KR101245304B1

KR101245304B1 - 알지네이트 라이아제 활성을 가지는 메타지놈 라이브러리

Info

Publication number: KR101245304B1
Application number: KR1020110046195A
Authority: KR
Inventors: 김두운; 신태선; 성치남; 백근식; 심수정
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2013-03-19
Also published as: KR20120128328A

Abstract

본 발명은 알지네이트 라이아제 활성을 가지는 메타지놈 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명은 서열목록 제1서열의 1280-3652 번째 뉴클레오타이드 서열, 5025-6128 번째 뉴클레오타이드 서열, 6365-7492 번째 뉴클레오타이드 서열, 8687-9202 번째 뉴클레오타이드 서열, 9206-9823 번째 뉴클레오타이드 서열, 9823-11250 번째 뉴클레오타이드 서열, 11377-12189 번째 뉴클레오타이드 서열, 12290-13306 번째 뉴클레오타이드 서열, 13611-14642 번째 뉴클레오타이드 서열, 14646-15212 번째 뉴클레오타이드 서열, 15417-16388 번째 뉴클레오타이드 서열, 17370-19223 번째 뉴클레오타이드 서열, 19452-21017 번째 뉴클레오타이드 서열, 21253-22143 번째 뉴클레오타이드 서열, 22309-23121 번째 뉴클레오타이드 서열, 23333-24208 번째 뉴클레오타이드 서열, 24294-24989 번째 뉴클레오타이드 서열, 25446-26477 번째 뉴클레오타이드 서열, 26549-28063 번째 뉴클레오타이드 서열, 28362-29579 번째 뉴클레오타이드 서열, 30103-30930 번째 뉴클레오타이드 서열 및 31010-31696 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 22개의 오픈리딩프레임을 포함하는 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명은 자연의 미생물군에 존재하는 미지의 메타지놈을 분석하여 신규 미생물 및 단백질을 제공한다.

Description

알지네이트 라이아제 활성을 가지는 메타지놈 라이브러리{Metagenome Libraries with Alginate Lyase Activity}

본 발명은 알지네이트 라이아제 활성을 가지는 메타지놈 라이브러리에 관한 것이다.

해조류는 우리나라 연근해에 풍부하게 서식되고 있는 생물로서 잠재적인 자원이다. 대부분의 해조류는 단순가공을 거쳐 식용으로 활용되고 있으나 앞으로는 바이오에너지원으로서 또는 기능성 식품 및 의약 원료로서 활용이 기대되는 자원이다.

해조류의 구성 성분은 다당류가 대부분을 이루고 있으나 염분의 함량이 높으며 점액성의 다당체에 의해 표층이 둘러 쌓여있다. 따라서 해조류를 자원으로서 활용하기 위해서는 다당체의 분해가 우선 수반되어져야 한다. 섬유소와 한천 같은 다당체는 β-1,4-글리코사이드(glycoside)로서 여러 종류의 미생물에 의해 분해가 가능하다. 그러나 육상 식물체의 다당체를 기질로 이용하는 미생물과 해조류의 다당체를 기질로 이용하는 미생물은 서식환경이나 기질의 염분도 측면에서 서로 다르다. 예로써 매생이의 세포벽 분해능이 우수한 세균을 몇 차례 계대 배양할 경우 세포벽 분해능이 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위해서는 해조류의 다당체 분해능이 우수한 다양한 미생물을 분리하고 이 미생물들이 안정적으로 해조류를 분해 할 수 있는 조건을 확립하는 것이 필요하다.

알긴산 같은 해조 다당체의 중합도를 낮추기 위하여 염산, 유기산에 의한 산가수분해법에 의하여 중합도를 낮추어 저분자화 알긴산을 제조하고 있다. 산에 의한 저분자화 알긴산 제조법은 공정상 과도한 산처리 때문에 내산성 장치와 폐기되는 강산을 중화시켜 배출해야 하기 때문에 다량의 알칼리가 소요됨으로써 공정비가 높다. 그러나 전복 유래 미생물 효소를 이용하여 강산과 강알칼리가 소요되지 않고 온화한 반응조건 하에서 저분자화 알긴산을 생산할 수 있는 반응 조건을 확립함으로써 기능성 다당류를 생물공학적으로 대량생산하는 기술을 활용하여 해조류 가공공정에서 파생되는 폐기물의 양을 감소시키고 자원의 활용도를 높이는 기술 확립이 필요하다.

