CN102961443B - 北豆根抗肿瘤提取物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种北豆根抗肿瘤提取物、制备方法及用途。现在的北豆根有效成分提取工艺均采用生物碱的常规提取方法：即酸提碱沉结合碱化后有机溶剂萃取，此提取方法存在有机试剂残留。步骤：1）浸泡提取：是用75%～95%乙醇溶液浸泡数小时后超声提取；（2）浓缩、分散、离心：是将提取液减压浓缩至无醇味后再稀释、离心处理；（3）用大孔吸附树脂：是取离心处理后的上清液注入处理好的AB‑8大孔吸附树脂；（4）洗脱：是把吸附树脂用流速为1倍柱床体积/小时，依次用3～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5倍柱床体积的10%乙醇溶液洗脱和4倍柱床体积的70%乙醇溶液洗脱；（5）制得抗肿瘤提取物：是收集70%的乙醇洗脱液，浓缩收干得到干燥固体。本发明用于医药领域。

Description

北豆根抗肿瘤提取物、制备方法及用途

技术领域：

本发明涉及一种北豆根抗肿瘤提取物、制备方法及用途。

背景技术：

北豆根系防已科植物蝙蝠葛的干燥根茎，现在的北豆根有效成分提取工艺均采用生物碱的常规提取方法：即酸提碱沉结合碱化后有机溶剂萃取，此提取方法存在有机试剂残留，而且操作繁琐。

发明内容：

本发明的目的是采用一种北豆根抗肿瘤提取物的制备方法，此方法只用到了水和乙醇，使提取物无有机残留，可以与药物赋形剂制成适合于临床使用的中药有效部位的抗肿瘤药物。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

一种北豆根抗肿瘤提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）浸泡提取：取北豆根药材用8～10倍重量的75%～95%乙醇溶液浸泡24小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8大孔吸附树脂，上清液与树脂的重量比例为1：2；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1倍柱床体积/小时，依次用3～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5倍柱床体积的10%乙醇溶液洗脱和4倍柱床体积的70%乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70%的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。

一种北豆根抗肿瘤提取物在抗肿瘤领域药品制备中的应用。

一种北豆根抗肿瘤提取物，通过以下方法制得：

1）浸泡提取：取北豆根药材用8～10倍重量的75%～95%乙醇溶液浸泡24小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8大孔吸附树脂，上清液的与树脂的重量比例为1：2；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1倍柱床体积/小时，依次用3～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5倍柱床体积的10%乙醇溶液洗脱和4倍柱床体积的70%乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70%的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。

一种北豆根抗肿瘤提取物在抗肿瘤领域药品制备中的应用，抑制人乳腺癌细胞MCF-7的活性实验是：细胞培养、细胞毒测定、药效学试验及试验方法：

细胞培养：

人乳腺癌细胞MCF-7培养于 RPMI 1640 培养基，补加10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素以及 100 mg/ml 链霉素，将细胞置于37 ºC，5% CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养，孵育2-3天后再用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期细胞进行后续的实验。

细胞毒测定：

10批北豆根药材按照上述的制备过程制备的抗肿瘤提取物，用培养液稀释至不同浓度后，用0.22 mm的微孔滤膜过滤，将所得的续滤液用于肿瘤细胞增殖抑制实验，在无菌的96孔板中，接种的细胞密度为每孔1 × 10⁵个/ml，用量为每孔100 ml，然后分别加入5mg/ml、1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.04 mg/ml四个梯度浓度的样品溶液，每孔加入100 ml，每个样品设3个复孔，另外设4个空白对照孔，空白对照孔中只加100 ml的完全培养基，不加细胞；设4个阴性对照孔，只加100 ml细胞悬液。将其进行48 h培养，采用MTT法进行测定，即培养后的细胞，加入10 ml MTT5 mg/ml磷酸盐缓冲液，37°C、5% CO₂培养箱中培养4小时，离心，取上清液150 ml 弃去，加入175ml DMSO，振摇10分钟后，用酶标仪在550 nm测定吸光值。根据公式计算得IC₅₀。对照孔：仅加细胞不加药物，空白孔：仅加溶剂不加细胞和药物，实验孔：加细胞再加药物。

