CN102796168B

CN102796168B - 一种具有溶血栓活性的化合物，及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102796168B
Application number: CN201110141126.7A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 李国春
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: CN102796168A

Abstract

本发明提供了通式为I：Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，式中AA为甘氨酸残基、L-缬氨酸残基、L-色氨酸残基、L-亮氨酸残基、L-丙氨酸残基、L-蛋氨酸残基、L-酪氨酸残基、L-天冬酰胺残基、L-异亮氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、L-脯氨酸残基、L-丝氨酸残基、L-苏氨酸残基、L-谷氨酰胺残基、L-天冬氨酸残基、L-谷氨酸残基、L-精氨酸残基或L-赖氨酸残基代表的18种溶血栓化合物(4a-r)，还提供了它们的制备方法，进一步验证了它们在大鼠颈动静脉旁路插管血栓模型上的溶血栓作用，以及自主装性能。本发明提供的18种溶血栓化合物在临床应用中具有很好的应用前景。

Description

一种具有溶血栓活性的化合物,及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成的化合物及其制备方法和应用，特别涉及一种具有溶血栓活性的化合物，还涉及其制备方法和在制备溶血栓药物中的应用，本发明属于生物医药领域。

背景技术

目前，临床上治疗急性血栓栓塞性疾病主要是通过使用链激酶、尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂等药物进行该疾病的治疗，但使用这些药物的同时普遍存在全身出血倾向和免疫原性反应等不良后果，因此，寻找一种安全有效的药物是治疗急性血栓栓塞性疾病的新药研究热点之一。

P6A(ARPAK)为纤维蛋白β链降解产物之一，具有溶血栓活性。在P6A的代谢研究中发现了代谢产物PAK。在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上，研究发现PAK的溶血栓活性比母体P6A强。按照一般的认识，多肽在体内都会迅速降解。通过PAK的结构修饰进而延缓多肽在体内的降解速率和提高溶血栓活性，是溶血栓药物研究的重要途径之一。

含多肽的两亲性分子，例如脂肪胺链修饰的多肽，在适当的条件下可以通过分子间非共价键相互作用可发生自组装，形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽在体内的输送、延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明目的之一是提供具有溶血栓活性的通式I的化合物(用4a-r表示)：。

Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃ 通式I

式中，AA选自甘氨酸(Gly)残基、L-缬氨酸(Val)残基、L-色氨酸残基(Trp)、L-亮氨酸残基(Leu)、L-丙氨酸(Ala)残基、L-蛋氨酸(Met)残基、L-酪氨酸(Tyr)残基、L-天冬酰胺(Asn)残基、L-异亮氨酸(Ile)残基、L-苯丙氨酸(Phe)残基、L-脯氨酸(Pro)残基、L-丝氨酸(Ser)残基、L-苏氨酸(Thr)残基、L-谷氨酰胺(Gln)残基、L-天冬氨酸(Asp)残基、L-谷氨酸(Glu)残基、L-精氨酸(Arg)残基或L-赖氨酸(Lys)残基其中之一；

4a为AA＝甘氨酸残基时代表的化合物、4b为AA＝L-丙氨酸残基时代表的化合物、4c为AA＝L-苯丙氨酸残基时代表的化合物、4d为AA＝L-缬氨酸残基时代表的化合物、4e为AA＝L-亮氨酸残基时代表的化合物、4f为AA＝L-异亮氨酸残基时代表的化合物、4g为AA＝L-脯氨酸残基时代表的化合物、4h为AA＝L-酪氨酸残基时代表的化合物、4i为AA＝L-色氨酸残基时代表的化合物、4j为AA＝L-天冬氨酸残基时代表的化合物、4k为AA＝L-谷氨酸残基时代表的化合物、4l为AA＝L-精氨酸残基时代表的化合物、4m为AA＝L-丝氨酸残基时代表的化合物、4n为AA＝L-苏氨酰胺残基时代表的化合物、4o为AA＝L-赖氨酸残基时代表的化合物、4p为AA＝L-甲硫氨酸残基时代表的化合物、4q为AA＝L-天冬酰胺残基时代表的化合物、4r为AA＝L-谷氨酰胺残基时代表的化合物。

本发明目的之二是提供一种制备上述具有溶血栓活性化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)存在下Boc-Pro在无水THF中与Ala缩合为Boc-Pro-Ala；

2)在DCC和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下Boc-AA在无水四氢呋喃(THF)中与碳十四醇缩合为Boc-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃；

3)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃脱去Boc生成AA-O-CH₂(CH₂)₁₂CH₃；

4)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在无水THF中与AA-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃缩合为Boc-Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃；

5)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃脱除Boc生成Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃。

本发明目的之三是将上述的化合物应用于制备溶血栓药物中。

体外和体内溶血栓活性试验表明，本发明通式I所示的化合物4a-r具有优秀的溶血栓活性活性，可应用于溶血栓药物的制备中。

附图说明

图1为本发明通式为I的化合物4a-r的合成路线图；

i)DCC，HOBt，NMM；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)DCC，HOSu，NaHCO₃和Ala；iv)DCC，HOBt，NMM；v)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；

图2为化合物4k的透射电子显微镜照片。

缩略术语

THF 四氢呋喃

HOBt N-羟基苯并三氮唑

DCC 二环己基羰二亚胺

DCU 二环己基脲

TLC 薄层色谱

Boc 叔丁氧羰基

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 制备Boc-Pro-Ala

将2.00g(9.00mmol)Boc-Pro用40ml无水THF溶解。向得到的溶液中加入1.16g(10.00mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)并完全溶解。10分钟后，在冰浴下加入2.29g(11.00mmol)DCC与20ml无水THF的溶液，得到反应液。在室温下搅拌10h，薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)(二氯甲烷/甲醇，30∶1))显示Boc-Pro消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压除去THF。残留物用150ml乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液各洗三次，有机相减压浓缩至干。剩余物用40ml THF溶解，得到反应液(I)。将827mg(9mmol)Ala用30ml水溶解，得到反应液(II)。搅拌下将反应液(II)加入反应液(I)中，用饱和NaHCO₃调混合液pH至8-9之间，室温下搅拌16h，反应过程中时时抽CO₂气，并保持溶液pH至8-9之间，TLC(二氯甲烷/甲醇，30∶1)显示反应液(I)消失。反应后溶液减压除去THF，残余液用饱和KHSO₄水调溶液PH至2，得到的溶液用乙酸乙酯少量多次萃取，收集有机相，有机层用饱和NaCl水溶液洗三次，分出有机相用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得1.99g(66％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：309[M+Na]⁺

实施例2 制备Boc-Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1a)

将828mg(4.60mmol)Boc-Gly用20ml无水THF溶解。向得到的溶液中加入0.68g(4.80mmol)HOBt。10分钟后，在冰浴下加入1.13g(5.50mmo1)二环己基碳二亚胺(DCC)与25ml无水THF的溶液，得到反应液(I)。把1.00g(4.60mmo1)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH溶于10ml无水THF并搅拌30分钟，得到反应液(II)。冰浴下将反应液(II)加入反应液(I)中，然后室温搅拌6h，TLC(石油醚∶丙酮，4∶1)显示Boc-Gly消失。反应混合物过滤，滤除DCU。滤液减压浓缩，除去THF。残留物用100ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯溶液用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化，得到582mg(46％)本实施例的目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：372[M+H]⁺.

