CN1775267A - 一种开口箭提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药领域,特别涉及一种中药提取物及其制备方法和应用,具体涉及开口箭提取物及其制备方法和应用。本发明开口箭提取物是从开口箭根茎、叶或全草提取得到,呈棕黄色粉末状,其化学鉴定的特征为:Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性;泡沫试验呈阳性反应,碱液管的泡沫高度较酸液管的泡沫高;Rosen-Heimer反应在60℃时即呈现***显色反应,为甾体皂甙类化合物。其制备方法为首先对开口箭的根茎、叶或全草经醇加热回流或水煎后得到粗提取液,然后分离纯化粗提取液得到。本发明开口箭提取物具有抗肿瘤作用、抗炎作用以及抑制血小板聚集、抗血栓作用。
Description
发明领域
本发明涉及中药领域,特别涉及一种中药提取物及其制备方法和应用,具体涉及开口箭提取物及其制备方法和应用。
背景技术
开口箭属(Tupistra)植物隶属于百合科(Liliaceae)铃兰族(Convallarieae)。开口箭属植物共有20多种,我国是世界开口箭属植物分布的中心,种类约占全球的70%。开口箭是中国特有成分很高的植物属,主要分布于我国四川、湖北、云南、浙江、广西、江西、福建等南方地区。
开口箭属植物为我国民间用药,多以根茎及全株入药。中医传统理论认为该属植物苦、辛,性寒,有毒,具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛等功效,主治白喉、咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤、胃痛、痈肿疮毒、毒蛇狂犬咬伤等。
目前已有研究报道的开口箭属植物有开口箭(Tupistra chinensis Baker)、弯蕊开口箭(Tupistra wattii Hook.f.)、齿瓣开口箭(Tupistra fimbriata Hand.-Mazz.)和黄花开口箭(Tupistra aurantiaca Wall.)等10多种。研究表明开口箭属植物所含化学成分多为甾体化合物,均含有甾体皂甙(《中国野生植物资源》,1999,19(5):59-62)。沈平等对弯蕊开口箭的乙醇提取物进行了分离、纯化,并用培养的肿瘤细胞K562和A2780a测定得到的化合物的细胞毒活性。结果发现弯蕊皂甙元B(wattigenin B)、弯蕊皂甙元C(Wattigenin C)、甾体皂甙元(kitigenin)和铃兰皂甙元B(convallagenin B),以及强心甙rhodexin A、wattoside F、wattoside E等有细胞毒活性(《时珍国医国药》2005,15(12):860-861)。台湾学者潘文彬(Pan WB)等对大陆产开口箭进行了类似的研究,发现甾体皂甙元Δ25(27)-pentrogenin、ranmogenin A等对培养的人胃癌细胞(NUGC)有细胞毒活性(J.Nat.Prod.,2003,66(2):161-168)。然而,这些开口箭属植物的化合物的抗肿瘤作用均为体外细胞毒活性测定的结果,体内是否有抗肿瘤作用目前尚无实验研究的结果予以证实。陈国才等曾以开口箭为主药,组成方剂QE-8407,进行了抗癌药理和临床试验,证实对W256等瘤株有抑制作用(《云南大学学报》(自然科学版),1989,1∶55)。但对于开口箭单独使用是否有抗肿瘤作用,以及什么化合物有抗肿瘤作用等问题未做进一步的研究。另外,还有研究表明开口箭有祛痰、抗炎和抑菌(《中国民间医药杂志》,2005,2:103-106),以及抗真菌等作用(《长江大学学报》(自然科学版),2005,2(2):77-82)。这些研究均以开口箭的甲醇粗提取物为对象,未确定开口箭活性成分的化合物性质。
发明内容
本发明目的在于提供一种开口箭提取物。
本发明另一目的是提供一种开口箭提取物的制备方法。
本发明另一目的是提供一种含有开口箭提取物的药物组合物。
本发明另一目的是提供开口箭提取物在制备治疗抗肿瘤、抗炎以及抑制血小板聚集药物中的应用。
本发明所述的开口箭提取物,是从百合科(Liliaceae)开口箭属(Tupistra)植物开口箭(Tupistra chinenese,Baker)提取得到的。
本发明所述的开口箭可以是其根茎、叶或全草。