자연 환경에 서식하고 있는 미생물들의 배양방법은 매우 복잡하고 까다롭다. 실제 환경 생태계로부터 분리 배양할 수 있는 미생물은 1% 미만으로 전통적인 배양기법으로는 배양이 불가능하다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 미생물의 분리 및 배양 없이 세균군집의 다양성과 구조, 기능을 파악하기 위한 방법으로 분자 생물학적인 방법들이 응용되고 있다. 그 중 가장 많이 이용되는 부분이 핵산을 이용한 분자생물학적 방법인 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정을 통해 계통분류학적으로 분석함으로써 동정과 이를 응용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 16S rRNA 유전자는 세균들을 종 수준으로 구분할 수 있는 정보를 담고 있으며, 이 유전자의 염기서열의 변화는 미생물간의 진화적 유연관계를 파악하는데 매우 유용하다. 그러나 분자생물학적 방법에 의해 생태계에 존재하는 미생물의 정보를 확인한다 하더라도 미생물을 분리하고 분리된 미생물의 특성을 파악하는 것은 유전자원의 확보 측면에서 매우 중요하다.

새로운 기능성 식품 및 발효성 바이오자원에 대한 수요로 신규 미생물의 효소에 대한 요구가 증가하고 있다. 해양 생물의 장관(intestinal tracts)에서 분리한 라이아제-생산 미생물은 아가라제(agarase), 라미나라제(laminarase), 셀룰라제(cellulase) 및 알지네이트 라이아제(alginate lyase)가 혼합된 해조류-분해 효소를 생산한다.¹⁸ 또한, 알지네이트 라이아제는 미생물의 갈조류를 β-제거 기작(elimination mechanism)에 따라 α-L-guluronic acid(G), β-D-mannuronic acid(M), alternating MG(GM) 및 heteropolymeric MG(GM)로 분해한다는 다수의 보고가 있다.¹¹ 전복(abalone) 및 Psuedoalteromonas sp. IAM 14594(AF082561), Sphingomonas sp. A1(AB120939), Klebsiella pneumonia subsp. aerogenes(L19657), Vibrio sp. QY101(AY221030) 및 Psuedomonas sp. OS-ALG-9(AB003330)을 포함하는 많은 해양 박테리아의 내장으로부터 이러한 효소를 분리한다.^2,4,13,15 지금까지, 진뱅크(Genebank) 데이터베이스에 보고된 알지네이트 라이아제는 23 ORF 정도이다.²⁴ 이전의 연구에 따르면 많은 다른 미생물의 알지네이트 라이아제는 G 블록-특이 폴리구루로네이트(polyguluronate) 라이아제(EC 4.2.2.11) 및 M 블록-특이 폴리만뉴로네이트(polymannuronate) 라이아제(EC 4.2.2.3)의 2 종류 기질 특이성에 따라 분류할 수 있다.¹⁹ 최근, 고등식물의 뿌리 성장 촉진, Bifidobacterium sp. 성장 속도의 가속, 인간 단핵(mononuclear)세포의 세포독성 사이토카인 생산의 유도, IgE의 억제, 항고혈압 효과와 같은 확실한 생물학적 활성을 갖는 효소에 의해 분해된 알지네이트를 발견하였다.⁵ 때문에, 알지네이트 라이아제 및 알지네이트 올리고사카라이드는 식품 및 의약품 산업의 연구자들에게 주목을 받고 있다.

16s rRNA 유전자의 클론 라이브러리를 이용한 독립적 배양 연구는 Alpha -, Gamma -, Epsilonproteobacteria 및 mollicutes가 주요 미생물군인 전복 Haliotis discus hannai의 내장 안 전체 박테리아에 대한 다양성을 보여준다.²¹ 그러나, 상기 16s rRNA 유전자의 정보로는 미생물의 생물학적 기능을 알 수 있는 효과적인 정보를 제공하지 않는다.^17,23 대조적으로, 포스미드(fosmid) 클로닝 시스템을 이용한 메타지놈 라이브러리는 배양이 쉽지 않은 생물체의 신규 유전자를 확인할 수 있다.¹ 상기 스크리닝 시스템은 포스미드 벡터 및 다양한 환경의 샘플에서 직접 분리한 약 40 kb 의 삽입(insert) 사이즈를 이용하여 키티나제(chitinase), 디하이드로제나제(dehydrogenase), 옥시도리덕타제(oxidoreductase), 아밀라제(amylase), 이스터라제(esterase), 엔도글루카나제(endoglucanase) 및 사이클로덱스트리나제(cyclodextrinase)와 같은 광범위한 유전자를 확인하는데 이용되었다.^1,20 발명자는 메타지놈 라이브러리를 이용하여 전복의 장내 미생물군에서 고활성의 알지네이트 라이아제 유전자를 규명하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리를 구축하고자 노력하였다. 그 결과, 전복 장내 유래의 미생물을 분리하여 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리를 규명하였고, 알지네이트 라이아제가 갖는 특성을 분석함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 1280-3652 번째 뉴클레오타이드 서열, 5025-6128 번째 뉴클레오타이드 서열, 6365-7492 번째 뉴클레오타이드 서열, 8687-9202 번째 뉴클레오타이드 서열, 9206-9823 번째 뉴클레오타이드 서열, 9823-11250 번째 뉴클레오타이드 서열, 11377-12189 번째 뉴클레오타이드 서열, 12290-13306 번째 뉴클레오타이드 서열, 13611-14642 번째 뉴클레오타이드 서열, 14646-15212 번째 뉴클레오타이드 서열, 15417-16388 번째 뉴클레오타이드 서열, 17370-19223 번째 뉴클레오타이드 서열, 19452-21017 번째 뉴클레오타이드 서열, 21253-22143 번째 뉴클레오타이드 서열, 22309-23121 번째 뉴클레오타이드 서열, 23333-24208 번째 뉴클레오타이드 서열, 24294-24989 번째 뉴클레오타이드 서열, 25446-26477 번째 뉴클레오타이드 서열, 26549-28063 번째 뉴클레오타이드 서열, 28362-29579 번째 뉴클레오타이드 서열, 30103-30930 번째 뉴클레오타이드 서열 및 31010-31696 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 22개의 ORF을 포함하는 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리를 제공한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어 “알지네이트 라이아제”는 G 블록-특이 폴리구루로네이트(polyguluronate) 및 M 블록-특이 폴리만누로네이트(polymannuronate)로 구성된 알지네이트를 분해하여 저분자화 하는 효소를 의미한다.