实施例3 制备Boc-Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1b)

按照实施例2的方法由895mg(4.70mmol)Boc-Ala和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得899mg(50％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：408[M+Na]⁺

实施例4 制备Boc-Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1c)

按照实施例2的方法由1.35g(4.70mmol)Boc-Phe和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.12g(52％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：462[M+H]⁺

实施例5 制备Boc-Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1d)

按照实施例2的方法由1.02g(4.70mmol)Boc-Val和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.12mg(58％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：413[M+H]⁺

实施例6 制备Boc-Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1e)

按照实施例2的方法由1.34g(4.70mmol)Boc-Leu和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得957mg(48％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：450[M+Na]⁺

实施例7 制备Boc-Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1f)

按照实施例2的方法由1.33g(4.70mmol)Boc-Ile和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得997mg(50％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：450[M+Na]⁺

实施例8 制备Boc-Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1g)

按照实施例2的方法由1.10g(4.70mmol)Boc-Pro和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得998mg(52％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。ESI-MS(m/e)：434[M+Na]⁺

实施例9 制备Boc-Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1h)

按照实施例2的方法由2.42g(4.70mmol)Boc-Tyr和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.00g(45％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：500[M+Na]⁺

实施例10 制备Boc-Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1i)

按照实施例2的方法由2.57g(4.70mmol)Boc-Trp和1.00g(4.60mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.05g(45％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：501[M+H]⁺

实施例11 制备Boc-Asp(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1j)

按照实施例2的方法由2.56g(7.90mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.50g(7.00mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.38g(38％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：520[M+H]⁺

实施例12 制备Boc-Glu(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1k)

按照实施例2的方法由3.14g(9.30mmol)Boc-Glu(OBzl)和2.00g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.69g(34％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：556[M+Na]⁺

实施例13 制备Boc-Arg(NO₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1l)

按照实施例2的方法由3.02g(9.50mmol)Boc-Arg(NO₂)和1.97g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得822mg(17％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：538[M+Na]⁺

实施例14 制备Boc-Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1m)

按照实施例2的方法由2.84g(9.60mmol)Boc-Ser(Bzl)和1.80g(8.40mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.46g(51％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：514[M+Na]⁺

实施例15 制备Boc-Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1n)

按照实施例2的方法由2.40g(7.70mmol)Boc-Thr(Bzl)和1.50g(7.00mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.32g(36％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：528[M+Na]⁺

实施例16 制备Boc-Lys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1o)

按照实施例2的方法由3.55g(9.30mmol)Boc-Lys(Z)和2.00g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得2.11g(39％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：599[M+Na]⁺

实施例17 制备Boc-Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1p)

按照实施例2的方法由2.22g(8.90mmol)Boc-Met和1.90g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得2.41g(61％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：468[M+Na]⁺

实施例18 制备Boc-Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1q)

按照实施例2的方法由2.16g(9.30mmol)Boc-Asn和2.00g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.60g(40％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：451[M+Na]⁺

实施例19 制备Boc-Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1r)

按照实施例2的方法由2.29g(9.30mmol)Boc-Gln和2.00g(9.30mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH，经过柱层析制得1.58g(38％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：443[M+H]⁺

实施例20 制备Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2a)

将1.28g(3.45mmol)溶解在15ml 4N氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌3小时，TLC(石油醚/丙酮，4∶1)显示Boc-Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量***进行减压浓缩以除去氯化氢。最后加少量***将残留物研磨成900mg(84％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：272[M+H]⁺.

实施例21 制备Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2b)

按照实施例20的方法328mg(0.85mmol)Boc-Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得270mg(99％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：286[M+H]⁺..

实施例22 制备Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2c)

按照实施例20的方法1.09g(2.36mmol)Boc-Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得935mg(99％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：362[M+H]⁺.

实施例23 制备Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2d)

按照实施例20的方法927mg(2.24mmol)Boc-Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得770mg(98％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：314[M+H]⁺.

实施例24 制备Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2e)

按照实施例20的方法360mg(0.84mmol)Boc-Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得280mg(92％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：328[M+H]⁺.

实施例25 制备Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2f)

按照实施例20的方法1.60g(3.74mmol)Boc-Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.30g(99％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：328[M+H]⁺.

实施例26 制备Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2g)

按照实施例20的方法2.00g(4.86mmol)Boc-Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.48g(88％)本实施例的目标化合物，为黄色固体粉末。ESI-MS(m/e)：312[M+H]⁺.

实施例27 制备Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2h)

按照实施例20的方法1.06g(2.22mmol)Boc-Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得910mg(98％)本实施例的目标化合物，为棕黄色固体粉末。ESI-MS(m/e)：378[M+H]⁺.

实施例28 制备Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2i)

按照实施例20的方法1.32g(2.64mmol)Boc-Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.12g(99％)本实施例的目标化合物，为灰色固体粉末。ESI-MS(m/e)：401[M+H]⁺.

实施例29 制备Asp(OBzD-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2j)

按照实施例20的方法1.40g(2.69mmol)Boc-Asp(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.17g(98％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：420[M+H]⁺.

实施例30 制备Glu(OBzD-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2k)

按照实施例20的方法1.70g(3.18mmol)Boc-Glu(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.40g(93％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：434[M+H]⁺.

实施例31 制备Arg(N0₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2l)

按照实施例20的方法800mg(1.55mmol)Boc-Arg(NO₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得650mg(91％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：416[M+H]⁺.

实施例32 制备Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2m)

按照实施例20的方法2.20g(4.48mmol)Boc-Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.80g(95％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：392[M+H]⁺.

实施例33 制备Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2n)

按照实施例20的方法1.30g(2.57mmol)Boc-Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.09g(96％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：406[M+H]⁺.

实施例34 制备Lys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2o)

按照实施例20的方法1.10g(1.90mmol)Boc-Lys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得960mg(98％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：477[M+H]⁺.

实施例35 制备Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2p)

按照实施例20的方法3.19g(7.16mmol)Boc-Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得2.50g(94％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：346[M+H]⁺.

