CN102912017B - 一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法，该方法包括步骤：1）引物合成；2）乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]DNA的提取；3）SRAP-PCR反应采用复性变温法；4）电泳检测；5）对能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的引物组合，用Gelpro32软件处理条带，标出条带的大小，并在其它采样的群体中验证。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用SRAP技术便很容易区别乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用分子生物学的技术（SRAP）鉴定杂交鱼种的方法，更具体的说，本发明涉及一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法。
背景技术
乌鳢(Channa argus)和斑鳢(Channa maculate)同属于鲈形目（Perciformes）鳢科（Channidae）鳢属。通过斑鳢和乌鳢杂交所获得的杂交鳢系的子一代，具有生长快、产量高、病害少、安全质量高等优势，人工养殖过程可采用人工饲料喂养，大大改善原乌鳢养殖中因采用冰鲜投喂而造成饲料浪费及水源污染等问题，在珠江三角洲地区已成为鳢科鱼类中最重要的养殖品种。其中，以斑鳢为母本和乌鳢为父本的杂交鳢，因为苗种孵化率高、成活率高等优势，在中国鳢科鱼类养殖中所占的比重越来越大。
相关序列扩增多态性（SRAP）是近年来发展起来的一种新型分子标记***，它独特的引物设计原则，上游引物可以特异性结合在基因的外显子或启动子区域，下游引物可特异地与基因的内含子配对，针对基因组的ORF进行扩增，由于个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性扩增产物。SRAP技术具有简便、高共显性、重复性高、成本低等特点。此技术在植物方面已经大量应用于植物遗传图谱构建、作物遗传多样性分析、基因定位及比较基因组学等方面。在水产动物方面，SRAP在日本沼虾、梭子蟹及草鱼等方面有所报道。
常规使用鉴定杂交鱼类的方面，主要从形态学方面进行鉴定。然而，形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，并且形态学鉴定在苗种期不能鉴定乌鳢、斑鳢与杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]。例如，乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]在形态学上，乌鳢易区别于其它两种鱼，而斑鳢与杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]在形态学上很容易混淆，两者的头部花纹都呈现“一八八”。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用SRAP技术便很容易区别乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法
发明内容
本发明的目的是提供一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法，以克服现有从形态学上鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]，存在主观性强且不能有效地鉴定三种鱼苗种的缺陷，本发明的鉴定方法更精确，快速。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：
一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法，该方法包括步骤：
1）引物合成步骤：根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物；
2）乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]DNA的提取步骤：剪取三种鱼的胸鳍，用苯酚法提取组织的DNA，把DNA浓度稀释到20ng/μl，放入–20℃以下保存；
3）SRAP-PCR反应步骤，其中SRAP-PCR反应采用复性变温法；具体是指：扩增程序:94℃预变性3min；94℃预变性45s，35℃退火45s，72℃延伸1min，共5个循环；94℃预变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
4）电泳检测步骤：用1.5%琼脂糖检测扩增产物，筛选能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的引物组合，并在其它采样的群体中验证；
5）用Gelpro32软件处理条带，并根据扩增出的特异性条带来鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。能够扩增出694，268两条带的样本为乌鳢，只扩增出500一条带的样本为斑鳢，而同时能够扩增出以上三条带的为杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中所用引物为5个Me与6个Em组合，共30对引物。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中引物的使用浓度为：20μM。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]中DNA的提取包括步骤：
1）取样本的少量胸鳍，用眼科剪剪碎，放入1.5ml离心管中；
2）加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl25μl，SDS50μl，EDTA100μl，无菌水320μl，蛋白酶K6-10μl；放入55℃水浴中裂解2-4小时，变澄清即可；
3）加入与裂解液体积相等的饱和苯酚，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
4）提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的饱和苯酚，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
5）提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的苯酚、氯仿及异戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及异戊醇的比例为25：24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
6）提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的氯仿与异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的比例24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
7）提取上清液，加入双倍体积的冰冻无水酒精，有絮状沉淀生成，如暂无絮状沉淀时，置-20℃中存放30min，7000rpm时，4℃离心8min；
8）缓缓倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰冻酒精洗一次，7000rpm时，4℃离心8min；
9）缓缓倒掉70%冰冻酒精，自然干燥1-2小时后，用100μl无菌水溶解，-20℃备用。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，Tris-HCl水溶液的摩尔浓度为1M，pH值为8.0。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，SDS的浓度为10%。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5M。
本发明与传统的形态学鉴定相比，提供一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的方法，以克服现有从形态学上鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]，存在主观性强且不能有效地鉴定三种鱼苗种的缺陷，本发明的鉴定方法更精确，客观。
附图说明