바람직하게는 상기 메타지놈 라이브러리는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 보다 바람직하게는 상기 메타지놈 라이브러리는 전복의 내장의 미생물군(microflora)로부터 얻은 지놈 DNA를 이용하여 구축된 것이다.

본 명세서에서 용어 “메타지놈(metagenome)”은 자연계에 존재하는 총 미생물집합를 뜻하며, 토양, 해수, 갯벌, 하천, 대기 및 동물의 대장 등 다양한 자연 환경으로부터 채취한 미생물의 DNA가 그 종에 따라 분리된 것이 아니라 서로 혼재돼 섞여 있는 형태가 메타지놈이다. 또한 미생물의 기능이나 다양성을 유전자 형태로 분석하는 기술을 말한다. 메타지놈은 자연계의 여러 환경에서 존재하는 총 미생물의 유전체인 메타지놈을 클로닝 하여 숙주세포 등에서 유지, 발현시켜 메타지놈 라이브러리를 만들어 난배양 미생물의 계통을 분류하고, 유용한 효소와 이차 대사산물을 탐색하기 위한 연구이다.

본 발명의 메타지놈 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 코스미드(Bruce A. Voyles (2002) The biology of viruses 2nd ed. ISBN 0-07-237031-9) 및 포스미드( Barry G. Hall (July 2004). "Predicting the evolution of antibiotic resistance genes.". Nature Reviews Microbiology 2 (5 ). doi:10.1038/nrmicro888. PMID 15100696)를 이용하여 메타지놈 라이브러리를 구축한다.

본 발명의 메타지놈 라이브러리는, 유용한 효소(예컨대, 알지네이트 라이아제)와 이차 대사산물을 탐색하는 하기 위한 연구도구로서 유용성을 갖는다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 자연의 미생물군에 존재하는 미지의 메타지놈을 분석하여 신규 미생물 및 단백질을 제공할 수 있다.

(b) 본 발명은 해조류의 다당체 분해능이 우수한 미생물을 분리하여 안정적으로 해조류를 분해할 수 있는 효소를 제공할 수 있다.

(c) 본 발명은 기능성 다당류를 생물공학적으로 대량생산하는 기술을 활용하여 해조류 가공공정에서 파생되는 폐기물의 양을 감소시키고 자원의 활용도를 높이는 기술을 제공할 수 있다.