实施例36 制备Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2q)

按照实施例20的方法1.10g(2.57mmol)Boc-Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得928mg(99％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：329[M+H]⁺.

实施例37 制备Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2r)

按照实施例20的方法1.57g(3.55mmol)Boc-Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得1.20g(90％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/e)：343[M+H]⁺.

实施例38 制备Boc-Pro-Ala-Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3a)

按照实施例2的方法由228mg(0.80mmol)Boc-Pro-Ala和255mg(0.80mmol)Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得94mg(22％)目标化合物，为无色油状物。[α]_D ²⁵＝-163.1(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：563[M+Na+H]⁺；IR(KBr)：3859，3606，3059，2865，2743，2522，2227，2044，1744，1673，1549，1204，1085，968，848，475cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.58-4.48(m，1H)，4.27(s，1H)，4.14-4.10(d，J＝6.6Hz，2H)，4.02-3.89(m，2H)，3.46(s，2H)，2.18(s，2H)，1.90(s，1H)，1.65-1.60(m，2H)，1.46(s，9H)，1，41-1.39(d，J＝7.2Hz，3H)，1.26(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝4.8Hz，3H).

实施例39 制备Boc-Pro-Ala-Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3b)

按照实施例2的方法由918mg(3.20mmol)Boc-Pro-Ala和1.00g(3.20mmol)Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得656mg(37％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：65-66℃；[α]_D ²⁵＝-81.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：577[M+Na+H]⁺；IR(KBr)：3840，3744，3292，3077，2921，2852，2360，1742，1702，1646，1547，1457，1398，1209，1164，964，918，877，768，723，671cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.58-4.44(m，2H)，4.30(s，1H)，4.20-4.07(m，2H)，3.47-3.39(m，2H)，2.27-2.14(m，1H)，1.90(s，2H)，1.79(s，1H)，1.66-1.62(m，2H)，1.47(s，9H)，1.43-1.38(m，6H)，1.27-1.16(m，22H)，0.91-0.87(m，3H).

实施例40 制备Boc-Pro-Ala-Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3c)

按照实施例2的方法由675mg(2.30mmol)Boc-Pro-Ala和940mg(2.30mmol)Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得742mg(50％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：74-75℃；[α]_D ²⁵＝-57.2(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：652[M+Na]⁺；IR(KBr)：3306，2923，2854，2361，1741，1648，1540，1457，1395，1201cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.37-7.23(s，3H)，7.14-7.11(d，J＝7.2Hz，2H)，4.85-4.79(m，1H)，4.42-4.38(m，1H)，4.23(s，1H)，4.11-4.07(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(s，2H)，3.14-3.10(m，2H)，2.19-2.12(m，1H)，1.90(s，2H)，1.71(s，1H)，1.61-1.59(m，2H)，1.48(s，9H)，1.34-1.32(m，3H)，1.25(s，22H)，0.92-0.87(t，J＝6.0Hz，3H).

实施例41 制备Boc-Pro-Ala-Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3d)

按照实施例2的方法由623mg(2.10mmol)Boc-Pro-Ala和780mg(2.10mmol)Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得772mg(61％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。[α]_D ²⁵＝-90.5(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：582[M+H]⁺；IR(KBr)：3816，3338，2945，2833，2659，2309，2145，1948，1740，1676，1556，1455，1258，1165，1114，1031，673cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.52-4.48(m，2H)，4.29(s，1H)，4.23-4.06(m，2H)，3.46(s，2H)，2.22-2.15(m，2H)，1.89(s，2H)，1.81(s，1H)，1.66-1.62(m，2H)，1.46(s，9H)，1.40-1.37(d，J＝6.6Hz，3H)，1.27(s，22H)，0.95-0.87(m，9H).

实施例42 制备Boc-Pro-Ala-Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3e)

按照实施例2的方法由243mg(0.80mmol)Boc-Pro-Ala和306mg(0.80mmol)；Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得278mg(55％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。[α]_D ²⁵＝-123.3(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：619[M+Na+H]⁺；IR(KBr)：3852，3591，3060，2865，2753，2522，2228，2045，1666，1525，1335，1147，1086，977，830，540cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.57-4.50(m，2H)，4.27(s，1H)，4.15-4.03(m，2H)，3.46-3.37(m，2H)，2.19(s，1H)，1.88-1.87(m，2H)，1.66-1.51(m，5H)，1.44(s，9H)，1.37(s，2H)，1.35(s，2H)，1.25(s，22H)，0.92-0.89(m，6H)，0.87-0.84(m，3H).

实施例43 制备Boc-Pro-Ala-Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3f)

按照实施例2的方法由1.07g(3.70mmol)Boc-Pro-Ala和1.36g(3.70mmol)Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得1.06g(48％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：57-58℃；[α]_D ²⁵＝-55.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：618[M+Na]⁺；IR(KBr)：3743，3307，2962，2923，2853，2360，1750，1700，1652，1542，1460，1398，1254，1196，1163，1124，976，645cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.55-4.50(m，2H)，4.28(s，1H)，4.18-4.03(m，3H)，3.47-3.36(m，2H)，2.17(s，2H)，1.89-1.87(m，3H)，1.65-1.58(m，2H)，1.45(s，9H)，1.37-1.35(d，J＝6.9Hz，4H)，1.20(s，22H)，0.92-0.85(m，9H).

实施例44 制备Boc-Pro-Ala-Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3g)

按照实施例2的方法由501mg(1.70mmol)Boc-Pro-Ala和800mg(1.70mmol)Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得535mg(45％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。[α]_D ²⁵＝-69.9(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：602[M+Na]⁺；IR(KBr)：3395，3301，2943，2831，2326，2134，1679，1451，1417，1171，1114，1030，655cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.72(s，1H)，4.53-4.50(m，1H)，4.26(s，1H)，4.13-4.03(m，1H)，3.69-3.62(m，2H)，3.48-3.37(m，2H)，3.17(s，4H)，2.06-2.02(m，4H)，1.90-1.86(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.45(s，9H)，1.38-1.36(d，J＝6.6Hz，3H)，1.24(s，20H)，0.90-0.86(t，J＝6.0Hz，3H).

实施例45 制备Boc-Pro-Ala-Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3h)

按照实施例2的方法由637mg(2.20mmol)Boc-Pro-Ala和920mg(2.20mmol)Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得890mg(62％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：98-99℃；[α]_D ²⁵＝-93.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：647[M+2H]⁺；IR(KBr)：3745，3295，3095，2925，2855，2361，1705，1653，1542，1455，1403，1367，1293，1254，1229，1168，1123，827，714cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.31-7.28(m，1H)，6.95-6.92(d，J＝8.4Hz，2H)，6.74-6.71(d，J＝8.4Hz，2H)，4.81-4.75(m，1H)，4.41(s，1H)，4.25(s，1H)，4.13-4.08(t，J＝6.6Hz，2H)，3.46-3.37(m，2H)，3.10-2.96(m，2H)，2.19(s，2H)，1.87(s，2H)，1.63-1.55(m，3H)，1.46(s，9H)，1.26(s，24H)，0.91-0.86(t，J＝6.2Hz，3H).

