CN101766814A - 猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，可以预防由两种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。本发明还提供一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法。

Description

猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗。

背景技术

巴氏杆菌病是目前我国猪的主要的细菌传染病之一。

巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染引起的细菌性疾病，可引起败血症、肺炎。巴氏杆菌按荚膜分可分为A、B、D、E四种荚膜血清型。巴氏杆菌病世界各地都有发生，热带地区较为严重。目前已流行的巴氏杆菌病以A、B群为主，还有少量的D群。

巴氏杆菌可引起猪体的混合感染，其常常导致猪群出现高发病率和高死亡率，由于混合感染和滥用抗生素，导致一病多型、一病多症、一症多病的现象非常普遍，造成猪病日趋复杂，诊断难度越来越大，漏诊和误诊时有发生。抗生素药物的残留，使肉用动物在出口时面临不能通过的难题。所以，猪巴氏杆菌病的预防疫苗就显得更加重要了。

目前，市面上使用的控制巴氏杆菌病的疫苗只有分别预防巴氏杆菌荚膜A群、B群菌感染的活疫苗，并且只能够各自预防一种细菌感染。另外，现有巴氏杆菌疫苗是活的细菌疫苗，用活的细菌作为免疫原，存在一定的散毒情况。

因此，需要发明一种新的猪巴氏杆菌病疫苗以解决上述问题。

发明内容

本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种可以预防由巴氏杆菌荚膜A群和B群菌所引起的细菌感染、免疫安全的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗。

本发明的另一个目的在于提供一种操作简便的制备猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的方法。

本发明提供一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗包括抗原和佐剂：所述的抗原由已灭活的巴氏杆菌荚膜A群菌培养浓缩液和已灭活的巴氏杆菌荚膜B群菌培养浓缩液以等菌量混合而成，所述的抗原为75～85体积份数；所述的佐剂为氢氧化铝凝胶，所述的佐剂为15～25体积份数。

本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，由于采用荚膜血清A、B型的多杀性巴氏杆菌菌种制备二价灭活疫苗，可以预防由两种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-1。

上述两个菌株的免疫原性强，适合作为生产菌株。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的优选实施方式，所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗中还含有0.01％体积比的硫柳汞。硫柳汞是一种可以抑制霉菌的化学物质。防止疫苗生产和使用过程中受到霉菌污染。

本发明还提供一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)分别将巴氏杆菌荚膜A群菌和巴氏杆菌荚膜B群菌增殖，得到巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液；

(2)将步骤(1)增殖得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液灭活；

(3)向灭活后的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液分别加入氢氧化铝凝胶进行浓缩，在分别得到的浓缩液中，所述的氢氧化铝凝胶的体积份数为15～25，上述两种培养液的体积份数分别为75～85；

(4)将步骤(3)得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液浓缩液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液浓缩液按等量菌数进行混合，得到猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗。

本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，操作简便，制备得到的产品能够预防由两种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，灭活方式为在步骤(1)增殖得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液中，按总体积分别加入0.2％的甲醛溶液，放置于37℃灭活24小时，其间搅拌3～5次。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-1。

上述两个菌株的免疫原性强，适合作为生产菌株。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，该制备方法还包括步骤(5)向所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗加入0.01％体积比的硫柳汞。加入硫柳汞的作用在于抑制霉菌。

作为本发明猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，步骤(2)在灭活后还可以分别对巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液进行灭活检验和毒素检验。进行灭活检验和毒素检验的作用在于对制造过程疫苗质量的控制。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二○○五年版)》及附录。其他未特别注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。

实施例1

本品是选用致病性的巴氏杆菌荚膜A群、B群强毒菌株，接种于适宜培养基培养，将培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶浓缩制成二价灭活疫苗，用于预防由巴氏杆菌荚膜A群和B群菌感染所引起的细菌性疾病。制造及检验本品用的菌种为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株及荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-1株等强毒株，均为中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

1菌种

制造及检验本品用的菌种为巴氏杆菌荚膜A群、B群强毒菌株，为获得免疫原性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮后冻干保存。

2疫苗制造及半成品检验

2.1生产用种子的制备

2.1.1一级种子的繁殖

冻干菌种，用马丁肉汤稀释，划线接种于鲜血平皿上，置37℃培养18～24小时，选取生长良好的菌落，接种于含有羊鲜血琼脂斜面上，37℃培养18～24小时，作为一级种子。

2.1.2二级种子的繁殖

用少量缓冲肉汤洗一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于缓冲肉汤大管中，置37℃培养18～24小时取出，经检验纯粹后作为二级种子。

2.2制苗用培养基

采用商售的巴氏杆菌培养基。

2.3制苗用菌液的制备

2.3.1制苗用菌液的培养在培养基中加入血清2％，2株制苗用菌种液分别按5％的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃中培养；当菌液pH降低到6以下时停止培养。

2.3.2纯粹检验

培养结束后，分别从制苗菌液取样，根据《中华人民共和国兽药典(二○○五年版》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，菌液应纯粹。