도 1은 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)법을 활용한 알지네이트 가수분해능 평가 결과이다. 도 1은 활성을 확인한 플레이트 스크리닝을 보여준다. Flavobacterium sp. 유래의 양성대조군(A), E. coli 유래의 음성대조군(B) 및 알지노라이틱 메타지놈 프래그먼트(AlyDW, C)를 나타낸다.
도 2는 알지노라이틱 메타지놈 프래그먼트(AlyDW)의 도식도이다. 도면에 나타나는 명암의 차이는 추정 유전자의 기능적인 분류를 나타낸다. 대각선 줄무늬는 세포의 프로세스와 관련된 ORF이며, 블랭크 화살표는 대사와 관련된 ORF이고, 밝은 회색은 정보저장과 관련된 ORF이다. 진한 회색은 상동성이 없는 불분명 유전자를 나타낸다.
도 3은 메타지놈 프래그먼트(AlyDW)의 알지네이트 라이아제 활성에 대한 pH(A) 및 온도(B)의 영향을 확인한 환원당 분석 결과를 보여준다.
도 4는 박막크로마토그래피를 활용한 메타지놈 프래그먼트(AlyDW)에 의한 알지네이트의 디폴리머리제이션 결과를 보여준다. 왼쪽 패널(a)는 40℃, 3시간 인큐베이션 후의 폴리(β-D-mannuronate, lane 1) 및 폴리(α-L-guluronate, lane 2)의 가수분해 프로필을 보여준다. 오른쪽 패널(b)는 알지네이트 및 알지노라이틱 메타지놈 프래그먼트(AlyDW)의 인큐베이션 후에 얻은 HPLC 분획의 분해된 알지네이트 산물을 보여준다. Flavobacterium sp. 유래의 양성대조군(lane 4), 음성대조군(알지네이트 유일, lane 5), 음성대조군(효소 유일, lane 6). M은 G1(글루코즈), G2(셀로바이오즈), G3(셀로트라이오즈), G4(셀로테트라오즈), G5(셀로펜타오즈), G6(셀로헥사오즈), G7(셀로헵타오즈) 및 G8(셀로옥타오즈)의 표준 혼합물이다.
도 5-6은 메타지놈 프래그먼트 유래의 추정 알지네이트 라이아제 및 메타지놈 프래그먼트(ORF-11)단백질의 얼라인 결과를 보여준다. 아미노산 서열은 ClustalX 프로그램을 이용하여 얼라인하였다. 비교한 생물은 Klebsiella pneumoniae subsp. aerogenes, Saccharophagus degradans 2-40, Microbulbifer sp. 6532A, Vibrio harveyi aDA3, Cellulophaga lytica DSM 7489, Vibrio sp. A9m, Vibrio alginolyticus 40B, Pseudoalteromonas sp. CY2, Vibrio splendidus 12B01, Polaribacter sp. MED152 및 Agarivorans sp. JAM-A1m이며 상기 생물의 진뱅크 가입 넘버는 각각 Q59478, ABD81738, BAJ62034, ZP_0617515, YP_004263738, BAH79133, ZP_06182095, ACM89454, ZP_00990010, ZP_01052859 및 BAG70358 이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

메타지놈 라이브러리 컨스트럭션(Metagenomic library construction)

2009년 2월, 대한민국 여수 근해에서 전복(abalone) 샘플을 수득하였다. 직접 DNA 추출 및 정제하여 DNA를 준비하였다.⁷ 메타지놈 라이브러리를 이전에 설명된 적절한 프로토콜을 사용하여 샘플로부터 컨스트럭트하였다.₂₈순수 정제된 DNA는 적당량의 Sau3AI 제한효소로 부분절단하고 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 40-50 kb 부분의 DNA만을 용출하였으며 CIAP(Calf intestinal alkaline phosphatase)로 DNA를 탈인산화 하였다. 메타지놈 DNA를 포스미드 벡터(pCC1FOS ready vector, Epicentre, 미국)를 BamHI 제한효소로 자른 후 Sau3AI로 부분절단된 DNA와 16℃에서 16시간 라이게이션 반응시켰다. MAX 람다 패키징 추출 키트(Epicentre, USA)로 인 비트로 패키징을 수행하였으며 카나마이신(50 μg/ml)이 들어간 LB 고체 배지에 도말하여 재조합 된 콜로니만 이용하였다. 이어, 대장균(Escherichia coli) 형질감염시켜 메가지놈 라이브러리를 구축하였다.

라이브러리 스크리닝 및 숏건(shotgun) 서열 분석

활성 알지네이트 라이아제(alginate lyase)의 분해능을 평가하기 위해 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride, CPC) 분석을 수행하였다. 메타지놈 DNA를 포스미드 벡터(pCC1FOS ready vector, Epicentre, 미국)에 라이게이션하여 람다(lambda) 파아지에 패킹하고 Escherichia coli에 감염시켰다. 그 결과로 얻은 감염 세포를 0.1% 알지네이트가 포함된 LB(Luria-Bertani) 아가(agar)에서 하루 동안 배양하였다. 상기 세포에 10% CPC 용액을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 대기하여 형성된 클리어존을 관찰하였다(도 1). 양성 클론의 전체 서열을 알기 위해 정제한 포스미드 DNA 및 PHRED/PHRAP/CONSED 패키지로부터 준비한 숏건 DNA 라이브러리를 숏건 시퀀싱 리드로 조합하기 위해 사용하였다. DNA 서열은 제조업자의 공지에 따라 ABI 9700 써모싸이클러(Applied Biosystems) 및 ABI PRISM^TM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems, version 3.1)를 사용하여 결정하였다. 데이터베이스 검색 및 서열 비교를 위해 국제생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 블라스트 프로그램을 사용하였다. 완전한 포스미드 삽입서열insert을 Artemis 프로그램을 사용하여 주석을 달고 BLASTP 및 PSIBLAST 프로그램을 사용하여 단백질 코딩 부분의 기능을 확인하였다. 예상 단백질은 이종상동성 그룹(orthologous groups, COR)의 클러스터 범주에 따라 분류하였다.^12,22-23 CLUSTAL_X 프로그램을 사용하여 얻은 포스미드 클론 ORF(open reading frames)의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스로부터 얻은 동종 유전자와 얼라인하였다.₆