实施例46 制备Boc-Pro-Ala-Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3i)

按照实施例2的方法由747mg(2.60mmol)Boc-Pro-Ala和1.15g(2.60mmol)Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得994mg(57％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。[α]_D ²⁵＝-116.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：669[M+H]⁺；IR(KBr)：3456，2940，2831，2523，1673，1450，1113，1031，660cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.37(s，1H)，7.54-7.52(d，J＝7.8Hz，1H)，7.36-7.33(d，J＝7.8Hz，1H)，7.28(s，1H)，7.20-7.08(m，2H)，7.03(s，1H)，4.89-4.87(m，1H)，4.44-4.40(m，1H)，4.17(s，1H)，4.17-3.98(m，2H)，3.45(s，2H)，3.31-3.29(d，J＝5.4Hz，2H)，2.19-2.11(m，1H)，1.86(s，1H)，1.77(s，1H)，1.62-1.56(m，3H)，1.48(s，9H)，1.17(s，24H)，0.92-0.87(d，J＝6.6Hz，3H).

实施例47 制备Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3j)

按照实施例2的方法由627mg(2.20mmol)Boc-Pro-Ala和1.00g(2.20mmol)Asp(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得602mg(40％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：51-52℃；[α]_D ²⁵＝-78.3(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：711[M+Na+H]⁺；IR(KBr)：3360，2924，2854，2360，1737，1699，1651，1516，1457，1401，1364，1297，1168，1121，980，747，592cm^-1；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.34-7.28(d，J＝18.6Hz，5H)，5.11(s，2H)，4.83-4.82(d，J＝3.6Hz，1H)，4.44(s，1H)，4.26(s，1H)，4.10-4.05(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(s，2H)，3.01-2.84(m，2H)，2.25-2.10(m，2H)，1.88-1.86(m，2H)，1.56-1.54(m，2H)，1.45(s，9H)，1.38-1.36(d，J＝6.6Hz，3H)，1.25(s，22H)，0.89-0.85(t，J＝6.0Hz，3H).

实施例48 制备Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3k)

按照实施例2的方法由851mg(2.90mmol)Boc-Pro-Ala和1.40g(2.90mmol)Glu(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得938mg(45％)本实施例的目标化合物，为无色油状物。[α]_D25＝-117.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：724[M+Na]；IR(KBr)：3564，3061，2862，2781，2598，2520，2227，2045，1739，1675，1548，1374，1168，993，748，583cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.35-7.28(m，5H)，5.11(s，2H)，4.60-4.53(m，1H)，4.46(s，1H)，4.28(s，1H)，4.13-4.09(t，J＝6.6Hz，2H)，3.44-3.35(m，2H)，2.61-2.35(m，2H)，2.28-2.17(m，2H)，2.12-1.96(m，2H)，1.87-1.85(m，2H)，1.64-1.54(m，2H)，1.44(s，9H)，1.38-1，36(d，J＝7.2Hz，3H)，1.26(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝6.3Hz，3H).

实施例49 制备Boc-Pro-Ala-Arg(NO₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3l)

按照实施例2的方法由443mg(1.50mmol)Boc-Pro-Ala和700mg(1.50mmol)Arg(NO₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得556mg(50％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：59-60℃；[α]_D ²⁵＝-101.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：684[M+H]⁺；IR(KBr)：3739，3306，2925，2855，2360，1742，1654，1540，1455，1399，1258，1164，1119，976，774，724，662cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.71(s，1H)，7.88(s，1H)，4.56-4.48(m，2H)，4.28(s，1H)，4.14-4.10(t，J＝6.6Hz，2H)，3.94(s，1H)，3.44-3.30(m，4H)，2.18-2.08(m，2H)，1.90-1.88(m，4H)，1.65-1.63(m，6H)，1.46(s，9H)，1.40-1.38(d，J＝6.3Hz，3H)，1.25(s，22H)，0.90-0.85(t，J＝6.3Hz，3H).

实施例50 制备Boc-Pro-Ala-Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3m)

按照实施例2的方法由1.28g(4.40mmo1)Boc-Pro-Ala和1.90g(4.40mmol)Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得1.33g(48％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。[α]_D ²⁵＝-67.3(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：660[M+H]⁺IR(KBr)：3504，3191，2831，2602，2522，2227，2044，1744，1675，1451，1114，1033，649cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.37-7.26(m，5H)，4.72-4.68(m，1H)，4.57-4.45(m，3H)，4.27(s，1H)，4.19-4.07(m，2H)，3.92-3.86(m，1H)，3.71-3.65(m，1H)，3.45(s，2H)，2.21-2.17(m，1H)，2.00(s，1H)，1.89-1.84(m，2H)，1.62-1.56(m，2H)，1.46(s，9H)，1.41-1.36(m，3H)，1.24(s，22H)，0.91-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例51制备Boc-Pro-Ala-Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3n)

按照实施例2的方法由712mg(2.50mmol)Boc-Pro-Ala和1.10g(2.50mmol)Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得759mg(46％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：49-50℃；[α]_D ²⁵＝-95.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：674[M+H]⁺；IR(KBr)：3745，3304，2923，2854，2360，1739，1702，1652，1540，1456，1399，1212，1166，1121，1074，469cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.36-7.20(m，5H)，4.68-4.59(m，2H)，4.55-4.51(m，1H)，4.40-4.36(d，J＝11.7Hz，1H)，4.27-3.98(m，4H)，3.46(s，2H)，2.17(s，1H)，2.01(s，1H)，1.87-1，86(m，2H)，1.58-1.51(m，2H)，1.45(s，9H)，1.43-1.40(m，3H)，1.26(s，22H)，1.22-1.20(m，3H)，0.91-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例52 制备Boc-Pro-Ala-Iys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3o)

