得菌株发酵液；三、种子浸泡于菌株发酵液的50倍稀释液中即完成。本发明中菌株TF28能在植物体内定殖、繁殖和传导，该菌株可同时产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，具有防病促生、增产提质、抑菌谱广等多重功效；采用菌株TF28发酵液的50倍稀释液处理水稻种子，对水稻恶苗病温室防效达到84.6％以上。

Description

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物病害是影响农业高产、稳产和优质生产的主要因素之一，每年农业上因病害而造成的损失占到总产值20％左右，每年因病害造成的直接经济损失高达50亿以上，长期以来都是使用化学农药进行防治，但化学农药一直存在着耐药性、污染环境、农药残留、生物多样性降低、人畜毒害等诸多无法克服的弊端。

生物农药由于其对人畜毒性小，环境兼容性好，病虫不易产生抗性等优点而符合现代社会对农业生产及农药的要求，具有广阔的发展空间。绝大多数生产生物农药的菌株是从植物根际土壤微生物中分离筛选得到，由于这些土壤生防菌易受外界环境条件的影响，在与土壤、植物根际或叶围习居微生物的竞争中不易长期定殖并占优势，防病效果不理想，因而极大地影响了它们的实际防病效果。

植物内生细菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物，具有在植物体内快速定殖、传导和繁殖功效，许多内生细菌具有固氮、促生、抗旱、防病等生物学功能，内生细菌作为潜在的生防资源，可以弥补土壤来源的生防菌田间防效不稳定的缺陷，是最具发展潜能的新型生防菌株。

发明内容

本发明提供防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用。

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，它为防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28，为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月26日；防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28为革兰氏阳性好氧菌，为杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为0.5μm～1.5μm，内生芽孢，无鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

本发明中防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28葡萄糖发酵试样阳性、淀粉水解试验阳性、明胶液化试验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用阳性、好养生长、生长pH值为6.5～8.5，生长温度为30～37℃。

本发明中防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，菌株号为TF28，为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月26日。

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用：一、取-70℃冷冻保存的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28的菌液，划线接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的LB液体培养基中，30℃震荡培养18～20h，得到活化菌液；二：按2％～5％接种量将活化菌液接种于装有100ml NYD培养液的500ml三角瓶中，30℃培养32～50h，转速为150～250r/min，发酵结束菌液浓度达到20～40亿/ml，即为防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28菌株发酵液；三、待防治的种子预先用水浸泡5～7d，再浸泡于防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28菌株发酵液的50倍稀释液中2d即完成种子的防病。

本发明防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28，是从大豆根部分离的对大豆根腐病、水稻恶苗病等多种植物病原真菌具有较高防效的生防菌株，具有在大豆、水稻等多种作物根部定殖能力，是一株极具有开发应用价值的生防菌株。

本发明中菌株TF28能在植物体内定殖、繁殖和传导，该菌株可以同时产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，具有防病促生、增产提质、抑菌谱广等多重功效；

本发明防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用中，制剂生产成本低廉，操作简单，易于实施，可批量生产和推广应用；菌株TF28的菌剂有利于保护农田生态环境，减少农药残留，适合于我国无公害农产品生产的要求；采用菌株TF28发酵液的50倍稀释液处理水稻种子，对水稻恶苗病温室防效达到84.6％以上，同时，对三种大豆根腐病菌(镰刀菌根腐病、腐霉根腐病和疫霉根腐病)、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、辣椒早疫病菌、大豆菌核病菌、黄瓜立枯病菌、水稻恶苗病菌、水稻稻瘟病菌均具有较强抑制作用。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，它为防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28，为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月26日；防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28为革兰氏阳性好氧菌，为杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为0.5μm～1.5μm，内生芽孢，无鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

本实施方式中防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌是根据《伯杰细菌鉴定手册》初步判定为芽孢杆菌属，然后经过SHERLOCK微生物***鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28抑菌谱：采用对峙培养方法确定菌株抑菌谱，供试病原菌有12种，为F.oxysporum soybean(引起大豆根腐病的尖孢镰孢菌)、Rhizoctonia solani soybean(引起大豆根腐病的立枯丝核菌)、Phythium spp.(引起大豆根腐病的腐霉菌)、F.oxysporum cucumber(黄瓜枯萎病菌)、F.oxysporum melonis(甜瓜枯萎病菌)、Fusarium oxysporum niveum(西瓜枯萎病菌)、Botrytis cinerea tomato(番茄灰霉病菌)、Alternaria solani pepper(辣椒早疫病菌)、Sclerotinia sclerotiorum soybean(大豆菌核病菌)、Fusariummoniliforme sheld(水稻恶苗病菌)、Pyricularia oryzae cay.(水稻稻瘟病菌)和R.solani cucumber(黄瓜立枯病菌)，取一环活化菌液十字划线于PDA平板上，在距接种线3cm处接种病原菌(菌块直径5mm)28℃培养7d，测量抑菌带宽度，试验结果如表1所示，可见菌株TF28对上述病原菌均具有较强抑制作用，抑菌带宽度为8.4mm～15.2mm。