효소 활성의 결정

효소의 엔도글루카나제(endoclucanase) 활성은 대량의 환원당을 처리하여 카보네이트의 글라이코시딕 본드의 효소적 가수분해로 증가된 색의 세기를 측정하는 Nelson-Somogyi 분석으로 결정하였다.³ 표준곡선은 분광광도계(메카시스, 한국)를 사용하여 525㎚ 흡광도 측정을 기준으로 31.5 ㎍/㎖-100 ㎍/㎖ 농도 범위의 글루코즈를 준비하였다. 0.1 M 시트레이트-포스페이트(citrate-phosphate) 버퍼(pH 4.0-7.0), 10 mM 포스페이트 버퍼(pH 8.0) 및 50 mM 글라이신-수산화나트륨(glycine-NaOH) 버퍼(pH 9.0-10.0)을 사용하여 온도(15℃-50℃) 및 pH(4.0-10.0)에 서 2시간동안의 최적 효소 활성을 측정하였다. 최적 조건(pH 8.0 및 40℃)의 메탈 이온 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(nicotinamide adinine dinucleotide, NAD⁺) 존재시에 효소활성의 억제 및 증대를 결정하였다.

알지네이트 라이아제 ( alginate lyase ) 활성 측정

알지네이트 라이아제의 생산을 위해 16시간동안 40℃로 LB(Luria-Bertani) 배지에서 클론을 배양하였다. 배양 배지는 단백질 농축 키트(Rapid-Con^TM 단백질 농축 키트, 엘피스, 서울, 한국)를 사용하여 농축하였다. AlyDW를 Laemmli에 의해 설명된 방법에 따라 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)이 없는 샘플버퍼를 처리하고 10% 아크릴아마이드(acrylamide) 젤로 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)하여 분석하였다.³ SDS-PAGE 후에, 젤 안의 단백질을 25% 메탄올이 첨가된 재생버퍼(50 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0, 10 ㎎/㎖ 카세인(casein), 2 mM EDTA, 0.01% NaN₃)에서 3회, 30분 동안 재생하였다. 폴리아크릴아마이드 젤을 100 mM 포스페이트 버퍼 1(pH 8)로 세척한 후 1 ㎎/㎖ 소듐 알지네이트(sodium alginate), 10 ㎎/㎖ NaCl 및 100 mM 포스페이트 버퍼1(pH 8)로 구성된 1.5% 아가로즈 젤에 덮어씌웠다. 상기 젤을 37℃에서 20시간동안 인큐베이션 한 후에 10% CPC 용액에 1시간동안 담가 둔 후에 증류수에 담궈 세척하였다.

박층크로마토그래피를 이용한 반응산물의 분석

셀로올리고사카라이드(cellooligosaccharides) 표준 혼합물(셀로바이오즈(cellobiose), 셀로트라이오즈(cellotriose), 셀로테트라오즈(cellotetraose), 셀로펜타오즈(cellopentaose), 셀로헥사오즈(cellohexaose), 셀로헵타오즈(celloheptaose) 및 셀로옥타오즈(cellooctaose))은 시그마-알드리치로부터 구매하였다. 테스트 클론이 갖는 알지네이트 라이아제 활성을 결정하기 위해, 0.1% 알지네이트를 37℃의 100 mM 포스페이트 버퍼1(pH 8)에 든 AlyDW(2.19 ㎎/㎖) 50 ㎕와 반응하였다. 젤 여과크로마토그래피(gel filtration chromatography: GFC)에 의한 알지네이트 올리고머의 분획에 아사히팩(Asahipak) GS-310 컬럼(21.5 ㎜ ID×500 ㎜, Showa Denko Kogyo Co.Ltd., 도쿄, 일본)을 이용한 HPLC(시마주 시스템, LC-6AD 펌프, RID-10A 디텍터, SPD-M20A 디텍터: 시마주, 도쿄, 일본)를 수행하였다. 물을 5 ㎖/min으로 흘려 샘플을 분리하였다. 분해된 알지네이트 용액의 aliquot(2 ㎖)을 주입하여 분획을 수득하였다. 반응 산물을 1-프로판올(propanol), 나이트로메탄(nitromethane) 및 물 혼합물(5:3:2, v/v/v)에서 2시간동안 반응한 후에 실리카 겔 플레이트(silica gel plate, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, 독일)을 이용한 박막 크로마토그래피로부터 가수분해 산물을 분리하였다. 분리 이후에, 당(sugar)에 1 ㎖ 유황산(sulfuric acid) 및 10 ㎖ 저장(stock) 용액(1 g 다이페닐아민(diphenylamine), 1 ㎖ 아닐린(aniline), 100 ㎖ 아세톤(acetone))의 혼합물을 분무하여 가시화 하였다.²⁶

결과 및 토론 사항

메타지놈 프래그먼트의 스크리닝 및 ORF 분석

전복(abalon)의 장내 미생물 식물군(flora)으로부터 구성된 총 9만 클론 중 선별된 3,840 클론으로부터 알지네이트 라이아제 활성을 발현하는 하나의 박테리아 메타지놈 프래그먼트(AlyDW)를 선별하였다(도 1). 숏건(shot-gun) 시퀀싱 데이터의 분석은 양성 메타지놈 프래그먼트는 평균 G+C함량 43.3% 및 22개의 예상 ORF로 길이 31.7 kb의 유전자를 나타낸다(도 2 및 표 1). 표 2의 a는 TMHMM 조사를 기초로 작성되었으며, b는 COG 그룹에 해당되지 않음을 나타낸다.