本发明所述的开口箭提取物为甾体皂甙类化合物,呈棕黄色粉末状。其化学鉴定的特征为:Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性;泡沫试验呈阳性反应,碱液管的泡沫高度较酸液管的泡沫高;Rosen-Heimer反应在60℃时即呈现***显色反应。
本发明开口箭提取物制备方法,可采用常用的皂甙类化合物分离提取方法。
本发明开口箭提取物制备方法含有以下步骤:a制备粗提取物;b纯化。
本发明开口箭提取物制备方法步骤a可以使用常用的中药粗提取物制备方法。例如可以将开口箭用水煎煮,或用不同浓度的1-4碳醇溶液加热回流开口箭得到含皂甙的开口箭粗提取液。本发明所述的1-4碳醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇其中一种或两种以上,最好是甲醇和乙醇其中一种。
本发明开口箭提取物制备方法中,开口箭可以使用其根茎、叶或全草。
本发明开口箭提取物制备方法步骤b可以采用本领域技术人员常用的皂甙纯化方法。
本发明开口箭提取物制备方法,纯化方法可以采用萃取法:将开口箭粗提取液浓缩得到的浸膏溶解在水中,用4或5碳醇进行萃取;萃取液回收溶剂后干燥得到含总皂甙的开口箭提取物。本发明所述的4或5碳醇可以是正丁醇、异丁醇、正戊醇其中一种或两种以上,最好是正丁醇。
在上述萃取纯化方法中,开口箭粗提取物浸膏水溶液可以先用有机溶剂脱脂。所述的有机溶剂可以是氯仿、乙酸乙酯、***、石油醚其中一种或两种以上。
在上述萃取纯化方法中,得到提取物可用丙酮或***等进行沉淀,回收沉淀物,以此得到纯度更高的总皂甙。
本发明开口箭提取物制备方法,纯化方法还可以采用色谱法。本发明所述色谱法可以是大孔树脂层析法、硅胶层析法、氧化铝层析法其中一种。本发明所述色谱法最好是大孔树脂层析法
本发明所述的大孔树脂层析法具体步骤为:开口箭粗提取液上大孔树脂层析柱后,先用水洗脱至苯酚-硫酸法测定无多糖显色反应后,然后用乙醇进行洗脱,收集皂甙显色反应阳性的部位,浓缩干燥得到开口箭提取物。
本发明所述的大孔树脂是非极性或弱极性聚苯乙烯大孔树脂,例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300等。本发明所述的大孔树脂最好是HPD-100大孔树脂。
本发明所述的含有开口箭提取物的药物组合物,含有治疗有效量的开口箭提取物和常用的辅剂或赋型剂。可以根据本领域技术人员已知的方法得到开口箭提取物优选的使用用量和形式。本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的辅剂、赋型剂的使用形式和用量。
本发明所述的含有开口箭提取物的药物组合物,采用本领域常用的制备方法。例如将上述开口箭提取物和药物辅剂混合均匀即得。
本发明所述的含有开口箭提取物的药物组合物,其剂型可以是注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、混悬液、喷雾剂、外用搽剂、透皮吸收剂中的任何一种。本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的剂型。
本发明开口箭提取物具有抗肿瘤作用、抗炎作用、以及抑制血小板聚集、抗血栓作用。为了更好的理解本发明,下面用本发明的相关药理试验及结果来说明其用途。
一、抗肿瘤作用
1.开口箭总皂甙体外肿瘤的活性
实施例1制备的开口箭总皂甙I用磷酸缓冲溶液(PBS)配制成2mg/mL溶液,过滤除菌后,再用无菌PBS稀释至20μg/mL、40μg/mL、80μg/μL、160μg/mL、320μg/mL。
K562:人白血病细胞;HepG2:人肝癌细胞;LoVo:人大肠癌细胞;C6:大鼠神经胶质瘤细胞;MCF7:人乳腺癌细胞;均用添加10%新生牛血清的DMEM培养,按2.0×103个/孔接种于96孔板,体积90μL。培养48小时后,每孔加入不同浓度的提取物10μL,即终浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL。空白对照为PBS,对照组与药物组均设6个平行孔。继续培养48小时,加入体积比为1∶10的CCK-8试剂,孵育2.5小时,酶标仪上测定450nm吸光度(OD值),参比波长为630nm。按下式计算抑制率:抑制率(%)=[1-(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)]×100%,并根据抑制率计算开口箭总皂甙对各种肿瘤的半数抑制浓度(IC50),结果见表1。