表1

菌株	抑菌带宽(mm)
		F.oxysporum soybean	15.2±0.09
Rhizoctonia solani soybean	14.8±0.12
		Phythium spp.	13.2±0.04
E oxysporum cucumber	13.5±0.10
		F.oxysporum tomato	12.8±0.07
F.oxysporum niveum	12.3±0.08
		Botrytis cinerea tomato	9.8±0.07
Alternaria solani pepper	8.7±0.09
		Sclerotinia sclerotiorum soybean	8.4±0.11
Fusarium moniliforme sheld	13.2±0.09
		Pyricularia oryzae cav.	8.6±0.03
R.solani cucumber	9.6±0.04

防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌物质的确定：

1、抗菌蛋白的确定：取培养48h的菌株TF28的菌液，4000r/mim离心，收集上清液，加入40％饱和度的(NH₄)₂SO₄，4℃过夜放置沉淀抗菌蛋白，10000r/mim离心，收集沉淀，用磷酸缓冲液溶解后透析除盐，用PEG8000浓缩后，装入无菌塑料管中-20℃冷冻保存；取10μl样品采用纸片法测定对水稻恶苗病菌的抑制情况，结果表明菌株TF28能够产生抗菌蛋白，该抗菌蛋白对水稻恶苗病具有抑制作用；

2、脂肽类抗生素的确定：取培养48h的菌株TF28的菌液，4000r/mim离心，收集上清液，加入浓盐酸至pH值为4.0，4℃过夜沉淀，10000r/mim离心，收集沉淀，干燥后用甲醇浸提；取10μl样品采用纸片法测定对水稻恶苗病菌的抑制情况，结果表明菌株TF28能够产生脂肽类抗生素，该脂肽类抗生素对水稻恶苗病具有抑制作用。

本实施方式中防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28是从大豆根部分离得到的，大豆选取自黑龙江省东大2号品种，其分离方法如下：

1、将大豆根部用流水冲洗干净，取1g作为供试材料，切成2mm小段，依次用质量浓度为70％的酒精和质量浓度为2％的次氯酸钠浸泡10min进行表面消毒，杀灭供试材料表面微生物；

2、在无菌环境中，供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次无菌水冲洗液涂布于NYD固体培养基上培养48h，观察有无菌落产生；

3、向供试材料加5ml无菌水匀浆，取100μl涂布于NYD固体培养基上，30℃培养48h，挑取单菌落在NYD固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止；

4、将纯系菌株接种于NYD液体培养基中，30℃培养18h，取菌液700μl加入质量浓度为50％的甘油300μl，混合后置于-70℃冰柜中冷冻保存；

其中步骤2目的是验证供试材料表面微生物是否能全部杀死，若有菌落产生，则证明材料表面微生物没有全部杀死，反之则无。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，葡萄糖发酵试验阳性、淀粉水解试验阳性、明胶液化试验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用阳性、好养生长、生长pH值为6.5～8.5，生长温度为30～37℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用：一、取-70℃冷冻保存的菌株TF28的菌液，划线接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的LB液体培养基中，30℃震荡培养18～20h，得活化菌液；二、按2％～5％接种量将活化菌液接种于装有100ml NYD培养液的500ml三角瓶中，30℃培养32～50h，转速为150～250r/min，发酵结束菌液浓度达到20～40亿/ml，即为菌株发酵液；三、待防治的种子预先用水浸泡5～7d，再浸泡于菌株发酵液的50倍稀释液中2d即完成。