ORF No.	Homologous to BLASTP	Organism/Phylum or Domain	위치	블라스트 e-값	TMHs^a의 수	COG No.	COG category
1	(NiFe) hydrogenase maturation protein hypF	Ferrimonas balearica / Gammaproteobacteria	1280..3652	0.00E+00	0	O	COG0068
2	Hydrogenase accessory protein HypB	Ferrimonas balearica / Gammaproteobacteria	5025..6128	5.00E- 105	0	OK	COG0378
3	Hydrogenase expression /formation protein HypD	Ferrimonas balearica / Gammaproteobacteria	6365..7492	2.00E- 137	0	O	COG0409
4	Hypothetical protein	Vibrio sp ./ Gammaproteobacteria	8687..9202	1.00E-47	1	-	NA^b
5	Hypothetical protein	Vibrio sp ./ Gammaproteobacteria	9206..9823	3.00E- 258	1	-	NA
6	Hypothetical protein	Vibrio coralliilyticu s/ Gammaproteobacteria	9823..11250	1.00E-73	1	-	NA
7	Transcriptional regulator	Vibrio parahaemolyticus / Gammaproteobacteria	11377..12189	2.00E-79	0	K	COG0583
8	Hypothetical protein	Photobacterium sp . / Gammaproteobacteria	12290..13306	2.00E-61	1	-	NA
9	Multidrug resistance efflux pump	Vibrio vulnificus / Gammaproteobacteria	13611..14642	2.00E- 166	2	Q	COG1566
10	Hypothetical protein	Vibrio vulnificus / Gammaproteobacteria	14646..15212	3.00E-55	3	-	NA
11	Alginate lyase (= Poly β-Dmannuronate lyase)	Klebsiella pneumoniae subsp . aerogenes / Gammaproteobacteria	15417..16388	6.00E- 117	0	-	NA
12	Lyase, putative	Vibrio splendidus / Gammaproteobacteria	17370..19223	0.00E+00	-	-	NA
13	Alginate lyase	Vibrio sp . / Gammaproteobacteria	19452..21017	0.00E+00	0	-	NA
14	Transcriptional regulator, LysR family	Vibrio splendidus / Gammaproteobacter	21253..22143	9.00E- 122	0	K	COG0583
15	Probable oxidoreductase	Vibrio sp . / Gammaproteobacteria	22309..23121	1.00E-95	0	QR	COG1028
16	Oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase, putative	Vibrio splendidus / Gammaproteobacter	23333..24208	6.00E- 138	0	C	COG1032
17	Flavodoxin reductase family 1 protein	Vibrio parahaemolyticus / Gammaproteobacteria	24294..24989	4.00E-72	0	R	COG3217
18	Dihydroorotase	Vibrio coralliilyticus / Gammaproteobacteria	25446..26477	2.00E- 171	0	F	COG0418
19	Glycerol kinase	Vibrio cholera / Gammaproteobacteria	26549..28063	0.00E+00	0	C	COG0554
20	Glucose-1-phosphate adenylyltransferase	Vibrio shilonii / Gammaproteobacteria	28362..29579	0.00E+00	0	0	COG0448
21	ABC transporter, periplasmic substratebinding protein	Vibrionales bacterium /Gammaproteobacteria	30103..30930	2.00E-88	0	P	COG0226
22	NodN-related protein	Vibrio orientalis / Gammaproteobacteria	31010..31696	6.00E-80	0	I	COG32030

상기 ORF 중 17 ORF는 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 알려진 기능의 유전자와 중요한 유사성을 보여주며, 5 ORF는 NCBI 박테리아의 게놈 데이터베이스에 가설 단백질에 상응한다. 6개의 ORF는 세포의 프로세싱 및 정보 저장과 관련이 있으며, 10 ORF는 대사작용과 관련이 있다. 3 ORF(11, 12 및 13)은 Klebsiella pneumonia 아종. aerogenes, Vibrio splendidus 및 Vibrio 종 Gammaproteobacteria 문의 알지네이트 라이아제 유전자의 단백질 서열과 유사성을 보여주었다.

AlyDW 의 특징

환원당 분석에서 알지노라이틱(alginolytic) 활성은 30-45℃ 조건에서 80% 이상의 활성을 보여주었으며, 40℃에서 최고치를 보여주었다. 저온(15-25℃)에서도 40℃에서 보인 활성의 60±5% 의 활성이 유지되어 저온 활성 효소의 특징을 보여주었다(도 3). pH 8에서 최대 알지노라이틱 활성을 보였으며, pH 4 내지 pH 9에서 약 90% 잔여 활성을 확인하였다. 그러나, 활성은 pH 9이상에서 급감하였다(도 3). 알지네이트 라이아제의 활성에 대한 금속이온 및 NAD⁺와 같은 보조인자의 영향을 표 2에 요약하였다. 표 2는 음성대조군의 값을 '1'로 하여 상대값으로 나타내었으며, 3번의 독립적인 실험으로 표준편차값을 도출하였다.