按照实施例2的方法由529mg(1.80mmol)Boc-Pro-Ala和950mg(1.80mmol)Lys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得400mg(29％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。[α]_D ²⁵＝-28.2(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：767[M+Na]⁺；IR(KBr)：3859，3525，2590，2521，2225，2044，1677，1420，1262，996，597cm^-1 ¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.36-7.30(m，5H)，5.14-5.04(m，2H)，4.55-4.48(m，2H)，4.31-4.27(m，1H)，4.14-4.09(t，J＝6.6Hz，2H)，3.91-3.88(m，1H)，3.42(s，1H)，3.27-3.11(m，2H)，2.18(s，1H)，1.85-1.80(m，4H)，1.72-1.61(m，4H)，1.59-1.49(m，2H)，1.46(s，9H)，1.37-1.35(d，J＝6.9HZ，5H)，1.26(s，22H)，0.91-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例53 制备Boc-Pro-Ala-Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3p)

按照实施例2的方法由1.87g(6.50mmol)Boc-Pro-Ala和2.50g(6.50mmol)Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得2.60g(65％)本实施例的目标化合物，为黄色油状物。[α]_D ²⁵＝-22.6(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：652[M+K]⁺；IR(KBr)：3859，3563，3O94，2884，2783，2594，2522，2227，2044，1732，1671，1483，1120，987，740cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝4.64(s，1H)，4.44-4.39(t，J＝6.9Hz，1H)，4.31-4.28(m，1H)，4.16-4.11(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(s，2H)，2.89-2.68(m，2H)，2.59(s，3H)，2.42-2.36(m，1H)，2.23-2.11(m，2H)，2.04-2.04(m，1H)，1.91-1.87(m，2H)，1.66-1.62(t，J＝6.6Hz，2H)，1.47(s，9H)，1.39-1.37(d，J＝7.2Hz，3H)，1.26(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例54 制备Boc-Pro-Ala-Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3q)

按照实施例2的方法由780mg(2.70mmol)Boc-Pro-Ala和981mg(2.70mmol)Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得345mg(21％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：80-81℃；[α]_D ²⁵＝-27.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：619[M+Na]⁺；IR(KBr)：3420，3298，3219，2921，2852，2361，1742，1667，1513，1404，1211，1164，1119，1053，604cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.57-7.54(d，J＝8.1Hz，1H)，6.57(s，1H)，6.35(s，1H)，4.91(s，1H)，4.62(s，1H)，4.23(s，1H)，4.14-4.09(d，J＝6.6Hz，2H)，3.47-3.40(m，2H)，2.75(s，2H)，2.12-2.10(m，2H)，1.91-1.86(m，2H)，1.64-1.60(m，2H)，1.46(s，9H)，1.41-1.38(d，J＝6.9Hz，3H)，1.25(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例55 制备Boc-Pro-Ala-Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3r)

按照实施例2的方法由981mg(3.40mmol)Boc-Pro-Ala和1.30g(3.40mmol)Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，经过柱层析制得600mg(28％)本实施例的目标化合物，为无色固体。Mp：90-91℃；[α]_D ²⁵＝-40.1(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：633[M+Na]⁺；IR(KBr)：3424，3289，3203，3090，2924，2853，2360，1728，1660，1550，1404，1314，1252，1213，1168，1124，989，662cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.11(s，1H)，6.68(s，1H)，5.78(s，1H)，4.60-4.47(m，2H)，4.31(s，1H)，4.13-4.09(t，J＝6.9Hz，2H)，3.47-3.39(m，2H)，2.27-2.25(m，4H)，2.10-2.00(m，2H)，1.94-1.86(m，2H)，1.65-1.60(m，2H)，1.46(s，9H)，1.38-1.36(d，J＝6.9Hz，3H)，1.26(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例56 制备Boc-Pro-Ala-Asp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将320mg(0.46mmol)Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加50mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得270mg(97％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：597[M-H]^-.

实施例57制备Boc-Pro-Ala-Glu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将420mg(0.59mmol)Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加65mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得350mg(95％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：610[M-H]^-.

实施例58 制备Boc-Pro-Ala-Arg-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将560mg(0.82mmol)Boc-Pro-Ala-Arg(NO₂)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加90mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得510mg(97％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：639[M+H]⁺

实施例59 制备Boc-Pro-Ala-Ser-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将390mg(0.59mmol)Boc-Pro-Ala-Ser(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加60mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得330mg(98％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：592[M+Na]⁺

实施例60 制备Boc-Pro-Ala-Thr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将380mg(0.56mmol)Boc-Pro-Ala-Thr(Bzl)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加60mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得300mg(91％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：606[M+Na]⁺

实施例61 制备Boc-Pro-Ala-Iys-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃

将980mg(1.31mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加150mg Pd/C(15％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得750mg(93％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：611[M+H]⁺

实施例62 制备Pro-Ala-Gly-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4a)

按照实施例20的方法200mg(0.37mmol)Boc-Pro-Ala-Gly-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得154mg(95％)本实施例的目标化合物，为黄色固体粉末。Mp：119-120℃；[α]_D ²⁵＝-51.1(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：440[M+H]⁺；IR(KBr)：3223，2924，2854，1749，1668，1551，1459，1394，1197cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.82(s，1H)，8.73(s，1H)，8.37(s，1H)，8.09(s，1H)，4.79(s，1H)，4.59(s，1H)，4.16-4.05(m，2H)，4.03-3.92(m，2H)，3.51(s，2H)，2.53(s，1H)，2.15(s，1H)，2.05-2.04(m，2H)，1.61-1.59(m，2H)，1.26(s，22H)，0.90-0.85(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例63 制备Pro-Ala-Ala-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4b)

按照实施例20的方法320mg(0.57mmol)Boc-Pro-Ala-Ala-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得264mg(94％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：112-113℃；[α]_D ²⁵＝-103.0(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：454[M+H]⁺；IR(KBr)：3286，3207，3053，2922，2853，1742，1656，1551，1458，1384，1340，1245，1209，1165，1049cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.66(s，1H)，8.63(s，1H)，8.30(s，1H)，4.82(s，2H)，4.45-4.40(m，1H)，4.21-4.13(m，1H)，4.07-3.99(m，1H)，3.48(s，2H)，2.54(s，1H)，2.18(s，1H)，2.06(s，3H)，1.64-1.61(m，2H)，1.50-1.48(m，6H)，1.27(s，22H)，0.91-0.87(t，J＝6.3Hz，3H).

实施例64 制备Pro-Ala-Phe-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4c)

按照实施例20的方法300mg(0.47mmol)Boc-Pro-Ala-Phe-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得239mg(95％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：97-99℃；[α]_D ²⁵＝-22.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：530[M+H]⁺；IR(KBr)：3325，3206，3031，2919，2850，2365，1745，1687，1650，1537，1464，1347，1271，1179，1034，706，491cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.29(s，1H)，8.71(s，1H)，8.11(s，1H)，7.37-7.18(s，5H)，4.77-4.75(d，J＝6.0Hz，2H)，4.48(s，1H)，4.11-4.03(m，2H)，3.43(s，2H)，3.14(s，2H)，2.46(s，2H)，2.00(s，3H)，1.57(s，2H)，1.38(s，3H)，1.29(s，22H)，0.91-0.87(t，J＝6.0Hz，3H).