药效学试验：

试验动物：昆明种小鼠，体重18g-22g,雌雄兼用。

药物与试剂：注射用生理盐水，5-氟尿嘧啶，北豆根提取物，瘤株:小鼠肝癌H₂₂。

试验方法：

（1）对小鼠瘤重及免疫器官指数的影响:小鼠随机分组，雌雄各半。分别为给药组，5-氟尿嘧啶组，生理盐水组。各组小鼠于右前腋皮下常规接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml(约1×10⁶-2×10⁶个细胞)，接种后各组给药，连续7d，末次给药后处死小鼠，称体重，称瘤块、胸腺及脾脏质量，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。

（2）对H₂₂小鼠生命延长率的影响:小鼠腹腔接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml，每天观察并记录小鼠死亡情况。

有益效果：

1.本发明提供了一种未报道过的具有抗肿瘤作用的北豆根提取物，通过对癌细胞抑制试验和药效学试验，证明了该提取物具有优良的抗癌活性，可与多种医用辅料如：赋形剂、稀释剂、香味剂、润滑剂等配合，制成多种剂型的药物，如冻干粉针、注射液、片剂、胶囊、颗粒剂以及口服液等，广泛应用于临床。

本发明采用的浸泡提取，浓缩、洗脱及干燥的方法只用到了乙醇溶液，且最后又蒸干排出，无有机物残留，保证了提取物的纯净性，对后续的抗肿瘤药物的制备提供了安全保障。

本发明采用的大孔吸附树脂的方法，对北豆根抗肿瘤组分进行分离富集，代替了传统的碱化，有机溶剂萃取，不仅保证了所得组分的抗肿瘤活性，且避免了乳化、有机物残留等缺点。

本发明采用的浸后再用超声波提取器对北豆根抗肿瘤组分进行提取的方法，不仅避免了加热回流对成分的破坏，还克服了单纯用浸取法提取效率低的缺点。

本发明提供的北豆根抗肿瘤提取物的制备方法操作简便，容易制取，有利于降低成本，进行抗肿瘤药物的大规模生产。

附图说明：

附图1是本发明的10批北豆根抗肿瘤活性组分的细胞毒性试验IC₅₀值。

附图2是本发明对小鼠药效学试验数据。

具体实施方式：

实施例1：

一种北豆根抗肿瘤提取物的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）浸泡提取：取北豆根药材用8～10倍重量的75%～95%乙醇溶液浸泡24小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8大孔吸附树脂，上清液与树脂的重量比例为1：2；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1倍柱床体积/小时，依次用3～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5倍柱床体积的10%乙醇溶液洗脱和4倍柱床体积的70%乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70%的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。

实施例2：

一种北豆根抗肿瘤提取物，其特征是：通过以下方法制得：

1）浸泡提取：取北豆根药材用8～10倍重量的75%～95%乙醇溶液浸泡24小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8大孔吸附树脂，上清液与树脂的重量比例为1：2；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1倍柱床体积/小时，依次用3～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5倍柱床体积的10%乙醇溶液洗脱和4倍柱床体积的70%乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70%的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。

实施例3：

一种北豆根抗肿瘤提取物在抗肿瘤领域药品制备中的应用。

抑制人乳腺癌细胞MCF-7的活性实验是：

细胞培养：

人乳腺癌细胞MCF-7培养于 RPMI 1640 培养基，补加10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素以及 100 mg/ml 链霉素，将细胞置于37 ºC，5% CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养，孵育2-3天后再用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期细胞进行后续的实验。