表1.开口箭总皂甙I对肿瘤细胞增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) | 抑制率(%) | ||||
K562 | LoVo | HepG2 | C6 | MCF7 | |
2481632 | 27.447.961.271.982.2 | 28.650.963.071.784.9 | 41.451.866.581.692.3 | 20.138.156.361.479.0 | 44.857.973.687.993.2 |
IC50(μg/mL) | 5.22 | 4.72 | 3.37 | 7.68 | 2.65 |
实施例2制备的开口箭总皂甙II和实施例3制备的总皂甙Ⅲ及分离部位B、C、D(部位A因难溶解,且含量少,未进行此项试验)用磷酸缓冲溶液配制成2mg/mL溶液,过滤除菌后,再用无菌PBS稀释至20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。同上方法测定各样品抑制HepG2细胞增殖的活性。结果见表2。结果表明开口箭总皂甙及其各分离部位对HepG2肿瘤细胞增殖均有抑制作用,并以极性偏低的部位B的作用为强。
表2.开口箭总皂甙及分离部位对HepG2肿瘤细胞增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) | 总皂甙II | 总皂甙III | 部位B | 部位C | 部位D |
24816 | 21.242.962.788.9 | 17.438.652.379.8 | 52.978.896.598.2 | 8.526.741.766.9 | 2.310.123.442.1 |
IC50(μg/mL) | 4.87 | 6.27 | <2.0 | 9.55 | 19.24 |
2、开口箭总皂甙体内肿瘤的活性
实施例1制备的开口箭总皂甙I用生理盐水溶解,配制成0.1g/mL和0.2g/mL的溶液,过滤除菌,分装后-20℃保存,临用前解冻。
将已接种7天的S180肉瘤小鼠的腹水与生理盐水按1∶1的比例进行稀释,小鼠右腹股沟皮下注射0.2mL稀释液,按体重随机分组:生理盐水对照组11只,另两组的动物数均为10只。
给药方法与抑瘤率的计算:小鼠接种肿瘤后第2天开始给药,每天一次,连续8天。给药剂量分别为:环磷酰铵(CTX)组20mg/kg腹腔注射,开口箭总皂甙按0.2mL/10g体重灌胃给药,给药量分别为2.0g/kg和4.0g/kg。末次给药后的第2天处死小鼠,剥离瘤块称重。按“抑瘤率=(1-给药组瘤重/生理盐水对照组瘤重)×100%”公式计算抑瘤率。实验结果见表3。
表3.开口箭总皂甙对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
分组 | 动物数 | 瘤重(g) | 抑制率 |
生理盐水对照CTX(20mg/kg)开口箭(2.0g/kg)开口箭(4.0g/kg) | 11101010 | 2.14±0.610.81±0.41**1.19±0.53**1.02±0.58** | 62.1%44.4%52.3% |
注:与生理盐水对照组比较,**p<0.01。
二、抗炎作用
实施例3制备的开口箭总皂甙Ⅲ用生理盐水溶解,配制成0.1g/mL和0.2g/mL的溶液,过滤除菌,分装后-20℃保存,临用前解冻。
以二甲苯诱发小鼠耳廓肿胀的炎症模型检验开口箭总皂甙的抗炎作用:小鼠48只,雌雄各半,随机分成4组。阳性对照组腹腔注射阿司匹林150mg/kg,开口箭总皂甙Ⅲ以0.2ml/10g体重灌胃给药,阴性对照组给同体积生理盐水灌胃。每日1次,连续7天。末次给药后2小时,将各组小鼠右耳上、下两面分别涂抹二甲苯20μl,左耳不涂作为对照,1小时后处死小鼠,剪下双耳,用8mm直径的打孔器冲下耳片,天平称重。用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度,按以下公式计算肿胀抑制率:肿胀抑制率=(阴性对照组差值-给药组差值)/阴性对照组差值×100%。结果见表4。结果表明开口箭总皂甙可抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀,有显著的抗炎作用。