实施例65 制备Pro-Ala-Val-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4d)

按照实施例20的方法320mg(0.55mmol)Boc-Pro-Ala-Val-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得254mg(96％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：149-150℃；[α]_D ²⁵＝-105.7(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：482[M+H]⁺；IR(KBr)：3297，3192，3058，2922，2852，2611，2484，2361，1735，1683，1640，1554，1467，1403，1269，1214，1160，661cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.86(s，1H)，8.67(s，1H)，8.28(s，2H)，5.03(s，1H)，4.87(s，1H)，4.33-4.29(m，1H)，4.21-4.13(m，1H)，4.05-3.98(m，1H)，3.47(s，2H)，2.54(s，1H)，2.31-2.25(m，1H)，2.05-2.02(m，3H)，1.63-1.61(s，2H)，1.46(s，3H)，1.26(s，22H)，1.06-1.02(t，J＝7.2Hz，6H)，0.90-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例66 制备Pro-Ala-Leu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4e)

按照实施例20的方法330mg(0.55mmol)Boc-Pro-Ala-Leu-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得258mg(94％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：102-103℃；[α]_D ²⁵＝-65.6(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：496[M+H]⁺；IR(KBr)：3220，3051，2925，2856，2361，1744，1663，1550，1461，1385，1258，1195，1162，1043，970，668cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.88(s，1H)，8.92-8.17(m，2H)，5.12-4.83(m，1H)，4.30-4.14(m，2H)，3.93(s，1H)，3.49-3.44(m，1H)，2.64-2.50(m，1H)，2.04-1.90(m，4H)，1.62(s，3H)，1.51-1.44(m，2H)，1.27(s，24H)，0.99-0.82(m，9H).

实施例67 制备Pro-Ala-Ile-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4f)

按照实施例20的方法350mg(0.58mmol)Boc-Pro-Ala-Ile-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得282mg(97％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：143.3-144.0℃；[α]_D ²⁵＝-96.1(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：496[M+H]⁺；IR(KBr)：3291，3189，3059，2953，2922，2853，2571，2481，2365，1735，1642，1556，1465，1412，1259，1210，1157，953，718，678cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.90(s，1H)，8.64-8.50(d，J＝40.5Hz，2H)，8.18(s，1H)，5.09(s，1H)，4.86(s，1H)，4.31(s，1H)，4.21-4.13(m，1H)，4.01-3.95(m，1H)，3.45(s，1H)，2.55(s，1H)，2.01(s，4H)，1.63-1.56(m，2H)，1.44(s，4H)，1.27(s，24H)，1.02-0.85(m，9H).

实施例68 制备Pro-Ala-Pro-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4g)

按照实施例20的方法350mg(0.60mmol)Boc-Pro-Ala-Pro-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得272mg(94％)本实施例的目标化合物，为黄色固体粉末。Mp：92-93℃；[α]_D ²⁵＝-126.0(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：480[M+H]⁺；IR(KBr)：3204，3062，2924，2854，2646，2545，2434，2364，1742，1653，1558，1458，1352，1281，1179，1095，1047，927，721cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.68(s，1H)，8.23(m，1H)，8.18-8.16(m，1H)，4.67-4.65(m，2H)，4.52-4.48(m，1H)，4.15-4.00(m，2H)，3.73-3.68(m，1H)，3.62(s，1H)，3.50-3.46(m，2H)，2.47(s，1H)，2.23-2.16(m，1H)，2.04-1.93(m，6H)，1.61-1.57(m，2H)，1.43-1.41(d，J＝6.6Hz，3H)，1.24(s，22H)，0.89-0.84(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例69 制备Pro-Ala-Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4h)

按照实施例20的方法370mg(0.57mmol)Boc-Pro-Ala-Tyr-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得290mg(93％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：109-110℃；[α]_D ²⁵＝-35.2(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：546[M+H]⁺；IR(KBr)：3392，3327，3181，3038，2954，2917，2849，2756，2692，1739，1656，1558，1525，1445，1386，1350，1274，1213，1175，833，725，671，574，541，499cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.77-8.74(d，J＝7.5Hz，1H)，8.40-8.38(d，J＝7.5Hz，1H)，7.01-6.98(d，J＝8.1Hz，2H)，6.67-6.64(d，J＝8.4Hz，2H)，4.41-4.30(m，2H)，4.19-4.14(m，1H)，4.02-3.90(m，2H)，3.19-3.11(m，2H)，2.92-2.77(m，2H)，2.29-2.20(m，1H)，1.98-1.71(m，3H)，1.47(s，2H)，1.22(s，24H)，0.86-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例70 制备Pro-Ala-Trp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4i)

按照实施例20的方法370mg(0.55mmol)Boc-Pro-Ala-Trp-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得298mg(95％)本实施例的目标化合物，为黑色固体粉末。Mp：86-87℃；[α]_D ²⁵＝-31.2(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：569[M+H]⁺；IR(KBr)：3226，3055，2924，2854，2361，1738，1665，1547，1458，1349，1208，741cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.73(s，1H)，8.57(s，1H)，8.20(s，1H)，7.61-7.45(m，1H)，7.35-7.33(m，1H)，7.28-7.25(m，1H)，7.09-7.01(m，2H)，4.76(s，1H)，4.53(s，1H)，4.03(s，2H)，3.28(s，3H)，2.19(s，1H)，2.09-2.05(m，1H)，1.67-1.61(m，3H)，1.27(s，24H)，0.91-0.87(t，J＝6.3Hz，3H).

