CN102908615B

CN102908615B - 副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN102908615B
Application number: CN201110218831.2A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2031-08-01
Also published as: CN102908615A

Abstract

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，含抗原的比例相等的已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原与制备方法。本发明人分离获得三株副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型的菌株，这三种毒株制备的抗原的浓度含量及其相互比例进行了大量工作和实践，得到了一种抗原间配比及浓度适宜的三价疫苗，可以对我国目前流行的多种副猪嗜血杆菌血清型引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果，特别是可以解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病原而导致的现有疫苗治疗效果不佳的问题。

Description

副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌多价疫苗，特别是指一种副猪嗜血杆菌4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株的三价灭活疫苗及制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)，曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌所引起。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。

早在1910年，德国科学家Glsser就发现了副猪嗜血杆菌与猪的多发性浆膜炎和关节炎之间的联系。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。西方发达国家在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，另有20％以上的分离株血清型不可定；根据德国、美国、加拿大、日本和西班牙等国家的血清流行病学调查，以血清型4、5、13型最为流行；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行，其次是12型、13型。近年来，各副猪嗜血杆菌血清群之间交互免疫力不强，接种的疫苗菌株血清群与当时当地流行的副猪嗜血杆菌病的病原血清群不相符，给该病的预防和治疗带来了一定的难度。目前国内用于副猪嗜血杆菌病免疫预防的疫苗有勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)；西班牙海博莱生物大药厂生产的猪副猪嗜血杆菌病1型和6型灭活疫苗和华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病4型和5型灭活疫苗；这些疫苗的应用起到了一定的预防作用，而该病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，尤其是还没有副猪嗜血杆菌病12型，由于没有合适的毒株制备，加上各个抗原之间存在干扰，一针能够防治副猪嗜血杆菌新病原引起的副猪嗜血杆菌病为养殖业迫切需要解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种解决目前技术缺陷的副猪嗜血杆菌病，由三种抗原和兽医学可接受的佐剂组成，其中，所述的三种抗原为已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、已灭活的副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原。

本发明使用的抗原来自副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO：M 2011172；副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO：M 2011173；副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO：M 2011174。

优选地，本发明所述三种抗原的比例相等，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原含量各为2.0×10⁹CFU/mL。

优选地，本发明所述的兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、Montanide ISA15A VG及Montanide GEL PR聚合物佐剂的一种或几种组成。

优选的，本发明所述的兽医学可接受的佐剂为水性佐剂Montanide GEL PR。

更优地，本发明所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗中还含有疫苗总量0.01％V的硫柳汞。

本发明还提供了一种如上所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

a.分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株菌种繁殖培养，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液；

b.分别将步骤a培养得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液进行灭活，并浓缩菌液；

c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等体积比例混合，并加入疫苗总量0.01％V的硫柳汞，然后和兽药学上可接受的佐剂进行乳化，其中，副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为2.0×10⁹CFU/mL。

d.对步骤c得到的副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗进行分装。

优选地，本发明的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法中，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、Montanide ISA15A VG及Montanide GEL PR聚合物佐剂的一种或几种组成。

优选地，本发明所述的副猪嗜血杆菌病细菌为副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO：M 2011172；副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO：M 2011173；副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO：M 2011174。

本发明的另一目的在于提供如上述的副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗在预防和治疗副猪嗜血杆菌相关病的应用。

技术效果

发明人意外地分离获得三株副猪嗜血杆菌血清4型、5型和12型的菌株，通过试验发现这三株副猪嗜血杆菌：4型JS株菌、5型ZJ株菌、12型HeB株菌制备获得三联灭活疫苗可以对我国目前流行的多种副猪嗜血杆菌血清型引起的副猪嗜血杆菌病有较好的预防和治疗效果，特别是可以解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病原而导致的现有疫苗治疗效果不佳的问题。

其次，多价疫苗常常由于抗原的相互影响而导致免疫失败，特别是对于多血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病，由于血清型众多，选择抗原的种类和比例更加困难，而且对于大动物(猪)的免疫学实验往往时间漫长、费用昂贵，这也是一直以来市场上未出现有效的副猪嗜血杆菌多价疫苗的原因。而本发明在获得了三株新的副猪嗜血杆菌基础上，通过对这三种毒株制备的抗原的浓度含量及其相互比例进行了大量工作和实践，得到了一种抗原间配比及浓度适宜的三价疫苗，疫苗的免疫效果良好，可以有效治疗和预防副猪嗜血杆菌相关疾病，解决了长期以来的多血清型副猪嗜血杆菌相关疾病的多价疫苗制备困难的问题。

最后，本发明的三价灭活疫苗使用了氧化铝胶或水型佐剂，特别发现了水性佐剂制备获得三价灭活疫苗)安全性和免疫效果最佳，而且配苗工艺简单，疫苗易注射，安全可靠，克服了以往常用的油性佐剂的缺点。