本实施方式中菌株发酵液对水稻恶苗病的防治效果实验：

供试病原菌：水稻恶苗病菌，用麦粒培养基培养，待菌丝长满后，磨碎后得病原菌粉，备用；

供试药剂：菌株发酵液的50倍稀释液，水稻化学药剂(25％施保克)；

供试作物：水稻；品种：松粳9号；

种子筛选：筛选饱满均匀的种子；

病原菌接种：取10g病原菌粉，均匀撒入50cm×50cm育苗播种；

实验处理：先将水稻种子用清水浸泡7d后，捞出再进行以下处理：

处理1：将用水浸泡过的种子用菌株发酵液的50倍稀释液浸泡2d，捞出催芽，待种子刚破胸后播种于接种病菌的育苗钵中，每钵400粒种子；

处理2：空白对照，将用水浸泡过的种子催芽后直接播种于不接病菌的育苗钵中，播种量为每钵400粒种子；

处理3：病菌对照，将用水浸泡过的种子催芽后直接播种于接病菌的育苗钵中，播种量为每钵400粒种子；

处理4：化学药剂对照，将用水浸泡过的种子用25％施保克浸泡2d，捞出催芽，待种子刚破胸后播种于接种病菌的育苗钵中，每钵400粒种子；

调查：浸种后调查水稻种子发芽率，出苗后调查出苗率，在3叶期调查恶苗病发生情况以及生长性状；实验结果如表2所示，可见，本实施方式中菌株TF28的菌株发酵液的50倍稀释液有效防治水稻恶苗病发生结果，防效为84.6％，与化学药剂防效相当；

表2

处理	发芽率％	出苗率％	发病率％	防效％
					1	90.2	96.5	6.7	84.6a
2	89.8	94.5	5.8
					3	89.8.	67.8	43.6
4	89.3	93.4	5.2	88.1a

出苗率如表3所示，从出苗率上看，本实施方式中菌株TF28的菌株发酵液的50倍稀释液处理组最高，其次是空白对照和化学药剂对照，病菌对照组最低；处理组1和化学药剂处理组4在茎宽、根长、根数、株鲜重和叶宽指标上均优于空白对照2和病菌对照3，且达到显著差异水平；处理组1各项指标优于化学药剂处理组4，但两者差异不显著，可见，以本实施方式中菌株TF28的菌株发酵液的50倍稀释液作为菌剂可以替代化学药剂用于防治水稻恶苗病，而且该菌剂对水稻生长具有显著促进作用，可以使茎叶增宽，根增长，根数和株鲜重增加。

表3

处理

株长cm

茎宽cm

根长cm

根数(条)

株鲜重g

叶宽cm

1

22.3b

0.25a

5.3a

18a

0.25a

0.42a

2

25.8b

0.15b

4.8a

14ab

0.12b

0.34ab

3

32.5a

0.09c

3.2b

9b

0.08b

0.14b

4

20.3b

0.21a

4.8a

14ab

0.20a

0.38a

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤一中LB固体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、10g的NaCl和余量的水组成，pH值为6.0～8.0。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤一中LB液体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10g的NaCl和余量的水组成，pH值为6.0～8.0。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是步骤二中NYD培养液每1000mL由8g牛肉膏、5g酵母膏、10g葡萄糖和余量的水组成，pH值为7.0～8.0。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。

Claims

1.防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，其特征在于它为防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28，为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4038，保藏日期为2010年7月26日；防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28为革兰氏阳性好氧菌，为杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为0.5μm～1.5μm，内生芽孢，无鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

2.根据权利要求1所述的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌，其特征在于防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28葡萄糖发酵试验阳性、淀粉水解试验阳性、明胶液化试验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用阳性、好养生长、生长pH值为6.5～8.5，生长温度为30～37℃。

3.如权利要求1中所述防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用：一、取-70℃冷冻保存的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28的菌液，划线接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的LB液体培养基中，30℃震荡培养18～20h，得到活化菌液；二：按2％～5％接种量将活化菌液接种于装有100ml NYD培养液的500ml三角瓶中，30℃培养32～50h，转速为150～250r/min，发酵结束菌液浓度达到20～40亿/ml，即为防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28菌株发酵液；三、待防治的种子预先用水浸泡5～7d，再浸泡于防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28菌株发酵液的50倍稀释液中2d即完成种子的防病。

4.根据权利要求3所述的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于步骤一中LB固体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、10g的NaCl和余量的水组成，pH值为7.0～8.0。

5.根据权利要求4所述的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于步骤一中LB液体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10g的NaCI和余量的水组成，pH值为7.0～8.0。

6.根据权利要求5所述的防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于步骤二中NYD培养液每1000mL由8g牛肉膏、5g酵母膏、10g葡萄糖和余量的水组成，pH值为7.0～8.0。