2.3.3活菌计数

分别从制苗菌液取样，用肺疫琼脂平皿进行活菌计数，以确定培养菌数。

2.3.4灭活

在培养好的强毒菌液中，按总量加入0.2％的甲醛溶液，放置于37℃灭活24小时，其间搅拌3～5次。

2.3.5灭活检验

灭活后，取灭活菌液5ml接种于100ml含2％血清的培养基中37℃培养24小时，再移植于上述培养基100ml中37℃培养24小时；取灭活菌液0.5ml接种于血琼脂平皿，37℃培养24小时。上述两种方法培养均应无菌生长。

2.3.6毒素检验

取灭活菌液静脉注射18～22g的SPF小鼠5只，每只0.2ml，3天内应5/5健活。

2.3.7沉淀浓缩

经灭活及毒素检验合格后，按灭活菌液加入适量的氢氧化铝胶摇匀进行沉淀浓缩，混匀，置常温沉淀48～72小时。

2.3.8去毒素

向灭活好的菌液按比例加入15-25％的铝胶，混匀，将细菌的毒素最大限度地去掉。

细菌在培养增殖过程中，会产生大量的有害物质，如增殖过程的分泌在培养基中外毒素(以蛋白质为主)和在增殖过程中细菌凋亡破裂后释放出来的内毒素(以脂多糖为主)，以及一些有机酸和酶。这些物质均对动物机体有毒害作用(以过敏反应等为最常见)。氢氧化铝胶是一种弱的具有吸附作用的胶体，它能吸附细菌菌体，与之结合后，形成颗粒，并在重力作用下，沉降于液体下面，但不能吸附或极重量吸附细菌毒素等小物质。同时，氢氧化铝胶是一种免疫刺激剂，可以增强抗原的非特异性免疫应答。当抗原(细菌)在液体培养基中增殖及灭活完成，根椐活菌计数的结果，往抗原液中添加适量灭菌氢氧化铝胶，搅拌均匀后，静置。氢氧化铝胶和抗原(细菌)结合物则沉降于下部，细菌毒素等有害物质在残留在上清液中。将上清去除后，以无菌生理盐水将沉淀物重悬，配制成的疫苗成品，将大大提高产品的安全性。

3配苗与分装

3.1混合

根椐2.3.3的活菌计数结果，将2.3.8的剩余物按菌数等比例混合，各个菌株按每2毫升含适宜菌数配苗，按总量加入0.01％硫柳汞。

3.2半成品检验

取分装前苗样，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。

3.3分装

以100ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖。

在其他实施例中，还可以采用其他的制致病性的巴氏杆菌荚膜A群、B群强毒菌株，并不仅局限于实施例1中所采用的两个菌株。灭活的方式也可以采用β-丙内酯(BPL)、γ-射线照射和加热等其他灭活方法。作为防腐剂的硫柳汞可以采用其他含汞物质代替，例如二甲基汞，或者基于安全的原因，硫柳汞也可以不添加。

实施例2效力研究

用健康易感猪20头，各肌肉注射实施例1制得的疫苗2ml，含1个使用剂量；21天后，用各个强毒菌株进行强毒攻击。

巴氏杆菌P71株：

选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射P71株强毒菌液，观察10天，对照猪4/5以上死亡，免疫猪4/5以上保护。

巴氏杆菌C44-1株：

选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，各静脉注射C44-1株强毒菌液，观察10天，对照猪4/5以上死亡，免疫猪4/5以上保护。

结果：

	对照组	实验组
			P71株	4/5死亡	4/5保护
C44-1株	4/5死亡	5/5保护

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗包括抗原和佐剂：

所述的抗原由已灭活的巴氏杆菌荚膜A群菌培养浓缩液和已灭活的巴氏杆菌荚膜B群菌培养浓缩液以等菌量混合而成，所述的抗原为75～85体积份数；

所述的佐剂为氢氧化铝凝胶，所述的佐剂为15～25体积份数。

2.如权利要求1所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。

3.如权利要求1所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-1。

4.如权利要求1所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗中还含有0.01％体积比的硫柳汞。

5.一种猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)分别将巴氏杆菌荚膜A群菌和巴氏杆菌荚膜B群菌增殖，得到巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液；

(2)将步骤(1)增殖得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液灭活；

(3)向灭活后的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液分别加入氢氧化铝凝胶进行浓缩，在分别得到的浓缩液中，所述的氢氧化铝凝胶的体积份数为15～25，上述两种培养液的体积份数分别为75～85；

(4)将步骤(3)得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液浓缩液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液浓缩液按等量菌数进行混合，得到猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗。

6.如权利要求5所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活方式为在步骤(1)增殖得到的巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液中，按总体积分别加入0.2％的甲醛溶液，放置于37℃灭活24小时，其间搅拌3～5次。

7.如权利要求5所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。

8.如权利要求5所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-1。

9.如权利要求5所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，还包括步骤(5)向所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗加入0.01％体积比的硫柳汞。

10.如权利要求5所述的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)在灭活后分别对巴氏杆菌荚膜A群菌培养液和巴氏杆菌荚膜B群菌培养液进行灭活检验和毒素检验。