CN105797149A - 草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗及制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗，括以下组分：嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液。本发明还提供了所述的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的工厂化制备方法，将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例混合均匀，搅拌，无菌灌装，即得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗成品。本发明克服草鱼单一灭活疫苗只针对一种草鱼病原菌的缺点，提供一种二联疫苗以达到一次免疫可以同时抵御草鱼两种病原菌的效果，疫苗通过注射、浸泡方便施用。

Description

草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗及制备工艺

技术领域

本发明属于蛋白疫苗领域，尤其是涉及草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗及制备工艺。

背景技术

草鱼细菌性败血症病原菌为嗜水气单胞菌，是草鱼常发生危害严重的传染病。成鱼塘的败血症发病率在46%以上，鱼种塘的发病率在25%以上，其中尤以精养高产塘发病率最高，达60%以上，患病草鱼从出现症状到死亡约3-10d，经常造成巨大的经济损失。草鱼细菌性赤皮病全年都可发病，是草鱼鱼种和成鱼阶段的主要疾病之一，特别是对1龄草鱼危害最大，常与草鱼出血病、烂鳃病、肠炎病并发，发病率可达67%，死亡率高达16%以上。草鱼细菌性败血症、赤皮病一般采用消毒剂和内服化药进行预防和治疗，但是这些方法较易污染水体，并且易引起药物残留，采用免疫技术防治鱼病是养殖业可持续发展的关键技术点之一。蜂胶本身不具有抗原特性，但它具有免疫增强作用，能增加抗体的产生，提高抗体的特异性和非特异性免疫力。蜂胶可增强机体免疫反应、激活与保护免疫器官，是优良的免疫佐剂，对机体免疫***具有广泛的作用，既可增强体液免疫功能也可增强细胞免疫功能，具有促进和调节机体体液免疫和细胞免疫功能的作用。对于草鱼细菌性败血症、赤皮病人工免疫方法国内目前还少见报道，本发明采用自然发病的病例中分离处理强毒株，制成灭活疫苗，通过蜂胶佐剂的增强作用，以腹腔或背部肌肉注射的方法进行免疫接种，对草鱼进行免疫，结果表明可达到良好的防病效果。

发明内容

本发明的目的在于克服草鱼单一灭活疫苗只针对一种草鱼病原菌的缺点，提供一种二联疫苗以达到一次免疫可以同时抵御草鱼两种病原菌的效果，疫苗通过注射、浸泡方便施用。

本发明所述的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗包括以下组分：嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水和蜂胶乙醇浸泡液。

根据本发明所述的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的进一步特征，所述嗜水气单胞菌培养物灭活液占12%，其中细菌浓度不少于6亿cfu/ml；所述铜绿假单胞菌培养物灭活液占10%，其中细菌浓度不少于4亿cfu/ml；所述生理盐水占76.4%；蜂胶乙醇浸泡液占1.6%。

本发明还提供了所述的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的工厂化制备方法：将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例混合搅拌均匀，无菌灌装，即得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗成品。

根据本发明所述的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的工厂化制备方法，包括以下步骤：

a.一级种子制备：嗜水气单胞菌菌种或铜绿假单胞菌菌种接种营养琼脂平板，28℃培养24小时，挑取菌苔接种营养肉汤摇瓶培养基，28℃培养18小时，制备一级种子液。

b.二级种子制备：将一级种子液分别接种50L种子罐，培养基为嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，28℃，40-60L/min的通气量，搅拌培养10-14小时，制备二级种子液；

c.制苗菌液培养：将二级种子液接种500L发酵罐，培养基为嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，28℃，150-200L/min的通气量，搅拌同期培养10-14h，得到制备疫苗的菌液，活菌计数嗜水气单胞菌达到50亿cfu/ml以上，铜绿假单胞菌达到40亿cfu/ml以上为合格菌液；

d.灭活：嗜水气单胞菌发酵菌液加入0.30%甲醛，37℃，灭活24小时；铜绿假单胞菌发酵菌液加入0.38%甲醛，37℃，灭活72小时；进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液；

