CN107641656A - 一种乌鳢单核苷酸多态性标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乌鳢单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)标记及其用途，通过本发明设计的引物设计、PCR扩增和SSCP技术能够快速、低成本、精确检验乌鳢单核苷酸多态性。SNP在水产动物的遗传图谱构建、分子标记辅助育种、遗传多样性研究和生物进化等研究领域具有广泛的应用。本发明方法是一种在DNA水平上筛查和检测乌鳢的SNP的方法，获得多态性高的SNP有利于乌鳢遗传多样性研究、种质资源的保护、分子育种以及其他水产动物研究。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学和分子生态学领域，涉及单核苷酸多态性分子标记及其应用。具体涉及乌鳢单核苷酸多态性分子标记及应用。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指基因组DNA序列中某个特定位点的单个核苷酸发生变异而引起的序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、***及缺失等形式。理论上讲，SNP可能是3个或4个等位多态性，但实际上绝大多数是二等位多态性，另外的多等位形式的多态性非常少见，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C-T，在其互补链上则为G-A)，也可能是颠换(C-A，G-T，C-G，A-T)。其中转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP在基因组中的覆盖范围就比较广，既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。根据SNPs在基因组中的位置可分为编码区SNPs(coding region SNPs)、基因周边SNPs(perigenic SNPs)和基因间SNPs(intergenic SNPs)3类。大多数SNPs位于基因组的非编码区，对蛋白质无直接影响，这一类SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化地研究中有着很重要的作用。少数分布在基因编码区的SNPs称为cSNPs(coding SNPs，任何碱基的改变都有可能导致编码氨基酸改变，其序列的改变会影响改变蛋白质的生物学功能，因此cSNP在遗传学尤其是与疾病相关的研究中具有重要的意义。
近年来，人们筛选未知或己知SNP的技术和方法有很多，最常见的有探针技术(TaqMan)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、直接测序法等，各种方法各有所长，在不同的分析领域都得到了广泛的应用。其中TaqMan探针技术的敏感性受检测时Taq酶活性影响较大，设计探针时需注意FRET的传递效率和PCR扩增效率，探针设计成本较高；SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；PCR-RFLP是根据碱基的突变会产生或消除某些酶切位点，从而利用限制性内切酶的特异性，用一种或多种限制性内酶作用于同一DNA片段，如果酶切位点存在SNPs位点，酶切片段的大小和数目就会出现差异，然后进行电泳检测就可以判断是否有SNPs位点以及碱基替换的类型。缺点是该方法只适用于检测酶切位点处的SNPs，对于酶切位点以外的SNPs则无法检测。直接测序法是最为快速、直接，但测序成本较高。随着分子生物学技术的飞跃发展，近几年又出现了一系列高灵敏度、高通量的基因分型方法，可以满足大样本及多SNPs位点的基因分型要求。
SNPs分子标记在水产动物的构建遗传连锁图谱、关联分析、QTL定位、***发育分析、群体遗传结构、品种鉴定等方面研究具有广泛的应用前景。国外学者Stickney等采用寡核苷酸微阵列技术，构建了斑马鱼(Danio rerio)的第一张SNPs遗传连锁图谱。图谱包含了25个连锁群，其全长为3000cM，图谱上有1930个SNPs位点，平均间隔为6.98cM。HSIN等运用“ssalar0l”高密度SNP矩阵对60组核心家系622条大西洋鲜鱼Salmo sala:进行基因分型并构建高密度遗传连锁图谱，图谱包含超过96K的SNP位点和29组鲑鱼连锁群体，每组SNP位点与染色体长度(r＝0.95)呈显著正相关。国内学者Li等通过250K SNP阵列构建斑点叉尾鮰Letulurus Punetuu遗传图谱，包含了54 342个SNP位点，总长度2505.4cM，雌性与雄性重组率为1.7：1覆盖率为90％；张建勇设计800组SNP引物，筛选出200组构建中国对虾(Fenneropenueus chanensas)亲本遗传连锁图谱，包含16个连锁群、180个标记，总长度899.3cM覆盖率分别为51.94％和53.77％，依据图谱检验中国对虾体重、体长性状连锁显著性，发现了C2 904-168,C1 2871-235两个与体重相关的SNP位点。Urtzi等对取自26个地理位置共1 331个长鳍金枪鱼(Thunnus ululungu)进行SNP位点基因分型，发现过度捕捞影响着长鳍金枪鱼种群结构和遗传多样性。对地中海、大西洋、印度洋和太平洋的群体进行基因水平上同质群体界定，发现北大西洋长鳍金枪鱼有效种群大小没有出现历史性下降，其种群遗传多样性与进化潜力没有受到过度捕捞显著影响。江丽华利用SNP技术对舟山、漳浦、澄迈以及宁德四个地理种群的大黄鱼(Pseudoscauenu croceu)进行遗传背景分析，获得57组良好分型位点以及10个基因型，其中AT,GC为稀有突变型，可以在大黄鱼遗传多样性以及种群结构分析中利用。因此，研究SNPs对今后水产动物的遗传研究，基因定位以及分子辅助育种都有重要的科学意义。
关于SNP分子标记在人、小鼠、果蝇、斑马鱼等模式生物中已经有了很多的应用，尚未见到有关乌鳢SNP分子标记的研究报道。近年来由于环境污染、水利工程、人为捕捞等因素造成野生乌鳢种群数量下降，渔业资源逐渐枯竭，急需采取措施保护野生乌鳢种质资源。研究乌鳢遗传图谱、种群结构、遗传多样性，有利于种质资源的恢复、保护，推动渔业资源可持续的发展。
发明内容
本发明利用"Illumina Hiseq"测序法和PCR-SSCP方法筛选乌鳢SNPs的多态性，并将多态性高的SNPs在30个乌鳢个体中进行多态性验证，从而加快乌鳢遗传多样性、种质资源保护和利用的研究，将推动渔业资源可持续的发展。。本发明的目的在于，提供一种乌鳢SNP标记及其用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种乌鳢单核苷酸多态性标记，包括：
乌鳢OaSNP1第1457位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP2第569位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP3第156位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP4第2747位为C或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP5第403位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP6第759位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP7第352位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP8第316位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP9第743位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP10第810位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP11第1306位为G或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP12第453位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP13第228位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP14第3089位为G或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP15第216位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP16第812位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP17第498位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP18第1833位为G或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP19第795位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP20第281位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP21第390位