화학물질	폴드 활성
화학물질	단일	조합(양이온+NAD⁺)
None	1.00±0.05	-
NAD+ (0.1mM)	0.94±0.01	-
EDTA (1 mM)	0.80±0.01	-
CaCl2 (1 mM)	0.94±0.02	1.51±0.20
MgCl2 (1 mM)	0.93±0.01	1.29±0.10
KCl (1 mM)	0.90±0.01	1.40±0.36
MgSO4 (1 mM)	0.90±0.15	1.68±0.05
FeSO4 (1 mM)	0.86±0.03	1.11±0.04
CoCl2 (1 mM)	1.13±0.02	1.36±0.24
MnCl2 (1 mM)	0.81±0.01	1.11±0.14
CuCl2 (1 mM)	0.98±0.01	1.17±0.10
NaCl (1 mM)	0.94±0.02	1.16±0.05
AgNO3 (1 mM)	1.61±0.02	2.08±0.36

상기 결과는 NAD⁺, Mg² ⁺ 및 Ag⁺의 조합은 알지네이트 라이아제 활성에 금속 양이온 및 NAD⁺가 없는 대조군에 비하여 최소 1.6-2.0 배 촉진효과(stimulatory effect)를 미치는 것을 나타낸다. NAD⁺는 알지네이트 라이아제 활성의 증가를 야기하나 EDTA는 알지네이트 라이아제 활성을 약 20% 억제한다. 이는 효소활성에 필수적인 양이온의 킬레이션 때문일 것이다. 절대 효소 활성은 최적조건에서 0.15 μmoles/min/㎎ 단백질이다. Haliotis spp ., Littorin spp . 및 Turbo cornutus를 포함하는 해양 연체동물(mollusk)로부터 수득한 알지네이트 라이아제는 25-50℃ 및 pH 4.0-9.6에서 최적값을 갖는 엔도-폴리(M) 및 엑소-폴리(G) 라이아제이다. 효소 활성은 Ca² ⁺ 또는 Mg² ⁺같은 2가 양이온이 있을 때 효소활성이 증가하였다.^9,16,26-27 이는 GH4와 같은 글리코시드 가수 분해 효소군에서 α-1,4 또는 β-1,4-글루코시딕 연결의 가수분해를 위해 NAD⁺및 금속이온이 요구된다는 보고가 있다.²⁵

알지네이트 올리고머의 다른 프로필은 알지네이트 라이아제(AlyDW)의 알지네이트 분해로 확인하였다. AlyDW의 알지네이트 가수분해 최종산물을 3시간 후에 박막크로마토그래피(thin-layer chromatography)로 분석하였다(도 4). 도 4를 보면, AlyDW은 엔도라이틱(endolytic) 활성을 갖으며, 폴리(α-L-guluronate)보다 폴리(β-D-mannuronate)를 우선 분해하였다. 해양 연체동물로부터 분리한 알지네이트 라이아제는 엔도-폴리(M) 라이아제를 가장 선호한다.²⁷

고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)를 수행하여 20개의 분획 중 3개의 분획은 Flavobacterium sp . 유래의 상업적 효소와 다르게 180kDa-342kDa으로 분해된 알지네이트 산물 및 1,153-1,315 Da의 헥사머(hexamer)를 구성되어 이는 상업적 효소보다 작은 분자량의 산물을 만드는 것으로 AlyDW가 유용한 효소임을 말한다.

알지노라이틱 ORF -11의 특징

AlyDW는 3 ORF(ORF11, 12 및 13)은 이론적으로 35, 67 및 57 kDa의 분자질량을 갖는다. 아미콘(Amicon) 농축기로 메타지놈 박테리아 세포 부유액을 농축한 후에, 관련 없는 단백질 10% SDS-PAGE 시 멀티 밴드를 나타냈다. SDS-PAGE 후에, 젤 안의 단밸질은 재생조건에서 SDS-PAGE로 분석하고 활성염색였다.