e.佐剂配制：将蜂胶研磨成粉状，浸泡在95%乙醇中，摇匀浸泡48h；

f.生理盐水配制：配制65%生理盐水输入配苗罐121℃，30min蒸汽灭菌，冷却，备用；

g.配苗:将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例输入配苗罐，罐内混合搅拌均匀；

h.分装：无菌条件下进行分装、轧盖，得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗成品。

本发明中草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗工厂化制备工艺成熟、成本不高。疫苗可通过注射、浸泡等方式施用，免疫草鱼效果良好，可有效预防草鱼细菌性败血症、赤皮病，减少预防性抗生素类鱼药的使用。

具体实施方式

以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

实施例1：草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的工厂化制备

1、一级种子制备

把保存在冰箱的菌种（嗜水气单胞菌菌株/铜绿假单胞菌菌株）取出，接种营养琼脂，28℃培养24小时，接种营养肉汤300ml/瓶，10瓶，摇床28℃，200rpm培养18小时，得到3L一级种子液。

本实施例选择的菌种为：嗜水气单胞菌菌株GA201，分离自草鱼；铜绿假单胞菌JP802分离自草鱼；目前菌种均保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所水产疫苗工程技术中心。

2、二级种子制备

按发酵培养基配方分别配制20L的嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，分别加入到50L种子罐，121℃，20min灭菌，培养基冷却后，将将3L一级种子接种种子罐，种子罐内温度为28℃，无菌通气量为40~60L/min，200rpm搅拌培养12h，得到二级液体种子。

3、制备疫苗的菌液培养

按发酵培养基配方分别配制180L的嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，分别加入到500L发酵罐，121℃，20min灭菌，培养基冷却后，培养获得的嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌二级液体种子分别接入发酵罐，发酵罐内温度为28℃，无菌通气量为150~200L/min，200rpm搅拌培养12h，培养结束后无菌采样，进行纯粹和活菌计数检测（参照《中华人民共和国兽药典》二0一0年版），活菌计数嗜水气单胞菌达到50亿cfu/ml以上，铜绿假单胞菌达到40亿cfu/ml以上为合格菌液。

4、灭活

将合格菌液通过管道输送到灭活罐，无菌操作加入甲醛，嗜水气单胞菌菌液加入甲醛最终浓度为0.30%，37℃，灭活24小时；铜绿假单胞菌发酵菌液加入0.38%甲醛，37℃，灭活72小时；灭活期间每隔4小时搅拌一次，灭活好的菌液冷却至1~5℃之间，进行无菌检验和甲醛残留检验（参照《中华人民共和国兽药典》二0一0年版）。

5、佐剂配制：将蜂胶研磨成粉状，浸泡在95%乙醇中，摇匀浸泡48h；

6、生理盐水配制：配制65%生理盐水输入配苗罐121℃，30min蒸汽灭菌，冷却，备用；

7、配苗:将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例输入配苗罐，罐内混合搅拌均匀；

8、分装：无菌条件下进行分装、轧盖，得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗成品，制备5个批次草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗。

经测定，所得的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗中，嗜水气单胞菌培养物灭活液占12%，其中细菌浓度不少于达到6亿cfu/ml；铜绿假单胞菌培养物灭活液占10%，其中细菌浓度不少于达到4亿cfu/ml。

注：本实施例中所用培养基配方

1、营养肉汤培养基配方（1L）：

蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、氯化钠5.0g/L，将上述组分溶于蒸馏水，定容至1L，pH7.2～7.4。

2、营养琼脂培养基配方（1L）：

蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、氯化钠5.0g/L，琼脂20.0g/L，将上述组分溶于蒸馏水，定容至1L，pH7.2～7.4。

3、蜂胶乙醇浸泡液配方（1L）：

蜂胶125g/L，溶于95%乙醇，定容至1L。

4、嗜水气单胞菌发酵培养基配方（1L）：

蛋白胨10.0g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖5.0g/L、氯化钠2.5g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、酵母膏0.5g/L，将上述组分溶于蒸馏水，定容至1L，，pH7.4～7.5。