表4.开口箭总皂甙III对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
组别 | 动物数 | 肿胀度(mg) | 抑制率 |
生理盐水阿司匹林(150mg/kg)开口箭(2.0g/kg) | 121212 | 13.13±4.188.17±2.54**10.14±3.61 | 37.8%22.8% |
开口箭(4.0g/kg) | 12 | 9.10±3.04* | 30.7% |
注:与生理盐水对照组比较,*p<0.05,**p<0.01。
三、抗血小板聚集作用
实施例1制备的开口箭总皂甙I用生理盐水溶解,配制成5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL的溶液。
体外抗血小板凝聚作用:家兔耳缘静脉取血,3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝。900转/分钟离心8分钟,取上层富含血小板血浆备用。将已吸取过PRP的血浆继续离心,3000转/分钟离心20分钟,取贫血小板血浆。用比浊法测定血小板聚集率。取富含血小板血浆0.27mL加入测试杯中,加入30μL开口箭总皂甙I,对照组用10μL生理盐水代替,37℃孵育2分钟后,加入二磷酸腺(ADP)诱导血小板聚集。
结果表明,开口箭总皂甙具有明显的抗血小板聚集作用,并且呈量效关系。以血小板最大聚集率计算血小板聚集抑制率,按以下公式计算:抑制率=(对照组聚集率-给药组聚集率)/对照组聚集率×100%。结果见表5。开口箭总皂甙抑制血小板聚集的IC50为3.18mg/mL。
表5.开口箭总皂甙I抗血小板聚集作用
组别 | 次数(n) | 最大聚集率 | 抑制率 |
生理盐水开口箭(0.5mg/mL)开口箭(1.5mg/mL)开口箭(2.0mg/mL) | 5555 | 41.79±7.2636.45±7.3631.52±5.83*24.35±5.21** | 12.8%24.6%41.7% |
开口箭(4.0mg/mL) | 5 | 11.87±4.42** | 53.6% |
注:与生理盐水对照组比较,*p<0.05,**p<0.01。
本发明的主要优点有:
1.本发明提供的开口箭总皂甙具有确切的抗肿瘤、抗炎、以及抑制血小板聚集等作用,有较好的临床实用价值。
2.本发明的开口箭总皂甙的制备可采用萃取和树脂层析等方法,操作简便易行,反应条件温和,宜于推广应用。
3.本发明所述的开口箭原料药材在我国南方省份较为常见,药源较广,易于实现产业化。
具体实施方式
以下实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
开口箭根茎薄片(2~4mm)0.2公斤,加1.5升水,浸泡6小时后,加热煎煮2小时,倾出水煎液;然后加水1.5升,继续煎煮1.5小时,倾出水煎液,再加水1.5升,同样方法煎煮1.5小时;合并3次水煎液,过滤,备用。
HPD-100大孔树脂柱层析:HPD-100大孔树脂柱床体积为4.5cm(内径)×58cm(高),约920mL。上述开口箭水煎液上样,用蒸馏水洗脱,流速约1.8升/小时。约5升蒸馏水冲洗后,流出液用硫酸-苯酚法检测多糖反应呈浅黄色;接着用20%乙醇2.5升洗脱,再用3升70%乙醇洗脱。收集70%乙醇洗脱的部位,检测Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性,说明为皂甙类物质。70%乙醇洗脱的部位加热干燥,得到总皂甙I,称重约20.1克,得率为10.0%。
含开口箭提取物的药物组合物配方及其制备方法:
片剂:1000片量(200mg/片)
(1)配方:
上述开口箭提取物 200g
淀粉 40g
糊精 40g
硬脂酸 6.4g
(2)制备方法:
依据上述配方混匀→过筛→加适量乙醇制粒→60-80℃烘干→压片每片重约300mg。
实施例2
开口箭根茎薄片(2~4mm)0.2公斤,分别依次用1.5升的95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇,加热回流提取2小时,合并提取液,减压蒸馏回收乙醇,所得到的浸膏加400毫升蒸馏水溶解,置于分液漏斗内,加200毫升石油醚萃取3次,每次振荡5分钟,静置0.5小时;下层水溶液用200毫升水饱和正丁醇萃取4次,每次振荡5分钟,静置1小时。合并正丁醇萃取溶液,减压蒸馏回收正丁醇,残留物用50毫升甲醇溶解,加500毫升丙酮,静置过夜,小心倾出上层溶液,沉淀物经检测Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性,为皂甙类物质。沉淀物60℃真空干燥,得到总皂甙II,称重22.8克,得率为11.4%。