图1为本发明A、B两种引物组合快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的效果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步说明本发明。
实施例
1.引物合成：根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物序列编号为附表1；
附表1
2.乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]DNA的提取步骤：
1）取乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）的少量胸鳍，用眼科剪剪碎放入1.5ml离心管中；
2）加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl25μl，SDS50μl，EDTA100μl，无菌水320μl，蛋白酶K5μl，放入55℃水浴中裂解2-4小时，变澄清即可；
3）加入与裂解液等体积的饱和苯酚（500μl），摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
4）提取上清液，上清液不足500μl，用无菌水补充，加入等量饱和苯酚（500μl），摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
5）提取上清液，上清液不足500μl，用无菌水补充，加入等量（500μl）苯酚、氯仿及异戊醇的混合物，其中苯酚、氯仿及异戊醇的比例为25：24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
6）提取上清液，上清液不足500μl，用无菌水补充，加入等量（500μl）氯仿与异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的比例为24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
7）提取上清液，加入双倍体积的冰冻无水酒精，有絮状沉淀生成（如暂无絮状沉淀，置-20℃，30min），7000rpm时，4℃离心8min；
8）缓缓倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰冻酒精洗一次，7000rpm时，4℃离心8min；缓缓倒掉70%冰冻酒精，自然干燥1-2小时，用100μl无菌水溶解，-20℃备用。
3.SRAP-PCR反应采用复性变温法：扩增程序为94℃预变性3min；94℃预变性45s，35℃退火45s，72℃延伸1min，共5个循环；94℃预变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
4.电泳检测：用1.5%琼脂糖检测扩增产物，筛选能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]的引物组合，并在其它采样的群体中验证；
5.用Gelpro32软件处理条带，如图A中引物Me3-Em5的组合为例，1-5中扩增出明显的三条带，大小分别为594，500，268；6-10中扩增出明显的一条带，大小为500；11-15中扩增出明显的两条带为694，268；
6.根据扩增出的特异性条带来鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。能够扩增出694，268两条带的样本为乌鳢，只扩增出500一条带的样本为斑鳢，而同时能够扩增出以上三条带的为杂交鳢[斑鳢（♀）╳乌鳢（♂）]；
7.同样的方法，B图所示，杂交鳢条带大小为375，271；斑鳢带条大小为271；乌鳢条带大小为375；图示中发现，乌鳢除了具有375的条带，还有一条611大小的特异性条带；
8.用Me3-Em5，Me4-Em5的组合引物鉴定其他采样群体，发现得到同样的结论，这说明这两对引物具有通用性，能够很好的鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。
Claims (6)
1.一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法，其特征在于，包括步骤：
1)引物合成步骤：根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物；
所述合成引物为Me3-Em5或Me4-Em5；
所述Me3的序列为：5＇-TGAGTCCAAACCGGAAT-3＇；
所述Me4的序列为：5＇-TGAGTCCAAACCGGACC-3＇；
所述Em5的序列为：5＇-GACTGCGTACGAATTAAC-3＇。
2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]DNA的提取步骤：剪取三种鱼的胸鳍，用苯酚法提取组织的DNA，把DNA浓度稀释到20ng/μl，放入–20℃以下保存；
3)SRAP-PCR反应步骤，其中SRAP-PCR反应采用复性变温法；具体是指：扩增程序:94℃预变性3min；94℃预变性45s，35℃退火45s，72℃延伸1min，共5个循环；94℃预变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
4)电泳检测步骤：用1.5％琼脂糖检测扩增产物，筛选能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]的引物组合，并在其它采样的群体中验证；
5)用Gelpro32软件处理条带，并根据扩增出的特异性条带来鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。能够扩增出694，268两条带的样本为乌鳢，只扩增出500一条带的样本为斑鳢，而同时能够扩增出以上三条带的为杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中引物的使用浓度为：20μM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]中DNA的提取包括步骤：
1)取样本的少量胸鳍，用眼科剪剪碎，放入1.5ml离心管中；
2)加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl 25μl，SDS 50μl，EDTA 100μl，无菌水320μl，蛋白酶K 6-10μl；放入55℃水浴中裂解2-4小时，变澄清即可；
3)加入与裂解液体积相等的饱和苯酚，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
4)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的饱和苯酚，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
5)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的苯酚、氯仿及异戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及异戊醇的比例为25：24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
6)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的氯仿与异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的比例为24：1，摇匀10min，12000rpm时，4℃离心20min；
7)提取上清液，加入双倍体积的冰冻无水酒精，有絮状沉淀生成，如暂无絮状沉淀时，置-20℃中存放30min，7000rpm时，4℃离心8min；
8)缓缓倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70％冰冻酒精洗一次，7000rpm时，4℃离心8min；
9)缓缓倒掉70％冰冻酒精，自然干燥1-2小时后，用100μl无菌水溶解，-20℃备用。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，Tris-HCl水溶液的摩尔浓度为1M，pH值为8.0。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，SDS的浓度为10％。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5M。
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