5、铜绿假单胞菌发酵培养基配方（1L）：

蛋白胨10.0g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖5.0g/L、氯化钠2.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、酵母膏1.0g/L，将上述组分溶于蒸馏水，定容至1L，pH7.4～7.5。

实施例2草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的免疫效果

共生产5个批次草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗进行免疫实验。每个批次免疫实验将健康草鱼随机分成2组，每组100尾，第一组为注射免疫组，每尾腹腔注射实例一所制备的草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗0.1ml；第二组为对照组。水温为25-28℃。在免疫21d后，分别用注射1个发病剂量的嗜水气单胞菌强毒株菌液0.2ml（含活菌数约1.8×107cfu）/铜绿假单胞菌强毒株菌液0.2ml（含活菌数约1.2×108cfu）剂量的嗜水气单胞菌GA201/铜绿假单胞菌JP802（菌种保存在中国水产科学研究院珠江水产研究所水产疫苗工程技术中心），腹腔注射感染试验鱼，并饲养观察7天，记录各组试验鱼的发病和死亡情况。

实验结果表明

表1、草鱼细菌性败血症、赤皮病二联灭活疫苗免疫效果试验

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗包括以下抗原组合物：嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水和蜂胶乙醇浸泡液。

2.根据权利要求1所述的草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗，其特征在于：所述嗜水气单胞菌培养物灭活液占12%，；所述铜绿假单胞菌培养物灭活液占10%，其中细菌浓度不少于4亿cfu/ml；所述生理盐水占76.4%；蜂胶乙醇浸泡液占1.6%。

3.根据权利要求2所述的草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗，其特征在于：所述嗜水气单胞菌培养物中细菌浓度不少于6亿cfu/ml；所述铜绿假单胞菌培养物中细菌浓度不少于4亿cfu/ml。

4.制备权利要求1所述的草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的方法，其特征在于，将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例混合搅拌均匀，无菌灌装，即得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联蜂胶灭活疫苗成品。

5.根据权利要求4所述的草鱼细菌性败血症和草鱼细菌性赤皮病二联蜂胶灭活疫苗的方法，其特征在于，

包括以下步骤：

a.一级种子制备：嗜水气单胞菌菌种或铜绿假单胞菌菌种接种营养琼脂平板，28℃培养24小时，挑取菌苔接种营养肉汤摇瓶培养基，28℃培养18小时，制备一级种子液：

b.二级种子制备：将一级种子液分别接种50L种子罐，培养基为嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，28℃，40~60L/min的通气量，搅拌培养10-14小时，制备二级种子液；

c.制苗菌液培养：将二级种子液接种500L发酵罐，培养基为嗜水气单胞菌/铜绿假单胞菌发酵培养基，28℃，150-200L/min的通气量，搅拌培养10-14h，得到制备疫苗的菌液，活菌数嗜水气单胞菌达到50亿cfu/ml以上，铜绿假单胞菌达到40亿cfu/ml以上为合格菌液；

d.灭活：嗜水气单胞菌发酵菌液加入0.30%甲醛，37℃，灭活24小时；铜绿假单胞菌发酵菌液加入0.38%甲醛，37℃，灭活72小时；进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液；

e.佐剂配制：将蜂胶研磨成粉状，浸泡在95%乙醇中，摇匀浸泡48h；

f.生理盐水配制：配制65%生理盐水输入配苗罐121℃，30min蒸汽灭菌，冷却，备用；

g.配苗:将嗜水气单胞菌培养物灭活液、铜绿假单胞菌培养物灭活液、生理盐水、蜂胶乙醇浸泡液按12:10:76.4:1.6比例输入配苗罐，罐内混合搅拌均匀；

h分装：无菌条件下进行分装、轧盖，得到草鱼细菌性败血症、赤皮病二联乙醇灭活疫苗成品。