CN103387980B - 一种三疣梭子蟹微卫星位点及引物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹微卫星位点及多态性引物，即提供5个三疣梭子蟹的微卫星位点，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-5中的任一个。本发明还提供从上述微卫星位点设计的引物，用于三疣梭子蟹种群遗传多样性检测。本发明从三疣梭子蟹公共数据库中筛选出5个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物，扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于三疣梭子蟹的群遗传多样性检测、亲缘关系鉴定，遗传连锁图谱的构建以及分子标记辅助育种领域。

Description

一种三疣梭子蟹微卫星位点及引物

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹微卫星位点及引物。

背景技术

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）简称梭子蟹，俗称江蟹、白蟹，隶属于甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae）、梭子蟹属（Portunus），是一种大型海洋蟹类。广泛分布于我国北从辽东半岛、山东半岛，南到广东、广西的各海区以及日本、朝鲜、马来西亚群岛等水域。三疣梭子蟹由于其生长快、个体大、肉味鲜美，适合于沿海池塘海水养殖，因此作为海水养殖对象逐渐展开，已成为我国重要的渔业捕捞对象和海水养殖对象。但目前，三疣梭子蟹养殖业的蟹苗主要依赖于野生资源，几乎没有经过人工定向选育，良种化程度不高，这种状态限制了其发展。同时由于环境恶化和过度捕捞导致野生资源急剧下降，因此具有优良经济性状良种的选育就成为三疣梭子蟹产业目前急需解决的重大问题。

分子标记辅助选育（MAS）是遗传育种中的重要环节之一，它的原理是根据与某一性状紧密相连的分子标记的出现来对目标性状的基因型进行选择。MAS在鉴定优良亲本，筛选早期优良性状个体，加快育种进程中发挥了重要作用。微卫星标记由于具有多态性丰富、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR扩增、条带易于识别等多种优点成为开发的首选。

微卫星(Microsatellites)又称简单序列重复序列（Simple sequence repeats,SSR）,是真核生物基因组中广泛分布的简单重复DNA片段，一般由2-6个核苷酸为基本单位组成,基本单位重复次数的不同以及重复程度的不完全形成了微卫星位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同个体基因型微卫星的多态性。而且，微卫星在基因组中分布密度很大，表现出高度的多态性和共显性遗传，目前已被广泛用于遗传多样性分析，亲缘关系鉴定，连锁图谱构建，功能基因定位，分子标记选育等研究领域，并为种质资源的保护、合理的人工增养殖、人工放流方案的制定提供评价依据。因此，从三疣梭子蟹中分离多态性微卫星位点就成为上述工作的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹微卫星位点及多态性引物，即提供5个三疣梭子蟹的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，从而为三疣梭子蟹的遗传选育提供可用于遗传多样性检测、亲缘关系鉴定以及遗传连锁图谱构建的分子标记。

本发明首先提供一种三疣梭子蟹的微卫星位点，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1-5中的任一个；

本发明还提供从上述微卫星位点设计的引物，引物的信息如表1所示

表1：5个微卫星位点及对应引物信息

本发明的微卫星多态性引物用于三疣梭子蟹种群遗传多样性检测，包括有如下的步骤：

1）基因组DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒从三疣梭子蟹个体中提取基因组DNA作为扩增的模板；

2）微卫星PCR扩增：利用每对三疣梭子蟹微卫星引物扩增基因组DNA，

获得个体的微卫星扩增产物；

3）扩增产物电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增

产物；

4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小，利用GENEPOP4.0.10和CERVUS3.0计算遗传多样性参数。

本发明从三疣梭子蟹公共数据库中筛选出5个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物，扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于三疣梭子蟹的群遗传多样性检测、亲缘关系鉴定，遗传连锁图谱的构建以及分子标记辅助育种领域。

附图说明

图1：本发明的微卫星亲本对数与鉴定成功率关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述，对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