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP22第176位为T或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP23第235位为G或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP24第866位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP25第385位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP26第2534位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP27第2247位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP28第891位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP29第675位为G或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP30第977位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP31第565位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP32第201位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP33第498位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP34第315位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP35第142位为G或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP36第915位为T或C的单核苷酸多态性。
本发明提供了一种用于检测上述所述的乌鳢单核苷酸多态性标记的引物对，包括引物对OaSNP1～OaSNP36，所述OaSNP1由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成，所述OaSNP2由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成，所述OaSNP3由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成，所述OaSNP4由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成，所述OaSN5由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成，所述OaSNP6由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成，所述OaSNP7由SEQ ID NO:13和SEQID NO:14组成，所述OaSNP8由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成，所述OaSNP9由SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18组成，所述OaSNP10由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成，所述OaSNP11由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组成，所述OaSNP12由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成，所述OaSNP13由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成，所述OaSNP14由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成，所述OaSNP15由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成，所述OaSNP16由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成，所述OaSNP17由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成，所述OaSNP18由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成，所述OaSNP19由SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38组成，所述OaSNP20由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40组成，所述OaSNP21由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成，所述OaSNP22由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44组成，所述OaSNP23由SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46组成，所述OaSNP24由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48组成，所述OaSNP25由SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50组成，所述OaSNP26由SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:52组成，所述OaSNP27由SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54组成，所述OaSNP28由SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56组成，所述OaSNP29由SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58组成，所述OaSNP30由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60组成，所述OaSNP31由SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62组成，所述OaSNP32由SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64组成，所述OaSNP33由SEQ ID NO:65和SEQ IDNO:66组成，所述OaSNP34由SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68组成，所述OaSNP35由SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70组成，所述OaSNP36由SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72组成。
本发明提供了一种用于检测上述所述的乌鳢单核苷酸多态性标记的方法，包使用上述所述的引物对。
本发明提供了一种乌鳢单核苷酸多态性的检测方法，所述方法是通过对待测乌鳢进行上述所述的单核苷酸多态性标记的检测，确定所述待测乌鳢的基因型。
优选地，所述方法具体包括以下步骤：
(1)以待测乌鳢全基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物对为引物，进行PCR扩增；
(2)对步骤(1)中具有阳性条带的标记进行PCR-SSCP，确定乌鳢的基因型。
优选地，所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为：
98℃预变性5min，98℃变性20s，58℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃延伸8min。
优选地，所述步骤(2)中PCR-SSCP程序：PCR产物进行95℃变性10分钟并立即冰浴处理，所述变性所用的变性剂配方包括去离子甲酰胺49m1,0.5M pH8.0的EDTA 1m1、溴酚蓝0.l g、二甲苯菁FF 0.1g。
优选地，所述步骤(2)中所用的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种乌鳢SNP标记及其用途，通过本发明设计的引物设计、PCR扩增和SSCP技术能够快速、低成本、精确检验乌鳢单核苷酸多态性。SNP在水产动物的遗传图谱构建、分子标记辅助育种、遗传多样性研究和生物进化等研究领域具有广泛的应用。本发明方法是一种在DNA水平上筛查和检测乌鳢的SNP的方法，获得多态性高的SNP有利于乌鳢遗传多样性研究、种质资源的保护、分子育种以及其他水产动物研究。
附图说明
图1为乌鳢总RNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为乌鳢Oa1、Oa2和Oa3的Agilent 2100检测图。