含开口箭提取物的药物组合物配方及其制备方法:冻干粉针(针剂)1000瓶量(100mg/支)
(1)配方:
上述开口箭提取物 100g
活性炭 25g
注射用水至 5000ml
(2)制备方法:
用注射用水将总皂甙溶解加入活性炭→混匀→加热至80℃×30min→布氏漏斗过滤→0.2μm滤膜过滤除菌→分装,每瓶5ml→半盖胶塞→冷冻干燥→压盖。
实施例3
开口箭根茎薄片(2~4mm)0.2公斤,加甲醇1.5升,加热回流提取2小时,反复提取4次,合并提取液,减压蒸馏回收甲醇,所得到的浸膏加400毫升蒸馏水溶解,置于分液漏斗内,加200毫升石油醚萃取3次,每次振荡5分钟,静置0.5小时;下层水溶液用200毫升水饱和正丁醇萃取4次,每次振荡5分钟,静置1小时。合并正丁醇萃取溶液,减压蒸馏回收正丁醇,残余物经检测Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性,为皂甙类物质,即得到总皂甙,称重25.4g。取12g总皂甙用甲醇溶解,与H型薄层层析硅胶搅拌均匀,风干备用。
取上述拌样的硅胶,置于H型薄层层析硅胶干柱(2.6×73cm)顶部,高度约5.3cm。用水饱和正丁醇层析洗脱,根据流出液的薄层层析结果,按流出的顺序(极性由弱到强)收集了A、B、C、D四个部位,经检测四个部位的Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性,均为皂甙类物质。减压蒸馏回收正丁醇,残留物称重,A为0.17g,B为0.87g、C为5.29g、D为2.60g。总重为8.93g。
含开口箭提取物的药物组合物配方及其制备方法:
胶囊:1000粒量(200mg/粒)
(1)制备方法:
上述开口箭提取物200g
(2)制法:
将原料分装成胶囊,每粒约300mg。
Claims (11)
1.一种开口箭提取物,是从百合科(Liliaceae)开口箭属(Tupistra)植物开口箭(Tupistra chinensis,Baker)根茎、叶或全草经提取得到的中药提取物,其特征在于中药提取物是甾体皂甙类化合物,所述的提取物通过以下步骤制备:首先对开口箭的根茎、叶或全草经醇加热回流或水煎后得到粗提取液;然后将开口箭粗提取液浓缩得到的浸膏溶解在水中,用4或5碳醇进行萃取,萃取液回收溶剂后得到开口箭提取物,或将开口箭粗提取液上大孔树脂层析柱后,先用水洗脱至苯酚-硫酸法测定无多糖显色反应,然后用乙醇进行洗脱,收集皂甙显色反应阳性的部位浓缩干燥后得到开口箭提取物。
2.依据权利要求1所述的开口箭提取物,其特征在于制备开口箭粗提取液所用的醇是乙醇或甲醇。
3.依据权利要求1所述的开口箭提取物,其特征在于萃取所用醇是正丁醇。
4.依据权利要求1所述的开口箭提取物,其特征在于大孔树脂是HPD-100大孔树脂。
5.依据权利要求1至4其中之一所述的开口箭提取物的制备方法含有以下步骤:用水煎煮开口箭,或用不同浓度的1-4碳醇溶液加热回流开口箭得到开口箭粗提取液;然后将开口箭粗提取液分离纯化。
6.依据权利要求5所述的开口箭提取物的制备方法,其特征在于开口箭粗提取液分离纯化是将开口箭粗提取液上HPD-100大孔树脂层析柱后,先用水洗脱至苯酚-硫酸法测定无多糖显色反应,然后用乙醇进行洗脱,收集皂甙显色反应阳性的部位浓缩干燥后得到开口箭提取物。
7.依据权利要求5所述的开口箭提取物的制备方法,其特征在于开口箭粗提取液分离纯化是将开口箭粗提取液浓缩得到的浸膏溶解在水中,用正丁醇萃取,萃取液回收溶剂后得到开口箭提取物。
8.一种药物组合物,含有治疗有效量的权利要求1至4其中之一所述的开口箭提取物和药学上可以接受的辅料。
9.依据权利要求1至4其中之一所述的开口箭提取物在制备治疗抗肿瘤、抗炎以及抑制血小板聚集药物中的应用。
10.依据权利要求1至4其中之一所述的开口箭提取物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
11.依据权利要求8所述的药物组合物在制备治疗抗肿瘤、抗炎以及抑制血小板聚集药物中的应用。
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