实施例71 制备Pro-Ala-Asp-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4j)

按照实施例20的方法250mg(0.36mmol)Boc-Pro-Ala-Asp-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得159mg(88％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：107-108℃；[α]_D ²⁵＝-61.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：498[M+H]⁺；IR(KBr)：3319，2921，2852，2365，1740，1653，1545，1461，1383，1270，1212，628cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.48(s，1H)，8.62(s，1H)，8.19-8.00(m，2H)，4.76-4.60(m，3H)，4.11(s，2H)，3.52(s，2H)，2.97-2.89(d，J＝24.3Hz，2H)，2.53(s，1H)，2.08-2.05(m，3H)，1.62(s，2H)，1.44(s，3H)，1.26(s，22H)，0.91-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例72 制备Pro-Ala-Glu-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4k)

按照实施例20的方法400mg(0.57mmol)Boc-Pro-Ala-Glu-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得245mg(85％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：100-102℃；[α]_D ²⁵＝-122.0(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：549[M+K]⁺；IR(KBr)：3291，3080，2921，2852，2744，2357，1741，1650，1554，1456，1387，1298，1252，1206cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝10.13-10.00(d，J＝41.1Hz，1H)，8.61(s，1H)，8.28-8.22(m，1H)，7.91(s，1H)，4.77-4.50(m，3H)，4.13-4.03(m，3H)，3.51(s，2H)，2.45(s，3H)，2.19(s，2H)，2.07-2.05(m，3H)，1.63(s，3H)，1.45(s，3H)，1.26(s，22H)，0.90-0.86(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例73 制备Pro-Ala-Arg-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4l)

按照实施例20的方法240mg(0.35mmol)Boc-Pro-Ala-Arg-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得147mg(80％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：114-115℃；[α]_D ²⁵＝-61.2(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：539[M+H]⁺；IR(KBr)：3163，3053，2925，2854，2357，1739，1661，1550，1457，1401，1252，1195，572cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝10.21-10.20(m，1H)，8.84-8.81(d，J＝6.9Hz，1H)，8.54-8.51(d，J＝7.2Hz，2H)，7.98(s，1H)，7.65-7.56(m，1H)，7.48-7.39(m，1H)，7.31-7.18(m，1H)，4.39-4.33(m，1H)，4.19-4.17(m，2H)，4.04-3.94(m，2H)，3.20-3.15(m，2H)，3.10(s，2H)，2.34-2.22(m，1H)，1.85(s，3H)，1.76-1.61(m，2H)，1.52(s，4H)，1.28-1.22(m，24H)，0.86-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例74 制备Pro-Ala-Ser-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4m)

按照实施例20的方法300mg(0.45mmol)Boc-Pro-Ala-Ser-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得178mg(％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：128-129℃；[α]_D ²⁵＝-63.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：470[M+H]⁺；IR(KBr)：3365，3334，2953，2921，2852，2736，1699，1740，1650，1551，1459，1395，1372，1276，1215，1154，1056，587cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝10.15(s，1H)，8.79-8.77(d，J＝7.2Hz，1H)，8.45-8.43(d，J＝7.5Hz，1H)，4.50-4.41(m，1H)，4.34-4.22(m，1H)，4.20-4.11(m，1H)，3.73-3.60(m，2H)，3.20-3.18(d，J＝6.0Hz，2H)，2.37-2.22(m，1H)，1.99-1.98(m，1H)，1.91-1.85(m，3H)，1.58-1.51(m，2H)，1.29-1.23(m，24H)，0.86-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例75 制备Pro-Ala-Thr-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4n)

按照实施例20的方法310mg(0.46mmol)Boc-Pro-Ala-Thr-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得190mg(83％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：93-94℃；[α]_D ²⁵＝-63.4(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：484[M+H]⁺；IR(KBr)：3221，3055，2925，2855，2361，1746，1671，1550，1459，1387，1308，1255，1205，1158，1102，1041cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.36-9.34(d，J＝7.5Hz，1H)，5.33-5.21(m，1H)，4.43-4.31(m，2H)，4.27-4.18(m，1H)，4.16-4.08(m，2H)，3.22-3.17(t，J＝6.6Hz，2H)，2.45-2.31(m，1H)，1.97-1.85(m，4H)，1.56-1.47(m，2H)，1.34-1.29(m，6H)，1.24(s，22H)，0.86-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例76 制备Pro-Ala-Lys-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4o)

按照实施例20的方法980mg(1.31mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得500mg(68％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：151-152℃；[α]_D ²⁵＝-32.3(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：511[M+H]⁺；IR(KBr)：3438，2925，2279，1742，1666，1552，1460，1389，1254，1030，727cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.77(s，1H)，9.08(s，1H)，8.61(s，1H)，8.10(s，1H)，4.67(s，1H)，4.47-4.41(m，1H)，4.07(s，2H)，3.59(s，1H)，3.43(s，1H)，3.08-2.97(m，1H)，2.56(s，1H)，2.07(s，4H)，1.85(s，4H)，1.62(s，4H)，1.45(s，5H)，1.26(s，24H)，0.90-0.86(t，J＝6.0Hz，3H).

实施例77 制备Pro-Ala-Met-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4p)

按照实施例20的方法330mg(0.53mmo1)Boc-Pro-Ala-Met-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得280mg(95％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：119-121℃；[α]_D ²⁵＝-47.8(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：514[M+H]⁺；IR(KBr)：3294，3058，2925，2855，2271，1743，1651，1552，1457，1383，1214，1037，959，718cm^-1.¹H-NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝4.38-4.31(m，1H)，4.21-4.17(m，1H)，4.03-3.99(m，2H)，3.55(s，3H)，3.49-3.42(m，1H)，3.19-3.18(m，2H)，2.51-2.49(m，3H)，2.30-2.27(m，1H)，2.03(s，1H)，1.94-1.85(m，4H)，1.54-1.52(m，2H)，1.23(s，25H)，0.87-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例78 制备Pro-Ala-Asn-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4q)

按照实施例20的方法200mg(0.33mmol)Boc-Pro-Ala-Asn-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得150mg(84％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：163-164℃；[α]_D ²⁵＝-57.7(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：497[M+H]⁺；IR(KBr)：3305，2920，2850，2250，1742，1674，1555，1458，1398，1327，1270，1195，1026，995，724cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝4.58-4.53(m，IH)，4.40-4.33(m，1H)，4.22-4.15(m，1H)，4.01-3.96(t，J＝6.3Hz，2H)，3.45(s，4H)，3.26-3.12(m，2H)，2.31-2.22(m，1H)，1.91-1.82(m，3H)，1.54-1.50(m，2H)，1.23(s，25H)，0.87-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例79 制备Pro-Ala-Gln-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4r)

按照实施例20的方法355mg(0.58mmol)Boc-Pro-Ala-Gln-OCH₂(CH₂)₁₂-CH₃制得300mg(94％)本实施例的目标化合物，为无色固体粉末。Mp：159-160℃；[α]_D ²⁵＝-70.1(c＝0.50，CH₃OH)；ESI-MS(m/e)：511[M+H]⁺；IR(KBr)：3419，2924，2848，2250，1737，1665，1545，1455，1218，1026，711cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝4.38-4.31(m，1H)，4.21-4.15(m，2H)，4.05-3.94(m，2H)，3.89(s，2H)，3.22-3.16(m，2H)，2.33-2.26(m，1H)，2.17-2.12(t，J＝7.8Hz，2H)，1.96-1.75(m，4H)，1.55-1.51(m，2H)，1.23(s，25H)，0.87-0.82(t，J＝6.6Hz，3H).