图3为乌鳢Oa4、Oa5和Oa6的Agilent 2100检测图。
图4为乌鳢OaSNP 5多态性检测图。
图5为乌鳢OaSNP 6多态性检测图。
具体实施方式
本发明通过乌鳢RNA的提取与转录组文库构建、转录组测序与组装、SNP分析后，得到乌鳢的SNP标记，基于得到的乌鳢SNP标记，以待测乌鳢全基因组DNA为模板，以引物对OaSNP1～OaSNP36为引物，进行PCR扩增。PCR产物首先通过3％琼脂糖电泳进行初步筛选，具有清晰条带的标记再通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步进行SSCP基因分型，确定OaSNP1～OaSNP36的碱基多态性。针对发现的单核苷酸多态性进行30个体的多态性检验，并提供其检测方法，使得SNP成为乌鳢遗传多样性、遗传图谱构建、分子标记辅助育种研究的一种快速、有效、方便检测的分子标记，为乌鳢遗传多样性研究、种质资源的保护和开发提供依据。
以乌鳢Oa1、Oa2、Oa3、Oa4、Oa5和Oa6肌肉为样品，使用试剂盒(Invitrogen)按说明书上的方法进行RNA的提取，简述如下。
按50-100mg组织/mL TRIzo1的比例加入相应的TRIzoI，电动匀浆，室温放置5min，使其充***解后，于4℃，12000rpm离心5min。
取上清，按200μL氯仿/mL TRIzoI比例加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min后，于4℃，12000rpm离心15min。
取上清，按500μL异丙醇/mL TRIzoI的比例加入异丙醇，轻轻混匀，室温放置5-10min后，于4℃，12000rpm离心10min。
弃上清，按1mL 75％乙醇/mL TRIzoI的比例加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，于4℃，8000g离心5min。
弃上清，尽量将残余的乙醇吸掉，室温晾干或真空干燥5-l0min。
使用Illumina的RNA纯化试剂盒(Illumina,San Diego,CA)对提取的RNA进行纯化，方法依照使用说明。
RNA检测前准备，将样品在冰上融化后，充分混匀并离心，取500ng样品进行检测。
检测参数，琼脂糖凝胶浓度：2％琼脂糖胶，电压：5V/cm，时间：15min
检测结果见图1。
利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值，如图2和图3。单次建库要求RNA总量1ug，浓度≥50ng/μL,OD260/280介于1.8～2.2之间，OD260/230≥2.0，RIN≥8.0,28S:18S≥1.0。
真核生物mRNA 3'末端具有ployA尾的结构，利用带有Oligo(dT)的磁珠与ployA进行A-T碱基配对，可以从总RNA中分离出mRNA，用于分析转录组信息。
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，富集得到的mRNA是完整的RNA序列，平均长度达几kb，因此需要对其进行随机打断。加入fragmentation buffer，可以将mRNA随机断裂成300bp左右的小片段。
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
Illumina Hiseq上机测序。文库富集，PCR扩增15个cycles；2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；Illumina Hiseq测序。
通过TBS380的定量化测定，具有双末端的c DNA片段在Illumina Hi Seq 4000(2×150bp的读长长度)平台上进行测序。使用Seq Prep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)软件进行序列除杂。用Trinity软件对去杂后片段进行序列组装和拼接(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)。
将拼接好的序列作为对比模板通过软件Samtools(http:// samtools.sourceforge.net/)和VarScan v.2.2.7(http://varscan.sourceforge.net/)将Oa1、Oa2、Oa3、Oa4、Oa5和Oa6获得的序列信息分别与模板进行对比得到候选SNP的信息。根据分析结果，primer5.0软件设计引物，随机选择Oa1、Oa2、Oa3、Oa4、Oa5和Oa6样本中的60个SNP标记设计引物，进行验证。引物合成由上海生工公司完成。采用琼脂糖凝胶电泳进行SNP引物扩增成功率鉴定，发现57对(95％)引物能成功扩增出产物。为了消除假阳性干扰，通过PCR-SSCP方法，共在30个个体中对成功扩增的57对引物进行多态性验证(共重复两次试验)，最终获得36个(63.1％)多态的SNP标记。所述的引物对OaSNP1～OaSNP36如下：
PCR扩增反应程序为：
98℃预变性5min，98℃变性20s，58℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃延伸8min。
PCR扩增的反应体系为50μL，包含1μL DNA模板，30μL 2×PCR Mix(CW2296，世纪康为)，上下游引物各2μL，15μL H2O。
琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
PCR-SSCP为PCR产物进行95℃变性10分钟并立即冰浴处理，SSCP变性剂配方包括去离子甲酰胺49m1,0.5M的EDTA(pH8.0)1m1、溴酚蓝0.l g、二甲苯菁FF 0.1g。
聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％，OaSNP 2和OaSNP 4的电泳图见图4和图5。Marker采用北京生科宇晟科技有限公司的pBR322/Msp I DNA Marker。
本发明公开了乌鳢单核苷酸多态性的筛查和检测方法，通过引物设计、PCR扩增和SSCP技术能够快速、低成本、精确检验其单核苷酸多态性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种乌鳢单核苷酸多态性标记，其特征在于，包括：
乌鳢OaSNP1第1457位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP2第569位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP3第156位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP4第2747位为C或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP5第403位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP6第759位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP7第352位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP8第316位为C或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP9第743位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP10第810位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP11第1306位为G或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP12第453位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP13第228位为T或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP14第3089位为G或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP15第216位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP16第812位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP17第498位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP18第1833位为G或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP19第795位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP20第281位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP21第390位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP22第176位为T或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP23第235位为G或A的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP24第866位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP25第385位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP26第2534位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP27第2247位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP28第891位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP29第675位为G或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP30第977位为A或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP31第565位为T或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP32第201位为A或C的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP33第498位为C或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP34第315位为A或G的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP35第142位为G或T的单核苷酸多态性，
乌鳢OaSNP36第915位为T或C的单核苷酸多态性。
2.一种用于检测权利要求1所述的乌鳢单核苷酸多态性标记的引物对，其特征在于，包括引物对OaSNP1～OaSNP36，所述OaSNP1由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成，所述OaSNP2由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成，所述OaSNP3由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成，所述OaSNP4由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成，所述OaSN5由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成，所述OaSNP6由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成，所述OaSNP7由SEQ ID NO:13和SEQID NO:14组成，所述OaSNP8由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成，所述OaSNP9由SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18组成，所述OaSNP10由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成，所述OaSNP11由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组成，所述OaSNP12由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成，所述OaSNP13由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成，所述OaSNP14由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成，所述OaSNP15由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成，所述OaSNP16由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成，所述OaSNP17由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成，所述OaSNP18由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成，所述OaSNP19由SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38组成，所述OaSNP20由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40组成，所述OaSNP21由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成，所述OaSNP22由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44组成，所述OaSNP23由SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46组成，所述OaSNP24由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48组成，所述OaSNP25由SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50组成，所述OaSNP26由SEQ ID NO:51和SEQ IDNO:52组成，所述OaSNP27由SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54组成，所述OaSNP28由SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56组成，所述OaSNP29由SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58组成，所述OaSNP30由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60组成，所述OaSNP31由SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62组成，所述OaSNP32由SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64组成，所述OaSNP33由SEQ ID NO:65和SEQ IDNO:66组成，所述OaSNP34由SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68组成，所述OaSNP35由SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70组成，所述OaSNP36由SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72组成。
3.一种用于检测权利要求1所述的乌鳢单核苷酸多态性标记的方法，其特征在于，包括使用权利要求2所述的引物对。
4.一种乌鳢单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述方法是通过对待测乌鳢进行权利要求1所述的单核苷酸多态性标记的检测，确定所述待测乌鳢的基因型。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)以待测乌鳢全基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物对为引物，进行PCR扩增；
(2)对步骤(1)中具有阳性条带的标记进行PCR-SSCP，确定乌鳢的基因型。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为：
98℃预变性5min，98℃变性20s，58℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃延伸8min。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR-SSCP程序：PCR产物进行95℃变性10分钟并立即冰浴处理，所述变性所用的变性剂配方包括去离子甲酰胺49m1,0.5M pH8.0的EDTA 1m1、溴酚蓝0.l g、二甲苯菁FF 0.1g。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所用的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102912017A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-06 | 华东师范大学 | 一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法 |
| CN107217099A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-09-29 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种可用于乌鳢遗传性别和超雄鱼鉴定的snp标记及其应用 |
-
2017
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