ORF11(AlyDW)의 추측 아미노산 서열과 Sde_2478(Saccharophagus degradans 2-40) 및 alyA(Klebsiella pneumoniae subsp. aerogenes)유전자와의 상동관계는 각각 63% 및 65% 였다. 반면 algMsp(Microbulbifer sp. 6532A), VME_15370(Vibrio harveyi 1DA3), Celly_3050(Cellulophaga lytica DSM 7489), alg(Vibrio sp. A9m), VMC_35250(Vibrio alginolyticus 40B), alyPI(Pseudoalteromonas sp. CY2), V12B01_24259(Vibrio splendidus 12B01), MED152_06195(Polaribactor sp. MED152) 및 AlgL(Agarivorans sp. JAM-A1) 유전자와는 54%-60%였다(도 5-6). 폴리사카라이드 라이아제(polysaccharide lyase: PL) 패밀리 7 알지네이트 라이아제는 기질 바인딩 및 촉매 부위로 작용하는 것으로 여겨지는 (R/E)(S/T/N)EL, Q(I/V)H 및 YFKAG(V/I)YNQ의 3종류 고보존적인 아미노산 서열을 갖는다.²⁴ AlyDW 메타지놈 프래그먼트의 ORF11는 K. pneumonia의 G 및 M 특이 라이아제(AlyA), 해양 박테리아 ATCC 433367의 M-특이 라이아제(AlxM), 및 Corynebacterium sp.의 G-특이 라이아제(ALY-1)에서도 확인된 RSEL, QIH 및 YFKAGVYNQ를 갖는다. 상기 아미노산 서열은 알지네이트 라이아제의 안정한 3차원 구조 및 기능을 유지하는 필수적인 부분으로 판단된다.^13-14

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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agcttagtgg ttagtaccaa tagcatgatg 30660 aaaaccttga tcagctacaa cccgcaagcg atcggattta ttagcatggg gtctattgac 30720 gcttctgtta agccactcaa ctttgacggt gttgtgccaa attctgttaa cttactgaac 30780 aagagttacg aactagcgcg tccttttttg atcttccatc ataaagatct aaaagacgaa 30840 gcagcattgc agtttgccaa gtacgttacc tctaaagaag ccagcgctat tattgaaaat 30900 cagggctata ccgctcattt aaataaataa cgccaacagt attagtacat ataaaaatgg 30960 ccaaagctaa gctttggcca tttttgataa tctgttgtta cgctatcgat taaaagtata 31020 aacgaatcac cgattcagcc acacaagctg gacgacgtac gccttcaatc tccactttca 31080 gttcacgagt gatctcaaga cctttttgaa taggcgtcac tttcactaaa ctgctacgag 31140 cgcgaatgtt gctccctaca cgaacaggat aagggaagcg aacactgttc atccccatat 31200 taacggtcac tttagcggta ggaaacaagg gtttctcagg atcaacagca tctgacaaac 31260 gaggcagtag tgccaaagta agaaaaccat gcgcaatagt cgatttaaaa ggagactctt 31320 gctgtgcttt ttctggatcg gtatggatcc actgcatatc ttcagtcact cgaccaaacg 31380 catcgacacg ttcttgatca atgctaaacc agcttcccac gtgcaactct tcgccaattt 31440 tttgcgatag ctctaaatac agcgcttccg cctcaggctt catctcgatg atgtcttgag 31500 tgggattagc tacttcttca tttactgccg gcttttgaaa atcttttccc cacgcgcgaa 31560 aaatgtgctg tgcatgggca cggctcacta attcactcca atactctcta agagaagggg 31620 acatcttatc cataaactcc atatgatgtc tcgaaagaga tcctcgtttg tgtttaagaa 31680 tatcaacaac tttcatgcac gctccagtga agc 31713

Claims

서열목록 제1서열의 1280-3652 번째 뉴클레오타이드 서열, 5025-6128 번째 뉴클레오타이드 서열, 6365-7492 번째 뉴클레오타이드 서열, 8687-9202 번째 뉴클레오타이드 서열, 9206-9823 번째 뉴클레오타이드 서열, 9823-11250 번째 뉴클레오타이드 서열, 11377-12189 번째 뉴클레오타이드 서열, 12290-13306 번째 뉴클레오타이드 서열, 13611-14642 번째 뉴클레오타이드 서열, 14646-15212 번째 뉴클레오타이드 서열, 15417-16388 번째 뉴클레오타이드 서열, 17370-19223 번째 뉴클레오타이드 서열, 19452-21017 번째 뉴클레오타이드 서열, 21253-22143 번째 뉴클레오타이드 서열, 22309-23121 번째 뉴클레오타이드 서열, 23333-24208 번째 뉴클레오타이드 서열, 24294-24989 번째 뉴클레오타이드 서열, 25446-26477 번째 뉴클레오타이드 서열, 26549-28063 번째 뉴클레오타이드 서열, 28362-29579 번째 뉴클레오타이드 서열, 30103-30930 번째 뉴클레오타이드 서열 및 31010-31696 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 22개의 오픈리딩프레임을 포함하는 알지네이트 라이아제 활성을 갖는 메타지놈 라이브러리.
제 1 항에 있어서, 상기 메타지놈 라이브러리는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 메타지놈 라이브러리.
제 1 항에 있어서, 상기 메타지놈 라이브러리는 전복의 내장의 미생물군(microflora)로부터 얻은 지놈 DNA를 이용하여 구축된 것을 특징으로 하는 메타지놈 라이브러리.