CN105567624B - 一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其使用方法 - Google Patents

一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其使用方法，所述增效剂由以下成分按重量比组成：牛磺酸0.02‑1.5、硒0.003‑0.006、脯氨酸0.03‑0.8、赖氨酸0.05‑1.0、肌醇0.02‑0.052。将增效剂添加于M17培养基中，再接种产乳酸链球菌素的乳酸菌进行发酵。本发明增效剂各组分原料易得，采购成本低，使用方法简单。实验表明本发明增效剂能明显提高乳酸菌的乳酸链球菌素产量，增效明显，从而降低乳酸链球菌素的生产成本、缩短生产周期，提高生产效率。

Description

一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其 使用方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其使用方法。
背景技术
乳酸菌是一类能够从可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的***的统称。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上划分为43个属，如芽抱杆菌属、利斯特氏菌属、芽抱乳杆菌属、乳杆菌属、副乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、科里氏杆菌属、双歧杆菌属等菌属。多数乳酸菌在代谢过程中都会合成细菌素,统称为乳酸菌素，乳酸乳球菌广泛使用在乳品工业中。乳酸乳球菌可以产生的细菌素有:双球菌素、乳球菌素、乳链球菌素和乳酸链球菌素。其中最突出的是各种Lactococcus lactis subsP.Lactis产生的细菌素Nisin。
乳酸链球菌素最早用作食品防腐剂，目前，己有包括中国、美国、英国在内的50多个国家和地区批准Nisin作为一种天然食品防腐剂广泛应用于食品加工业之中。虽然目前对Nisin的研究范围很广，但是乳酸菌在培养基生长很容易达到衰亡期，产乳酸链球菌素也相应的减少。所以目前，延后乳酸菌的衰亡期的研究势在必行，所以目前很多研究都涉及到乳酸菌培养基的优化，来延迟乳酸菌的衰亡期，从而增强乳酸链球菌素的形成。例如发明专利CN200510071945.3一种培养基、其制备，其制备方法及培养乳酸链球菌素的方法。其制备方法为将酵母类蛋白、大豆蛋白投入配料罐中，加水搅匀，再投入菌种，依次补入碳源、磷酸钠、硫酸镁，对乳酸乳球菌的代谢有利，进入对数期时期缩短，代谢旺盛，糖氮消耗加快，衰退期延迟，乳酸链球菌素活性经生物效价测定极大提高。虽然提高了乳酸链球菌素，但是操作起来繁琐，不可控影响因素增多。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种可大幅提高产乳酸链球菌素能力、延缓乳酸乳球菌乳亚种的衰亡，乳酸链球菌素的生产量大的发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂。
本发明还提供一种方法简单、实用的增效剂的使用方法。
本发明增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.02-1.5、硒0.003-0.006、脯氨酸0.03-0.8、赖氨酸0.05-1.0、肌醇0.02-0.052。
进行一步，所述增效剂优选为牛磺酸0.08-1.2、硒0.004-0.005、脯氨酸0.2-0.5、赖氨酸0.07-0.09、肌醇0.03-0.04。
所述乳酸乳球菌乳亚种为可发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种，如可以抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长的M9乳酸乳球菌，特别对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显，已经广泛用于食品中、从大白菜中筛选的乳酸乳球菌乳酸亚种T0625，其对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性，而且其抑菌活性具有遗传稳定性、对海洋弧菌有强的抑制作用的乳酸链球菌L318，大大降低了养殖业的损失，特别优选保藏号为CGMCC NO 1.2829的乳酸乳球菌乳球亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，该菌具有耐酸、高产乳酸链球菌素、耐硒等特点，特别适用于本发明增效剂，能够大幅提高乳酸链球菌素的产量。
