CN106755384A - 一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法 - Google Patents

一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法。本发明从70对许氏平鲉微卫星引物中，筛选出1对可在朝鲜平鲉和褐菖鲉中通用的微卫星引物，根据此引物在三个物种中扩增条带的差别进行物种鉴定。采用酚氯仿抽提法提取许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增得到扩增产物，对扩增产物进行凝胶电泳及染色，并与提供的标准图谱进行对比，从而可快速、高效地鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉个体。

Description

一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的 标准图谱及方法
技术领域
本发明属于水产生物技术中的海水鱼类分子标记和物种鉴定技术，具体涉及一种源于许氏平鲉的一对微卫星引物及其用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法。
背景技术
鲉科鱼类在全世界范围内包含有300多个种，从近海潮间带到一千米深的深海都有分布，拥有极其丰富的物种类型和栖息环境，是世界渔业、特别是我国渔业中十分重要的经济鱼类。平鲉属和菖鲉属均为卵胎生鱼类，许氏平鲉俗称黑鲪，是我国***鲉的相关研究还比较少，也是栖息在底层水域。三种鱼类的分布范围相近，主要分布于中国沿海以及朝鲜半岛、日本北海道以南水域。近年来，由于过度捕捞和环境变化等原因，许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉资源严重衰退。物种的区分和鉴定是各种研究工作的基础，然而许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉成体的外形比较相似，直接通过形态特征进行鉴定比较困难，特别是其发育早期阶段的鉴别更加困难。急需一种简单高效的方法对许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉个体进行大规模物种鉴定。
发明内容
本发明公开一种微卫星引物，其源于许氏平鲉，该引物（HJ5-132）的序列为：
F: CCCTCCTCTTCCATCTGT
R: ACCCTGAATGAGTTACCG。
本发明从70对许氏平鲉微卫星引物中筛选出一对能够在许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉中通用并且可以根据扩增条带大小区分三个物种的个体，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：HJ5-132。其核苷酸序列为：
GATCTTTCTCAGAGACAGTGTAAAACTCCCACACGGCTGACATTTACTTTCACTTTTATTTGTAAACAAACCACACGTGCACACGGCGCCCGCTGTCATGCCAGAGTCGTGTAGTCTCCAGCCAGTGGCTTCTTCTCTGAATCAGCAGCTGGTTACTGTTGTCAGATGTTCGGCCAATAAATCGGTGCATCTCTGTAACCTAAATCTAGTTCCAGATAGCATTAACAATTTCACCCCCCCTCCTCTTCCATCTGTAGAGCCCAGTATACAGTGTTGGTCCCTGCCCTGTGGAATACTGAGGTCCAAGACTGGGAGCTTAAATGTATGAACAGTCTGGTGTTGGACGAGAGCCACCATGGACCCAACGCAGGTATCTCTCACACACGCACACACGCACGCACGCACGGCACGCACGCACGCACACATACACACACACACACACACATTACACACACAAAGCAGTTGTTCTTAAGCAAAGGCTAATAATGCAAAGGGACACAGGGGACCACTCGGCACACACAGTCGCTCAAACTCCGGTAACTCATTCAGGGTACATCACTTAACCTCGGCACACATGC。
本发明还公开一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，通过如下步骤实现：
1）选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个，剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎，，用干净的滤纸吸除水分，分别放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止；
2）分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次；
3）分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的超纯水中；
4）紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，若完整性符合要求则；
5）以提取的三个物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，引物各 0.2 mM，dNTP0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL；所述的引物为前述引物（HJ5-132）的序列；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min；
6）PCR反应结束后，取0.2μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22 V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1%AgNO3溶液染色10min；染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液显色，直至条带清晰为止，分别得到许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉的图谱，将三种图谱合并形成如附图所示的标准图谱。
进一步地，所述的AgNO3溶液为比例为1g AgNO3 在1000mL dH2O 的溶液；所述的显色液为2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL的混合溶液。
本发明还公开一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的方法，包含如下步骤：
a）剪下少许待鉴鲉的鱼鳍，按照权利要求2步骤1）-4）的酚氯仿抽提法提取待鉴别鲉鱼个体的基因组DNA；
b）对提取的基因组DNA进行如权利要求2步骤5）的PCR扩增，得到扩增产物；
c）将扩增产物进行如权利要求2步骤6）的聚丙烯凝胶电泳及染色，得到对比图谱；
d）将对比图谱与权利要求2得到的标准图谱进行对比，若
在305bp～330bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为许氏平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；
若在286bp～295bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为朝鲜平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；
若在252bp～270bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为褐菖鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1为本发明用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱。
具体实施方式
实施方式1，本发明还公开一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，通过如下步骤实现：
1）选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个，剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎，，用干净的滤纸吸除水分，分别放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止；
2）分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次；
3）分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的超纯水中；
4）紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，若完整性符合要求则；
5）以提取的三个物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，引物各 0.2 mM，dNTP0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL；所述的引物为前述引物（HJ5-132）的序列；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min；
6）PCR反应结束后，取0.2μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22 V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1%AgNO3溶液染色10min；染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液显色，直至条带清晰为止，分别得到许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉的图谱，将三种图谱合并形成如附图所示的标准图谱。

Claims (4)

1.一种微卫星引物，其特征在于：其源于许氏平鲉，该引物（HJ5-132）的序列为：
F: CCCTCCTCTTCCATCTGT
R: ACCCTGAATGAGTTACCG。
2.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，其特征在于通过如下步骤实现：
1）选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个，剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎，，用干净的滤纸吸除水分，分别放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止；
2）分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次；
3）分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的超纯水中；
4）紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，若完整性符合要求则；
5）以提取的三个物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，引物各 0.2 mM，dNTP0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL；所述的引物为权利要求1所述的序列；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min；
6）PCR反应结束后，取0.2μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22 V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1%AgNO3溶液染色10min；染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液显色，直至条带清晰为止，分别得到许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉的图谱，将三种图谱合并形成如附图所示的标准图谱。
3.根据权利要求2所述的一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，其特征在于：所述的AgNO3溶液为比例为1g AgNO3 在1000mL dH2O 的溶液；所述的显色液为2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL的混合溶液。
4.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的方法，其特征在于包含如下步骤：
a）剪下少许待鉴鲉的鱼鳍，按照权利要求2步骤1）-4）的酚氯仿抽提法提取待鉴别鲉鱼个体的基因组DNA；
b）对提取的基因组DNA进行如权利要求2步骤5）的PCR扩增，得到扩增产物；
c）将扩增产物进行如权利要求2步骤6）的聚丙烯凝胶电泳及染色，得到对比图谱；
d）将对比图谱与权利要求2得到的标准图谱进行对比，若
在305bp～330bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为许氏平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；
若在286bp～295bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为朝鲜平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；
若在252bp～270bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为褐菖鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
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