CN101921850A - 高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法 - Google Patents

Abstract

高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法，涉及大口黑鲈的生产育种方法。利用大口黑鲈促生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计了一对引物，对待选择作亲本的大口黑鲈DNA样品进行PCR检测，扩增片段只有308bp一条带的是AA基因型个体，扩增片段有308bp和242bp两条带的是AB基因型个体。在生产中要去除AB基因型的亲本个体，保留AA基因型的亲本个体，以提高大口黑鲈的孵化率。本方法大约在5个小时内完成，为接下来的大口黑鲈苗种生产提供快速准确的检测结果，去除含有B缺失基因型的亲本个体，从根本上提高鱼的种质质量，提高大口黑鲈的孵化率。

Description

高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法

技术领域

本发明涉及大口黑鲈的生产育种方法。

背景技术

大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗名加州鲈，原产于美国密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易起捕等特点。20世纪70年代我国台湾省从原产地引进此鱼，并于1983 年引入广东省，现推广到全国各地养殖，已成为我国重要的淡水养殖品种之一。2000年，广东省大口黑鲈的养殖面积约为10万亩，产量6.67万吨，全国大口黑鲈的年产量在10万吨左右。2004年，仅广东大口黑鲈产量9.48万吨，产值约12.86 亿元。但是目前我国引进的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，加上引种20 多年来不注重亲本留种需遵守的操作规程，至使大口黑鲈种质的质量急剧下降，主要表现在饵料转化率低、个体生长缓慢、苗种孵化率低等。

其中，孵化率低是影响种苗生产的一个重要因素，每年在大口黑鲈繁殖季节，由于大口黑鲈鱼卵的孵化率不稳定，使得鱼苗的价格也不稳定，影响了大口黑鲈养殖者的信心，制约了大口黑鲈养殖业的发展。提高鱼卵孵化率的传统方法很多，如培育优良亲鱼，传统的亲鱼培育方法有专池培育，投喂高蛋白的饲料，适时换水等，促进亲鱼成熟，并挑选个体较大、身体健壮的鱼作繁殖用亲本，这种方法对亲本的培育虽然可以提高亲鱼的身体状况，但对亲鱼本身鱼种质量的选择目的性还不够强，仍具有很人为的因素和不多确定的因素；大口黑鲈卵为粘性卵，在产卵后要及时收卵，避免卵粒大量堆集而造成缺氧死亡，但在实际操作中发现有时还是不可避免的有一定比例的鱼卵死亡，不能孵化出小鱼；另外，还有保持合适的水温，如果温度太高易引起胚胎发育不良而形成畸形鱼，温度过低鱼卵也不能正常发育，同时要保持优良的水质，pH值要求在5.6-7.5之间，溶氧量大于5mg/L，但这些措施与传统亲鱼选择相同，只是解决了减小对卵的危害，但对亲鱼和鱼卵的质量仍没有进行有目的的选择和评估。

本实验室通过研究，在大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上发现一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点。将GHRH启动子具这66bp序列的基因型命名为A，将缺失突变的GHRH启动子基因型命名为B，纯合的缺失突变BB基因型个体会在出膜前就已死亡。在检测的随机群体实验中发现，AA纯合型的大口黑鲈占71.2%，AB杂合型占28.8%，未检测到BB型个体。根据孟德尔定律，生产中，如果我们选来做繁殖的两个亲本大口黑鲈基因型都为AB型时（理论上这个机率占14.4%），会产生1/4的AA型子代，1/2的AB型子代，1/4的BB型子代。这1/4的BB型个体在出膜前死亡，使孵化率最高不会超过75%，严重影响了种苗的生产。

本实验室根据大口黑鲈GHRH启动子序列设计引物，建立了快速、有效的鉴定亲本基因型的方法。利用本方法将生产中AB基因型大口黑鲈亲本去除，以提高大口黑鲈卵的孵化率，提高大口黑鲈的品种质量。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

发明内容

本发明是为了建立一种快速、准确、有效的分子标记检测亲本基因型的方法，以提高养殖生产中大口黑鲈的孵化率。

利用大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计了一对引物，对待选择作亲本的大口黑鲈DNA样品进行PCR检测，扩增片段只有308bp一条带的是AA基因型个体，扩增片段有308bp和242bp两条带的是AB基因型个体。在生产中要去除AB基因型的亲本个体，保留AA基因型的亲本个体，以提高大口黑鲈的孵化率。

具体检测方法：

（一）引物的设计

根据大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计并合成引物如下：

P1：5’- CGGGCTGGTCTGTTAAATACAAGGT -3’，

P2：5’- AACACAAGAGCACATTGCTTCCTC -3’。

AA基因型个体预期扩增1条DNA带，大小308bp；AB基因型个体预期扩增2条DNA带，大小308bp和242 bp。

（二）模板DNA的提取

（1）取待检测亲鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用。

（三）PCR反应体系

ddH₂O                                  20μL

10×PCR Buffer                     2.5μL

4×dNTP（10mmol/L）        0.5μL

Taq酶（5U/μL）                 0.2μL

P1 （10μmol/L）                0.4μL

P2 （10μmol/L）                0.4μL

模板DNA                             1.0μL

（四）PCR反应条件

94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟。

（五）、琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶（含荧光染料）中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。

本检测方法大约可以在5个小时内操作完成，能为接下来要进行的大口黑鲈苗种生产提供快速准确的检测结果，从而去除含有B缺失基因型的亲本个体，从要本上提高鱼的种质质量，提高大口黑鲈的孵化率。在检测时设阳性对照（以***B基因型扩增片段的质粒pMD-GB为PCR模板）和阴性对照（以***A基因型扩增片段的质粒pMD-GA为PCR模板），保证检测结果十分准确。用该方法检测一个样品所需的成本大约为0.6元，成本低，适合推广使用。

Claims (1)

1.高孵化率大口黑鲈亲本的分子标记筛选方法，其特征是：

（一）引物的设计

根据大口黑鲈促生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列上一个66bp长度的隐性致死缺失突变位点侧冀序列，设计并合成引物如下：

P1：5’- CGGGCTGGTCTGTTAAATACAAGGT -3’，

P2：5’- AACACAAGAGCACATTGCTTCCTC -3’；

AA基因型个体预期扩增1条DNA带，大小308bp；AB基因型个体预期扩增2条DNA带，大小308bp和242 bp；

（二）模板DNA的提取

（1）取待检测亲鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用；

（三）PCR反应体系

ddH₂O                                  20μL

10×PCR Buffer                     2.5μL

4×dNTP（10mmol/L）        0.5μL

Taq酶（5U/μL）                 0.2μL

P1 （10μmol/L）                0.4μL

P2 （10μmol/L）                0.4μL

模板DNA                             1.0μL

（四）PCR反应条件

94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7分钟；

（五）、琼脂糖凝胶电泳检测

PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶（含荧光染料）中电泳，电压5V/cM，电泳结束后在紫外灯下观察并照相。