上述增效剂的使用方法，包括以下步骤：
(1)配制M17培养基；
(2)向所述M17培养基中加入所述增效剂，加入量为所述M17培养基质量0.12％-3.36％；
(3)将乳酸菌接种到步骤(2)得到的M17培养基中进行培养得到培养菌液，所述乳酸菌的接种量为1.0％-1.5％
所述步骤(3)中的培养方法采摇瓶培养，控制转速为160-180r/min，培养温度为30-34℃，培养时间10-14h。
本发明基于发酵过程中可产生乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种，通过向其培养基中添加增效剂，以促进乳酸菌的生产，提高乳酸链球菌素的生产量，减少培养时间，提高生产效率，以降低生产成本。所述增效剂中牛磺酸具有具有促进微生物产生菌体蛋白，为微生物的的生长提供硫源，同时牛磺酸被乳酸乳球菌乳亚种利用并参与蛋白合成，提高抗菌肽的抑菌作用，添加量为0.02-1.5，更为优选为0.08-1.2过多会抑制乳酸乳球菌乳亚种对硒的富集，过少会减弱抗菌肽的抗菌能力；硒具有促进乳酸乳球菌乳亚种的生长能力和耐酸性，添加量为0.003-0.006，更为优选为0.004-0.005，过多会抑制微生物的生长，过少会减弱乳酸链球素的生成；脯氨酸具有对乳酸乳球菌乳亚种有强的增值作用，其作为氮源有助于乳酸乳球菌乳亚种的吸收利用，与牛磺酸共同促进枯草芽孢杆菌产抗菌肽，添加量为0.03-0.8，更为优选为0.2-0.5，过多会抑制抑制牛磺酸的吸收利用，抑制乳酸乳球菌乳亚种产抗菌肽能力，过少会不利于菌体的生长；赖氨酸具有促进乳酸乳球菌乳亚种合成蛋白质，与牛磺酸协同促进乳酸乳球菌乳亚种合成乳酸链球菌素，添加量为0.05-1.0，更为优选为0.07-0.09，过多会抑制微生物的生长，过少会减少菌体合成乳酸链球菌素；肌醇具有促进微生物生长，延缓微生物的衰亡，添加量为0.02-0.052，更为优选为0.03-0.04，过多会无明显效果，过少会导致微生物衰亡快。
本发明增效剂用于乳酸乳球菌乳亚种发酵培养时，将其加入到M17培养基中混合均匀，其加入量为M17培养基质量的0.12％-3.36％，在此加入量作用下，能够促进增效剂之间的协同作用乳酸乳球菌乳亚种对其有良好的富集作用，促进乳酸乳球菌乳亚种自身的生长，延迟生长衰亡期；在添加增效剂的培养条件下，乳酸乳球菌乳亚种产生的乳酸链球菌素增多，其抗菌能力也得到大大的增强。
有益效果：
(1)本发明针对可发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种研制出一种增效剂，可大幅提高乳酸乳球菌乳亚种培养过程中乳酸链球菌素的产生量，提高乳酸乳球菌乳亚种的代谢，延迟其生长衰亡，从而降低生产成本、缩短生产周期，提高生产效率。
(2)本发明增效剂各组分原料易得，采购成本低、通过简单混合后加入M17培养基中混匀即可，使用方法极为简单可靠、可控性好、具有广阔的市场应用前景。
(3)同一乳酸菌在相同培养条件下，采用本发明增效剂与未使用增效剂的普通培养过程相比，乳酸菌代谢更为旺盛，能够突破乳酸乳球菌乳亚种自身的乳酸链球菌素产量极限，可提高乳酸链球菌素产量达50％以上，降低40％的生产成本。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一，增效剂配方实施例1-5例见表1。
表1增效剂实施例配方(重量比)
牛磺酸 硒 脯氨酸 赖氨酸 肌醇
增效剂1 1.5 0.006 0.8 1.0 0.052
增效剂2 0.02 0.003 0.03 0.05 0.02
增效剂3 0.10 0.0045 0.3 0.08 0.035
增效剂4 0.08 0.004 0.2 0.07 0.03
增效剂5 1.2 0.005 0.5 0.09 0.04
二、乳酸菌发酵实施例1-5，其中，所述乳酸乳球菌乳亚种为保藏号为CGMCC NO1.2829的乳酸乳球菌乳球亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。
