CN102845614A - 一种生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，特别涉及产乳酸枯草芽孢杆菌发酵工艺及配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化钠5-15份，果寡糖10-100份；发酵工艺为：将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行发酵，发酵条件为：30-37℃连续培养24-72小时后静置培养96-120小时，得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液；基于所述培养基的培养方法，可用于规模化生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液，其工艺稳定，益生菌含量高，生产成本低。

Description

一种生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及产乳酸枯草芽孢杆菌的培养方法。

背景技术

随着国民经济的快速发展和人民生活水平的日益提高，人们对养殖环境及安全、健康的动物产品提出了更高、更新的要求。而近些年来，频频曝光的动物食品安全事件，如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺奶事件”等等，无一不对动物养殖业造成了沉重地打击，引发了严重的信任危机。中国作为世界第一动物养殖大国，动物产品出口在国民经济中举足轻重，但近年来欧洲、日本等一些国家以食品安全问题为壁垒，拒绝中国动物产品的部分进入，给我国经济造成不应有的损失。这一系列的问题都是“动物产品安全”问题所致，已成为制约中国养殖业科学健康和可持续发展的瓶颈。

国际上目前普遍认为，微生态制剂在未来的动物养殖中将有巨大的应用前景，对解决动物产品安全性将起到较大的作用。

我国虽然在微生态制剂的研究和开发方面比欧美起步晚，但近20年来发展相当迅速。生产微生态制剂的厂家由2000年的十几家发展到2004年的1600家。据不完全统计，到2004年止，我国的各种微生态制剂的产量已达到15万吨。产业化程度高、规模较大的有四川何明清用芽孢杆菌研制的8501、8701、8801、8901、901系列，分别用于仔猪、育肥猪、鱼、禽、肉鸡。大连医学院研制剂的“促菌生”，南京农大研的“促康生”，松江制药厂生产的DM423菌粉，黑龙江兽医研究所生产的“痢康粉剂”，北京营养研究所生产的“增菌素”，杭州商学院生产的乳酸菌复合剂等等。市场上应用较多、效果较好的大多是以芽孢杆菌和乳酸杆菌为主的复合益生菌口服制剂。对产乳酸枯草芽孢杆菌进行发酵生产，综合枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的优点，可以使微生态制剂性能得到质的飞跃，达到更新换代的目的。大规模发酵生产乳酸枯草芽孢杆菌菌液是新型微生态制剂生产的基础和关键之一，但目前未有工厂化大规模发酵生产乳酸枯草芽孢杆菌菌液的发酵工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养基配方、培养基制备方法及其获得的培养基，该配方及培养基成本低，取材方便，适用于产乳酸枯草芽孢杆菌的培养；该培养基的制备方法简单，适用于大规模制备。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化钠5-15份，果寡糖10-100份。

进一步，产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化钠11份，果寡糖75份。果寡糖，又称为果聚糖、低聚果糖、藤果三糖族低聚糖，分子式为G-F-Fn(其中G为葡萄糖，F为果糖，n＝13)。

所述的培养基配方制备培养基的方法，取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化钠，加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为1-5g/L，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的果寡糖混合均匀，得培养基。

所述的方法制备的培养基。该培养基为产乳酸枯草芽孢杆菌的专用培养基，在特定的发酵条件下，可得到较好的发酵效果。

本发明的目的之二在于提供生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法，该方法操作简单，稳定性高，产率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法，具体包括以下步骤：将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行动态发酵，动态发酵条件为：30-37℃条件下连续培养24-72小时，通气量为0.1-0.5V/V·min，静置培养96-120小时，得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。

进一步，所述动态发酵条件为在2-20转/分钟条件下动态搅拌发酵。

作为优选，所述种子液和培养基的体积比为1-4∶10，所述发酵罐的装液量为10-20ml/100mL，所述种子液的浓度为3-15×10⁸cfu/mL，发酵罐的装液量优选为20mL/100mL。

其中，所述种子液为二级种子液。

其中，所述二级种子液的获得方法具体包括以下步骤：

A一级种子液的获得

将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤，37℃培养24小时；然后划线接种在营养琼脂平板上，在生化培养箱中，经37℃、24-48小时培养后选典型菌落接种营养琼脂斜面若干支，置37℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子；产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤时，接种量优选1ml/100mL；

B二级种子液的获得

取一级种子接种于营养肉汤，置37℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子，一级种子接种于营养肉汤接种量优选2ml/100mL；

营养肉汤的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水至1000mL，调节pH7.4；按上述成分混合，溶解后校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min，得营养肉汤。

本发明的有益效果在于：基于所述培养基的培养方法，可用于规模化生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液，其工艺稳定，益生菌含量高，生产成本低。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例中，产乳酸枯草芽孢杆菌CSY1-3-10-1株作为菌种。

实施例1培养基的制备

配方一：产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨1份，牛肉膏1份，酵母提取物1份，氯化钠15份，果寡糖100份。