一、微卫星位点的筛选

首先从三疣梭子蟹的基因组文库中应用SSRHutter1.3(http://www.biosoft.net/dna/SSRHunter.htm)软件查找含有微卫星的序列，参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列。共筛选出20个含有微卫星重复的位点，并从中设计引物进行多态性的检测。

二、微卫星引物的设计

从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用PrimerPremier5.0进行引物设计。引物设计采用以下严谨度：（1）引物长度为17-25bp；(2)GC含量30%-70%；(3)退火温度为50℃-60；℃（4）预期PCR产物长度为100-330bp。

本发明的微卫星引物为能扩增得到多态性明显，杂带较少的的微卫星位点的引物。

三、三疣梭子蟹种群遗传多样性检测

1）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒（百泰克，北京，中国）提取30个个体的三疣梭子蟹基因组DNA；

2）微卫星PCR扩增：

反应体系为10ul，包括2×Power Taq PCR MasterMix5ul，1uM上下游引物各1ul，100ng基因组DNA1ul，DEPC处理水2ul。PCR反应程序为94℃变性3min，接下来变性1min，引物最适退火温度1min(各引物退火温度见表2)，72℃延伸1min，进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。

3）扩增产物电泳：采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，800V恒电压预电泳0.5-1小时，1200V恒定电压电泳3-4小时。电泳完成后进行银染显色处理，首先胶板通过10%的冰醋酸溶液30min，蒸馏水分两次洗涤每次各3min，0.2%硝酸银溶液30min，3%的碳酸钠显色30秒，终止反应即得到扩增产物片段，采用10-bp DNA ladder(Invitrogen Inc.)，分析每个个体的微卫星扩增产物分子量的大小；

4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小，利用GENEPOP4.0.10和CERVUS3.0计算遗传多样性参数；参数信息如表2。

表2：5个微卫星位点重复单位、参数的相关信息

其中，T_m代表微卫星退火温度，N代表等位基因数目，H_o代表观测杂合度，H_E代表期望杂合度。

本发明的引物对30个三疣梭子蟹基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从7到12个不等，平均等位基因数为9个。观测杂合度（Ho）的范围从0.667-0.952，期望杂合度（He）的范围从0.731-0.905。从而证明本发明筛选的5个微卫星位点具有遗传多样性。

5）鉴定效果分析：

利用CERVUS3.0软件根据30个三疣梭子蟹个体的5个微卫星位点不同等位基因频率，估计这5个微卫星位点在群体中进行家系鉴定的能力。分别选择不同亲本对数5，10，15，20,，25，30，模拟子代数目10000，亲本检测率100%，位点检测率100%，分型误差率1%，置信水平为95%，亲本性别未知，模拟5个微卫星位点的鉴定成功率（图1）。

由图可知本发明的5个微卫星位点在亲本数目小于5对，子代数目为10000时，累积鉴定成功率为100%，亲本对数为10对，子代数目为10000时，累积鉴定成功率为99%。由此可见，利用本发明的5个微卫星位点在亲本与子代间进行鉴定是可行的。

本发明的微卫星位点还可用于三疣梭子蟹的遗传多样性分析，家系的鉴定，遗传连锁图谱的构建以及分子标记辅助育种等研究领域。

Claims (2)

1.一种微卫星引物对，其特征在于，所述的引物对是从核苷酸序列为SEQ ID NO:1的微卫星位点上设计的，其引物序列分别SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。

2.权利要求1所述的微卫星引物对用于三疣梭子蟹种群遗传多样性的检测，包括如下步骤：

1）基因组DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒从三疣梭子蟹个体中提取基因组DNA作为扩增的模板；

2）微卫星PCR扩增：利用每对三疣梭子蟹微卫星引物扩增基因组DNA，

获得个体的微卫星扩增产物；

3）扩增产物电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增

产物；

4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小，利用

GENEPOP 4.0.10和CERVUS 3.0计算遗传多样性参数。