菌株保藏说明

本发明所用的菌株为：

副猪嗜血杆菌病血清4型JS株：

分类命名：副猪嗜血杆菌病JS(Haemophilus parasuis JS)，

保藏号为：CCTCC NO：M 2011172；

副猪嗜血杆菌病血清5型ZJ株：

分类命名：副猪嗜血杆菌病ZJ(Haemophilus parasuis ZJ)，

保藏号为：CCTCC NO：M 2011173；

副猪嗜血杆菌病血清12型HeB株：

分类命名：副猪嗜血杆菌病HeB(Haemophilus parasuis HeB)，

保藏号为：CCTCC NO：M 2011174；

以上三个菌株的保藏日期均为2011年5月18日，保藏地址均为中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏单位均为：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。

附图说明

图1为副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗工艺流程图。

具体实施方式

本发明提供的新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，所述副猪嗜血杆菌病灭活疫苗包含抗原和佐剂；其中抗原包含已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株抗原；所述佐剂为兽医学可接受的佐剂；

作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述三种抗原的比例相等(即1∶1∶1)，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原含量均为2.0×10⁹CFU/mL。其中，本发明的抗原含量是指在灭活前的活菌数的含量。

作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和以卡波姆(Carbomer)为基础的Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐剂)、Montanide IMS 251C VG(包括同系列佐剂)、Montanide ISA15A VG(包括同系列佐剂)及Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)聚合物佐剂。

作为本发明副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的优选实施方案，所述疫苗中还含有疫苗总量0.01％v的硫柳汞。

新型副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备方法，包含如下步骤：

a.分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株菌种繁殖培养，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB 株菌液；

b.分别将步骤a培养得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液中按总量加入0.3％的甲醛溶液，放置37℃灭活，期间搅拌3～5次，根据计数结果浓缩菌液；

c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等比例混合，并加入疫苗总量0.01％的硫柳汞，然后和不同佐剂进行乳化，成品副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为2.0×10⁹CFU/mL；

d.以适量体积分装副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，盖上瓶盖，并压铝盖。

在上述新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备过程中，从步骤a培养好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取样，进行纯粹性检验和活菌计数；从步骤b已灭活好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取样进行灭活检验和安检；对步骤c得到的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，以确保疫苗的安全性、可靠性。

本发明的新型副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，克服了现有商品化疫苗只能预防1种或者2种副猪嗜血杆菌流行毒株引起的副猪嗜血杆菌感染的不足。本发明采用了不同的疫苗佐剂和适宜的配苗技术制备了副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，可以同时预防由副猪嗜血杆菌多种血清型引起的副猪嗜血杆菌病。可以满足不同养殖户和大型养殖场的需求，并达到了一针多防的效果。

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。如未特别声明，本发明的一般实验方法可使用本领域常用的试验方法进行，或参考《中华人民共和国兽药典(二○○五年版)》及附录的试验方法完成。

实施例1副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备与效力实验

副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，由已经灭活、浓缩并且安全检验合格的副猪嗜血杆菌病血清4型、5型、12型菌株制备获得，即用副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株制备抗原，分别与Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐剂)、Montanide IMS 251C VG(包括同系列佐剂)、Montanide ISA15A VG(包括同系列佐剂)、Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)、白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂混合配制疫苗，其中，所述三种抗原浓度比例相等。

1.菌种

a.副猪嗜血杆菌血清4型JS株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M 2011172。

b.副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M 2011173。

c.副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC M 2011174。

2.菌种的繁殖

a.一级种子的繁殖

上述冻干菌种，划线接种于TSA/NAD平板上，置37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12小时，作为一级种子。

b.二级种子的繁殖

取一级种子的培养物，按1％V的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12小时，经检验纯粹后作为二级种子。

3.菌液的培养

在副猪嗜血杆菌培养基(商售TSB)中，加入0.01％～0.05％(V/V) 的NAD、5％～10％(V/V)的血清、0.1％～5％(V/V)的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌种分别按1％(V/V)的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养18小时，得到三种菌液。

4.纯粹检验

从上述培养好的三种菌液中取样，用TSA/NAD培养基依《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验，结果为纯粹。

5.活菌计数

从上述培养好的三种菌液取样，用TSA/NAD平板培养进行活菌计数，以确定培养的菌数。

6.灭活

向上述三种培养好的菌液中，按总量的0.3％(V/V)加入甲醛溶液，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次。

7.灭活检验

灭活后，取上述三种已经灭活的菌液5mL接种于100mL含0.01％～0.05％(V/V)NAD、5％～10％(V/V)的血清、0.1％～5％(V/V)的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37℃培养18小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养18小时。取灭活的菌液0.1mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时。以上两种培养基培养后，均无菌生长。