(1)、配制M17培养基置于三角瓶中，LB培养基配方为1.0g蛋白胨、0.5g酵母粉、0.2g柠檬酸铵、2.0g葡萄糖、0.3g乙酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.058g硫酸镁、0.025g硫酸锰、1.0g牛肉膏、0.1g吐温-80、100mL水；
(2)、向M17培养基加入增效剂，加入量见表2；
(3)、将乳酸菌接种到上述灭菌后的M17培养基中，接种量见表2，进行摇瓶培养，转速为160-180r/min，培养温度为30-34℃，培养时间10-14h，分别得到培养菌液1-5。
表2枯草芽孢杆菌的发酵实施例1-5
上述百分比以步骤(1)中M17培养基总质量为100％计。
对比实施例：
对比发酵实施例1：步骤(2)中的增效剂中不含有牛磺酸和硒，其余同发酵实施例1，得到对比培养菌液1；
对比发酵实施例2：步骤(2)中的增效剂中不含有脯氨酸、赖氨酸，其余同实施例1，得到对比培养菌液2；
对比发酵实施例3：步骤(2)中不添加增效剂，其余同实施例1，得到对比培养菌液3。
对比实验方法：
(1)、使用5mol/L的HCl将培养菌液调至pH2.5，之后90℃加热30min，5400r/min离心12min，除去沉淀，收集上清液备用；
(2)取生长量为107CFU/mL的金黄色葡萄球菌(菌种保藏编号为CGMCC NO 1.8721)培养液作为指示菌悬液，将经灭菌后的指示菌生长培养基倒入直径9cm的培养皿中，每皿15mL，待冷却凝固后加入0.2mL指示菌悬液涂匀，待干燥后用无菌镊子放置牛津杯(内径6.0±0.1mm，高8.0±0.1mm)。静置20min后取步骤(1)中得到的上清液0.1mL加入牛津杯内。将所述牛津杯小心放入培养箱，使杯内的发酵液充分扩散到培养基中，37℃培养48h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每组做3个重复，取平均值。
将培养菌液1-5和对比培养菌液1-3分别采用上述实验方法进行对比实验，通过杯碟法测试乳酸乳球菌乳球亚种(保藏号为CGMCC NO1.2829)产乳酸链球菌素含量，并对培养液稀释10倍，使用紫外分光光度测量OD值(测量波长为600nm)，结果见表3。
表3，对比实验结果。
由表3可知，牛磺酸、硒、脯氨酸、赖氨酸、肌醇对乳酸乳球菌乳亚种的生长有明显的促进作用，而且显著增强了乳酸乳球菌乳所产乳酸链球菌素的能力，并且提高了乳酸链球菌素的抑菌能力。本发明提供大家一组可增强乳酸乳球菌乳亚种产乳酸链球菌素的增效剂，这一组增效剂具有协同作用，可显著提高了乳酸乳球菌乳亚种的抑菌能力，是一种经济环保的创新。

Claims (5)

1.一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂，其特征在于，所述增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.02-1.5、硒0.003-0.006、脯氨酸0.03-0.8、赖氨酸0.05-1.0、肌醇0.02-0.052。
2.如权利要求1所述的发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂，其特征在于，所述增效剂由以下成分按重量比组成：
牛磺酸0.08-1.2、硒0.004-0.005、脯氨酸0.2-0.5、赖氨酸0.07-0.09、肌醇0.03-0.04。
3.如权利要求1或2所述的发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳亚种为可发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)，其保藏号为CGMCC NO 1.2829。
4.如权利要求1-3任一项所述的增效剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制M17培养基；
(2)向所述M17培养基中加入所述增效剂，加入量为所述M17培养基质量0.12％-3.36％；
(3)将乳酸菌接种到步骤(2)得到的M17培养基中进行培养得到培养菌液，所述乳酸菌的接种量为所述MI7培养基质量的1.0％-1.5％。
5.如权利要求4所述的增效剂的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养方法采用摇瓶培养，控制转速为160-180r/min，培养温度为30-34℃，培养时间10-14h。
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