细胞毒测定：

10批北豆根药材按照上述的制备过程制备的抗肿瘤提取物，用培养液稀释至不同浓度后，用0.22 mm的微孔滤膜过滤，将所得的续滤液用于肿瘤细胞增殖抑制实验，在无菌的96孔板中，接种的细胞密度为每孔1 ×10⁵个/ml，用量为每孔100 ml，然后分别加入5mg/ml、1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.04 mg/ml四个梯度浓度的样品溶液，每孔加入100 ml，每个样品设3个复孔，另外设4个空白对照孔，空白对照孔中只加100 ml的完全培养基，不加细胞；设4个阴性对照孔，只加100 ml细胞悬液。将其进行48 h培养，采用MTT法进行测定，即培养后的细胞，加入10 ml MTT5 mg/ml磷酸盐缓冲液，37°C、5% CO₂培养箱中培养4小时，离心，取上清液150 ml 弃去，加入175ml DMSO，振摇10分钟后，用酶标仪在550 nm测定吸光值。根据公式计算，得IC₅₀。

抑制率(%)= (对照孔A值-空白孔A值)- (试验孔A值-空白孔A值)

对照孔A值-空白孔A值

×100%

对照孔：仅加细胞不加药物。

空白孔：仅加溶剂不加细胞和药物。_

实验孔：加细胞再加药物。

批北豆根抗肿瘤活性组分的细胞毒性试验结果见图1表IC₅₀值：

药效学试验：

试验动物：昆明种小鼠，体重18g-22g,雌雄兼用。

药物与试剂：注射用生理盐水，5-氟尿嘧啶，北豆根提取物，瘤株:小鼠肝癌H₂₂。

试验方法：

（1）对小鼠瘤重及免疫器官指数的影响:小鼠随机分组，雌雄各半。分别为给药组，5-氟尿嘧啶组，生理盐水组。各组小鼠于右前腋皮下常规接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml(约1×10⁶-2×10⁶个细胞)，接种后各组给药，连续7d，末次给药后处死小鼠，称体重，称瘤块、胸腺及脾脏质量，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。

（2）对H₂₂小鼠生命延长率的影响:小鼠腹腔接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml，每天观察并记录小鼠死亡情况见图2表：

本发明提供的抗肿瘤组分对H₂₂生长有明显的抑制作用，并可明显延长小鼠生存时间，具有良好的抗肿瘤作用。

Claims (2)

1.一种北豆根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

（1）浸泡提取：取北豆根药材用8 ～ 10 倍重量的75% ～ 95% 乙醇溶液浸泡24 小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1 稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8 大孔吸附树脂，上清液与树脂的重量比例为1 ：2 ；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1 倍柱床体积/ 小时，依次用3 ～ 5 倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5 倍柱床体积的10% 乙醇溶液洗脱和4 倍柱床体积的70% 乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70% 的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。

2.一种北豆根抗肿瘤提取物，其特征是：通过以下方法制得：

（1）浸泡提取：取北豆根药材用8 ～ 10 倍重量的75% ～ 95% 乙醇溶液浸泡24 小时后，用超声波提取器提取三次，将所述的三次提取液充分混合；

（2）浓缩、分散、离心：将混合后的提取液减压浓缩至无醇味后，再把浓缩液和水按体积比1:1 稀释，进行离心分离处理；

（3）用大孔吸附树脂：取离心处理后的上清液注入已处理好的AB-8 大孔吸附树脂，上清液与树脂的重量比例为1 ：2 ；

（4）洗脱：将吸附树脂进行洗脱，流速为1 倍柱床体积/ 小时，依次用3 ～ 5 倍柱床体积的蒸馏水洗脱、5 倍柱床体积的10% 乙醇溶液洗脱和4 倍柱床体积的70% 乙醇溶液洗脱；

（5）制得抗肿瘤提取物：收集70% 的乙醇洗脱液，进行浓缩收干，得到干燥的固体即为北豆根抗肿瘤提取物。