8.安全检测

取上述三种已灭活的菌液静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，结果为三天内5/5健活，为灭活彻底。

9.疫苗的配制

a.油佐剂苗的配制

具体成分配比如下表：

主要材料组分	含量(％)
		兽用白油	93
司本-80	6
		硬脂酸铝	1

吐温-80	4
		水相∶油相(体积比)	1∶1.5

以白油为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体方法如下：

油相的制备：白油93份，加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌，再加入6份司本-80，充分混均，121℃，30分钟。水相制备：参照菌落计数结果，将各个菌液以超滤器浓缩为5.0×10¹⁰CFU/ml。将三种血清型灭活并检验合格的菌液等比例混合，加入终浓度为4％灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解。乳化∶水相与油相的比例为1∶1.5，即1份水相配1.5份油相在高速搅拌器中乳化2-5分钟，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01％V的硫柳汞，使得疫苗中三种抗原的含量均为2.0×10⁹CFU/ml。

b.铝胶佐剂苗的配制

具体成分配比如下：

主要材料组分	含量(％)
		抗原(1∶1∶1)	75～85
氢氧化铝胶	15～25

用氢氧化铝胶为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体方法如下：

将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，调整菌液浓度为副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型各1.0×10¹⁰CFU/ml，将三种抗原等比例混合。向副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型三种混合好的菌液中加入15～25％(V/V)灭菌的氢氧化铝胶摇匀；并加入疫苗总量的0.01％(V/V)的硫柳汞，使得疫苗中三种抗原的含量均为2.0×10⁹CFU/ml，充分搅拌，得到氢氧化铝胶佐剂的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。

c.水型佐剂疫苗的配制

具体成分配比如下：

用Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐剂)或者Montanide IMS251C VG(包括同系列佐剂)或者Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体过程如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，调整菌液浓度为副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型各2.0×10¹⁰CFU/ml，将三种抗原等比例混合。根据配苗标准加入10％～50％(V/V)的Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐剂)或者Montanide IMS 251C VG(包括同系列佐剂)或者Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)，低速搅拌乳化，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01％(V/V)的硫柳汞，使得疫苗中三种抗原的含量均为2.0×10⁹CFU/ml。

d.水包油型疫苗的配制：

具体成分配比如下：

主要材料组分	含量(V/V％)
		抗原(1∶1∶1)	80～90
Montanide ISA15A VG	10～20

以Montanide ISA15A VG为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，调整菌液浓度为副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型各为2.0×10¹⁰CFU/ml，将三种抗原等比例混合。根据配苗标准加入10～20％(V/V)的Montanide ISA15A VG(包括同系列佐剂)，低速搅拌乳化，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01％(V/V)的硫柳汞，使得疫苗中三种抗原的含量均为2.0×10⁹CFU/ml。

10.疫苗的无菌检验

取上述疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，结果无菌生长。

11.分装

以20mL/瓶、50mL/瓶、100mL/瓶分装，盖上瓶盖，并压铝盖。

12.用法与用量

颈部肌肉注射，使用前使疫苗平衡至室温并充分摇匀，不论猪只大小，每次注射2ml。推荐免疫程序为：后备母猪在产前8～9周首免，3周后二免，以后每胎产前4～5周免疫一次；仔猪在3～4周龄首免，3周后二免。

实施例2：副猪嗜血杆菌病疫苗最佳佐剂的筛选

(1)安全性：取实施例1制备的疫苗各肌肉注射健康易感猪5头，每头4mL，14天内无局部反应且全部健活。检验结果如下表1：

表1 疫苗试验结果

(2)效力试验：

在普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房进行试验。取实施例1制备的疫苗，每组疫苗各用28日龄的健康易感猪15头(普莱柯生物工程股份有限公司试验动物房饲养并提供)，各肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。对照猪15头，分三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。

副猪嗜血杆菌血清4型JS株：分别选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌苗免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量的血清4型JS株毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病。

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株：分别选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌苗免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个致死量的血清5型ZJ株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。

副猪嗜血杆菌血清12型HeB株：分别选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌苗免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。检验结果如表2所示。

表2 疫苗效力检验结果

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。

根据现有的动物用疫苗佐剂和新型疫苗佐剂通过以上安全性和效力试验的比较，结果水性佐剂Montanide GEL PR制备的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株+12型HeB株)安全性和免疫效果最佳，且配苗工艺简单，疫苗易注射，安全，可靠。

实施例3水性佐剂副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株+12型HeB株)的制备及对比试验

根据筛选结果，选择安全性、免疫效果最好的Montanide GEL PR佐剂制备三批实验室产品，经过安全性、效力检验合格后和市场上出售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗作对比试验，进一步检验安全性和免疫效果。