配方二：产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨5份，牛肉膏3份，酵母提取物10份，氯化钠5份，果寡糖10份。

配方三：产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化钠11份，果寡糖75份。

将上述三种配方按以下步骤制备：取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化钠，加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为3g/L(1-5g/L均可)，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的果寡糖混合均匀，配方一、二和三依次得培养基一、培养基二和培养基三。

实施例2培养基的应用

一

所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法，具体包括以下步骤：将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种子液(浓度为3×10⁸cfu/mL)接种到装有所述培养基(配方三)的发酵罐中进行10转/分钟动态发酵，发酵条件为：30℃连续培养24小时后，再静置培养96小时，得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。经计数，产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数大于1.80×10¹⁰CFU/mL。

二

将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入所述培养基(配方二)，37±1℃培养24小时；然后划线接种在营养琼脂平板上，在生化培养箱中，在37±1℃条件下培养24-48小时，选典型菌落接种营养琼脂斜面，置37±1℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子。

三

取一级种子接种于所述培养基(配方一)，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子。

实施例3生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法

1二级种子液的获得方法

具体包括以下步骤：

A)一级种子液的获得

将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤(接种量1ml/100mL)，37±1℃培养24小时；然后划线接种在营养琼脂平板上，在生化培养箱中，经37℃、48小时培养后选典型菌落接种营养琼脂斜面若干支，置37℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子液(浓度为3×10⁸cfu/mL)；

B)二级种子液的获得

取一级种子接种于营养肉汤(接种量2ml/100mL)，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子液(浓度为15×10⁸cfu/mL)。

2产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法

具体包括以下步骤：将生产产乳酸枯草芽孢杆菌的所述二级种子接种到装有所述培养基(实施例1中的所述培养基三)的发酵罐中进行动态发酵，发酵条件为：37℃连续培养(2-20转/分钟动态搅拌发酵，通气量为0.1-0.5V/V·min)72小时后，再静置培养120小时，得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。所述种子液和培养基的体积比为4∶10，所述发酵罐的装液量为20ml/100mL。经计数，产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数大于2.20×10¹⁰CFU/mL。

实施例4

用实施例3的方法制备生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液，经喷雾干燥等(参数：干燥能力：0.1-2.0Kg水/小时；干燥时间：1.0-1.5秒；最大空气流量：35m³/h；压缩空气流量：1000-3000L/h；温度：90-220℃；加热控温精度：±2℃)最后制成产乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂。

实验室试制生产了5批共100千克实验室制微生态合生元饲料添加剂，批号分别为2011001、2011002、2011003、2011004、2011005。添加剂生产过程中，严格按半成品和成品检验规定进行检验，半成品生产和检验报告结果见表1，成品质量检验情况见表2(5批实验室试制产品成品的原始检验报告详见后)。

表1乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂半成品生产和检验结果

表2 2011001-2011005批乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂实验室成品检验结果

上述5批实验室制乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂(20110011、20110021、20110031、20110041、20110051)。在整个生产过程中安全、顺畅。半成品及成品各检验项目均达到《微生态饲料添加剂(企业)质量标准》的各项指标之上。充分证明了本添加剂生产工艺稳定，按照《微生态饲料添加剂生产规范》(草案)所制定的添加剂质量稳定、安全有效，可进行规模化生产。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方，其特征在于，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化钠5-15份，果寡糖10-100份。

2.根据权利要求1所述的培养基配方，其特征在于，按重量份计具体由以下组分组成：蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化钠11份，果寡糖75份。

3.权利要求1或2所述的培养基配方制备培养基的方法，其特征在于，取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化钠，加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为1-5g/L，并使各组分充分溶解，得混合液体；将所述混合液体灭菌，加入配方量的果寡糖混合均匀，得培养基。

4.权利要求3所述的方法制备的培养基。

5.基于权利要求4所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：将产乳酸枯草芽孢杆菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行动态发酵，发酵条件为：30-37℃条件下连续培养24-72小时，通气量为0.1-0.5V/V·min，再静置培养96-120小时，得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述动态发酵条件为在2-20转/分钟条件下动态搅拌发酵。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液和所述培养基的体积比为1-4∶10，所述发酵罐的装液量为10-20mL/100mL，所述种子液的浓度为3-15×10⁸cfu/mL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液为二级种子液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述二级种子液的获得方法具体包括以下步骤：

A一级种子液的获得

将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤，37±1℃培养24小时；然后划线接种在营养琼脂平板上，在生化培养箱中，在37±1℃条件下培养24-48小时，选典型菌落接种营养琼脂斜面，置37±1℃、生化培养箱中培养24小时，作为一级种子；

B二级种子液的获得

取一级种子接种于营养肉汤，置37±1℃生化培养箱中培养24小时，得二级种子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步骤A或/和所述步骤B中，营养肉汤替换为所述培养基。