实验例1 4a-r的溶血栓活性

将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约1ml动脉血并装在1ml的EP管中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速***一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。

旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60mn，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于***大鼠颈动脉或静脉)，外径1mm，另一端的外部套一段长7mm，外径3.5mm的聚乙烯管(加粗，用于***中段的聚乙烯胶管内)。3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口***左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部***动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。

用头皮针将生理盐水(3ml/kg)，尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或不同浓度化合物的生理盐水溶液通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或本发明的化合物通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计并评价化合物的体内溶栓活性。结果表明，4a-r有优秀的体内溶栓活性(表1)。

表1 4a-r对大鼠血栓减重的影响^a

a)n＝10，尿激酶剂量为20000IU/kg，4a-r剂量为0.1nmol/kg；b)与生理盐水组比p＜0.01.

实验例2 4n静脉注射给药的溶血栓量效关系

用实验例1的方法，选取溶栓效果最好的4n考察0.1nmol/kg、0.01nmol/kg、0.001nmol/kg三种剂量下的溶栓活性。结果表明，4n的体内溶栓作用显示剂量依赖性(表2)。

表2 4n的剂量对大鼠血栓减重的影响^a

a)n＝10；b)与生理盐水、0.01nmol/kg及0.001nmol/kg组比p＜0.01；c)与生理盐水及0.001nmol/kg组比p＜0.01；d)与生理盐水组比p＜0.01.

实验例3 4a-r的体外溶血栓活性

1)血栓形成装置的制作

将内径4mm，外径5.5mm，长度18mm的一段玻璃管安放在一个塑料易拆卸底座上，玻璃管和塑料底座的接缝处用一段乳胶管密封。玻璃管中放置一不锈钢丝螺旋，螺旋直径1mm，长度20mm，包括一端的2mm长的挂钩，血液即凝固在不锈钢螺旋的周围，称重时可将血栓挂起，在孵育时可以将血栓挂在反应瓶的溶液中，不碰到四壁，以免损伤血栓。

2)反应瓶的制作

用带橡胶塞的10ml西林瓶，在橡胶塞上穿一根不锈钢丝，在瓶中的一端弯成钩，血栓挂在钩上，悬浮于瓶内待测化合物溶液中，不锈钢丝可以在橡胶塞上上下移动，调节血栓在溶液中的高度，使其刚好浸在待测溶液中。体内环境的模拟：按照大鼠平均体重估计每只大鼠有13ml血液，如果是大鼠体内血栓模型，可能约8ml的血液可接触到血栓，故反应瓶中加入8ml待测溶液，在37℃恒温摇床孵育。

3)血栓的制备

将350-400g雄性SD大鼠用20％乌拉坦(6ml/kg，i.p.)，麻醉，仰卧固定，分离右颈总动脉，动脉夹夹闭近心端，动脉夹上方***30mm长聚乙烯管，每次放出约3-4ml血，大约可放2-3次，用硅烷化的5ml注射器立即将放出的血液逐个注入制备血栓用的玻璃管中，马上将不锈钢螺旋放入。静置40min使血栓形成，之后将玻璃管小心从底座上取下，用细针将血栓四周和玻璃管内壁分开，取出血栓挂在反应瓶的橡胶塞上，反应瓶中加入8ml蒸馏水，将血栓悬挂在水中静置1小时，除掉血栓表面浮血。1小时后，用滤纸吸去血栓表面的水分，逐个精确称重。

4)测定4a-r体外溶栓活性：

在每个反应瓶中重新注入4a-r(1nM)的生理盐水溶液，以生理盐水作为空白对照，尿激酶(100IU/ml)作为阳性对照，再将血栓悬挂于待测化合物的溶液中，37℃恒温摇床70rpm孵育2小时。孵育结束后，用滤纸吸取表面水再逐个精确称重，计算血栓在加入待测溶液前后的重量差，统计评价化合物体外溶栓活性。结果表明，4a-r有优秀的体外溶栓活性(表3)。

表3 4a-r体外溶栓活性^a

a)n＝6，尿激酶浓度为100IU/mL，4a-r浓度为1nM；b)与生理盐水组比P＜0.01；c)与生理盐水组比P＜0.05；d)与生理盐水组比P＞0.05.

实验例4 浓度对4h体外溶血栓活性的影响

按照实验例3的实验方法，选取溶栓效果较好的4h考察1nM，0.1nM和0.01nM三个浓度下的溶栓活性。结果表明，4h的体外溶栓作用显示浓度依赖性(表4)。

表4 4h的浓度对体外溶栓活性的影响^a

a)n＝6；b)与生理盐水、0.1nM 4h及0.01nM 4h比p＜0.01；c)与生理盐水及0.01nM 4h比p＜0.01；d)与生理盐水组比p＜0.01.

实验例5 4a-r的纳米结构

1)水溶液中4a-r纳米球的粒径

在Nano-ZS90纳米粒度测定仪上测定4a-r在10^-5M的粒径。结果表明，4a-r在水溶液中可组装为纳米球，除4c，4q外，其余粒径均在122至526nm之间(表5)。

表5 4a-r在水溶液中组装的纳米球的粒径

2)4a-r的纳米球的形态

将4a-r配成浓度为1×10^-13mg/ml的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。测定表明，4a-r形成规则的纳米球。4k的透射电子显微镜照片作为代表，用图2描述。

Claims

1.具有溶血栓活性的通式为I的化合物：

Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃ 通式I

式中，AA选自甘氨酸残基、L-缬氨酸残基、L-色氨酸残基、L-亮氨酸残基、L-丙氨酸残基、L-蛋氨酸残基、L-酪氨酸残基、L-天冬酰胺残基、L-异亮氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、L-脯氨酸残基、L-丝氨酸残基、L-苏氨酸残基、L-谷氨酰胺残基、L-天冬氨酸残基、L-谷氨酸残基、L-精氨酸残基或L-赖氨酸残基其中之一。

2.制备权利要求1所述的通式I代表的溶血栓化合物的方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：

1)在二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺存在下Boc-Pro在无水四氢呋喃中与丙氨酸缩合为Boc-Pro-Ala；

2)在二环己基羰二亚胺和N-羟基苯并三氮唑存在下Boc-AA在无水四氢呋喃中与碳十四醇缩合为Boc-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃；

3)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃脱去Boc生成AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃；

4)在二环己基羰二亚胺和N-羟基苯并三氮唑存在下Boc-Pro-Ala在无水四氢呋喃中与AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃缩合为Boc-Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃；

5)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃脱除Boc生成Pro-Ala-AA-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃，即得。

3.权利要求1所述的化合物在制备溶血栓药物中的用途。