I首先按照“农业部兽用新生物制品管理办法”的要求，采用进口的Montanide GEL PR水佐剂按以下方法制备疫苗(流程图见附录)：

1、菌种

2.菌种的繁殖

a.一级种子的繁殖

上述冻干菌种，划线接种于TSA/NAD平板上，置37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，37 ℃培养12小时，作为一级种子。

b.二级种子的繁殖

取一级种子的培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12小时，经检验纯粹后作为二级种子。

3.菌液的培养

在副猪嗜血杆菌培养基(商售TSB)中，加入0.01％～0.05％NAD、5％～10％的血清、0.1％～5％的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌种分别按1％的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养18小时，得到三种菌液。

4.纯粹检验

5.活菌计数

从上述培养好的三种菌液取样，用TSA/NAD平板培养进行活菌计数，以确定培养的菌数为2.5×10⁹CFU/mL。

6.灭活

7.灭活检验

灭活后，取上述三种已经灭活的菌液5mL接种于100mL含0.01％～0.05％(V/V)NAD、5％～10％(V/V)的血清、0.1％～5％(V/V)的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37℃培养18小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养18小时。取灭活的菌液0.1mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时。两种方法培养后，均应无菌生长。

8.安检

取上述三种已灭活的菌液静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。

9.疫苗的配制

具体成分配比如下：

主要材料组分	含量(V/V％)
		抗原(1∶1∶1)	80
Montanide GEL PR	20

用Montanide GEL PR为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗。具体过程如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，弃去上清，并用生理盐水重悬沉淀物，参照菌落计数结果，调整菌液浓度为副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型各2.5×10⁹CFU/ml，将三种抗原等比例混合。根据配苗标准加入20％V/V的Montanide GEL PR，低速搅拌(800转/分钟)乳化，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01％V的硫柳汞。最终疫苗成品的抗原浓度为副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型为2.0×10⁹CFU/ml

10.物理性状检测、无菌检验：试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株+12型HeB株)3批(批号0801、0802、0803)。经物理性状检测、无菌检验合格，详细结果见表3；

表3 三价灭活疫苗物理性状检验及无菌检验

注：T.G表示硫乙醇酸盐培养基，G.A表示酪胨琼脂培养基，G.P葡萄糖蛋白胨培养基；“-”表示无菌生长。

11.安全检验：取上述方法制备的3批(批号0801、0802、0803)疫苗各肌肉注射健康易感猪5头，每头4mL，14天内无局部反应且全部健活，检验合格。

12.效力检验：在本公司试验动物房进行试验。取制备的3批(批号0801、0802、0803)疫苗，每批疫苗各用28日龄的健康易感猪15头，各肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。对照猪15头，分三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型菌株攻毒。

副猪嗜血杆菌血清12型HeB株：分别选取实施例1制备的副猪嗜血杆菌苗免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个致死量的血清12型HeB株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。检验结果合格如表4所示。

表4 三价灭活疫苗效力检验结果

Ⅱ疫苗对比试验

随机抽取上述检验合格的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株+12型HeB株)批号为0801的疫苗若干瓶和市场上出售的由武汉科前生物公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型+5型)批号为100409免疫猪作对比试验，试验结果见表5、6：

表5 安全性试验结果

表6 免疫攻毒试验结果

根据试验结果可以看出，用Montanide GEL PR(包括同系列佐剂)为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株+12型HeB株)比市场上销售的同类产品更安全并具有很好的保护效果，可以克服各种毒株之间的相互干扰，保护率能够达到80％以上，同时预防副猪嗜血杆菌4型、5型、12型引起的副猪嗜血杆菌病。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，由三种副猪嗜血杆菌抗原和兽医学可接受的佐剂组成，所述三种副猪嗜血杆菌抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和12型HeB株抗原，其中，所述的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO：M 2011172；副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC NO：M 2011173；副猪嗜血杆菌血清12型HeB株，保藏号为CCTCC NO：M 2011174。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述三种抗原的比例相等，副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型抗原的含量各为2.0×10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、MontanideISA15A VG、Montanide GEL PR佐剂的一种或几种组成。

4.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的兽医学可接受的佐剂为水性佐剂Montanide GEL PR。

5.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗中还含有疫苗总量0.01％V/V的硫柳汞。

6.一种权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

c.将上述已灭活、浓缩的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等体积比例混合，并加入疫苗总量0.01％(V/V)的硫柳汞，然后和兽药学上可接受的不同佐剂进行乳化，其中，副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型活菌数各为2.0×10⁹CFU/mL。

7.根据权利要求6所述的副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述兽医学可接受的佐剂为白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、Montanide ISA15A VG及Montanide GEL PR聚合物佐剂的一种或几种组成。

8.根据权利要求1-5任意一项所述的三联灭活疫苗在制备预防和治疗副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。