CN102787169A - 一种应用于检测线粒体 dna a1555g、c1494t 突变的混合液及试剂盒和检测*** - Google Patents
一种应用于检测线粒体 dna a1555g、c1494t 突变的混合液及试剂盒和检测*** Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液及试剂盒和检测***，是应用一对特异性引物、4条携带不同荧光基团的LNA探针在一个反应体系里多重实时检测线粒体DNA 1555位点、1494位点的野生型和突变型，该试剂盒包括人体基因组DNA提取试剂、引物和探针的混合液、PCR反应混合液、阴性对照DNA、阳性对照DNA。本发明提供了用本试剂盒可同时快速检测母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G、C1494T突变，该方法较单独的线粒体DNA A1555G、C1494T突变检测操作简单、快速、结果直观、准确可靠、特异性强、灵敏度高，利于推广和应用。
Description
技术领域：本发明涉及一种检测母系遗传性耳聋线粒体DNAA1555G和C1494T突变情况的试剂盒及其使用方法；特别是一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液及试剂盒和检测***。
背景技术：线粒体DNA（MitochondriaDNA，mtRNA）突变是引起感音神经性耳聋的重要原因之一，这些突变主要是位于线粒体12SrRNA、tRNA基因上，位于12SrRNA基因的同质性A1555G和C1494T突变与氨基糖苷类抗导致的非综合征型耳聋相关。
自1962年发现世界上首例线粒体疾病患者以来，人类已经发现了很多种由于线粒体功能障碍而导致的疾病。近十年来已经明确了几个与耳聋有关的线粒体突变。由于人类线粒体的唯一功能是通过氧化磷酸化参与人体化学能量的产生，因此线粒体突变干扰能量的产生进而导致全身神经肌肉功能障碍就不足为奇了，引起听力损害也只是它的特征之一。然而，令人惊奇的是遗传的线粒体突变被发现也是非综合征性耳聋的原因之一，获得性线粒体突变已被提出是老年性聋的原因之一。
氨基糖甙类抗生素耳毒性是后天获得性耳聋最常见的原因。不但大剂量、长时间的用药可引起耳蜗－前庭损害，有时小剂量的用药也可造成耳聋，提示存在遗传易感性的可能。Konigsmark等在1976年对大多数已发现的具氨基糖甙类耳毒性聋的家族的资料进行了总结，得出结论：对氨基糖甙类抗生素耳毒性易感性遗传可能是伴不完全外显率的常染色体显性遗传。同时，他们也注意到此遗传具非父系遗传特性，由此得出结论此遗传可能是多因素作用而产生的。1989年Higashi回顾了有关文献后提出，对所观察到的母系遗传最可能的解释是线粒体DNA缺陷。1993年，Prezant等报道了三个中国家系，数个成员在使用氨基糖甙类抗生素后发生耳毒性聋，三个家系中均证实有呈母系遗传的mtDNA 12SrRNA基因1555碱基A→G突变。随后，非洲、西班牙、日本、蒙古、南美、以色列也有家系报道。在中国、日本、蒙古还有一些散发病例的报道，这些散发病例无家族史，都有耳毒性聋和mtDNA 1555A→G突变。同一线粒体DNA突变和耳聋存在于核基因很不相同的遗传学背景更肯定了该突变的致病性。
线粒体DNA（mtDNA）12SrRNA是氨基糖甙类抗生素导致的非综合征型听力损失的主要突变热点区域。在这些突变位点中，位于12SrRNA高度保守的解码区的同质性 的A1555G和C1494T突变与耳聋相关，这两个突变导致很多患者的氨基糖甙类抗生素中毒性耳聋。A1555G突变和C1494T突变会在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12SrRNA在二级结构上与细菌的16SrRNA的相应区域的二级结构更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖甙类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。携带A1555G突变和C1494T突变的细胞的生化特征是线粒体蛋白质合成的异常并随之引起细胞的呼吸功能异常。而且当用含高浓度的巴龙霉素或新霉素的DMEM培养基来培养携带这两个突变的细胞系时，可以观察到这些细胞与对照细胞系相比会出现生长缺陷和线粒体内蛋白的翻译异常。这些观察为以下结论提供了直接的遗传和生化方面的证据，即A1555G突变和C1494T突变是导致氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋的致病性的mtDNA突变。
自1993年以来，国内外检测线粒体DNA A1555G和C1494T突变的方法，有PCR直接测序、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术、单位点荧光染料PCR进行测定；测序很难做到临床推广；酶切技术虽然成本低，但是临床操作较麻烦且很难做到防止污染，因为其技术在PCR扩增结束后要再次开盖进行后续的酶切和跑胶；还有以生物芯片技术检测该突变的技术，生物芯片试剂盒是为快速、高通量筛查已知遗传突变位点专门设计的，但生物芯片试剂盒检测涉及特殊仪器及大批数据处理分析对实验室设备、环境和操作人员要求较高，且费用昂贵，难以在一般医院或实验室推广使用；荧光染料PCR法检测，只能检测一个突变位点；还有高分辨率溶解曲线法，用溶解曲线检测的特异性很难做到保证，且要求软件分析程序复杂，需专人操作；因此迫切需要一种可以在很多医院现有设备上即能检测，并操作简便、快速、准确性高、特异性强的母系遗传性耳聋线粒体DNA突变检测方法及试剂盒，以满足对线粒体DNA A1555G和C1494T突变进行广泛筛查的需要。
发明内容：本发明是要提供一种荧光探针PCR检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的方法及试剂盒；其做到了仅用两条引物和四条LNA探针，应用多重荧光探针PCR在一个反应体系里同时检测出两个突变位点的突变情况，避免了荧光发光基团的荧光信号相互干扰；检测时间短，直接用提取好的模版检测一般用时1个小时即可一管出两个位点的结果，不需要后期开盖，可在扩增过程中直接读取位点的突变情况。
本发明的技术方案之一：
一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液包括引物F1、R1和四条探针N1、N2、M1、M2的混合液；
第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物；
四条探针分别为以人体线粒体DNA为模板在线粒体DNA A1555位点设计的野生型探针一条和突变型探针一条，另在线粒体DNA C1494位点处设计的野生型探针一条和突变型探针一条。
优选：所述一对引物是依据已公开的人类线粒体DNA序列设计的；第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1445-1465bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1；第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1589-1608bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:2，也包括这两条引物的互补链。
四条探针之间不能存在相互干扰四条探针的四种荧光发光猝灭基团不能相互抑制或抵消，以便发出四种不同波长的荧光信号能区分两个位点的四种表现。
所述四条探针是包括应用TaqMan-LNA、TaqMan-MGB、TaqMan-AllGlo技术标记设计的探针。
第一条探针N1的序列，在线粒体DNA C1494T的突变型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1484-1497bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3；第二条探针N2的序列，在线粒体DNA 1494的野生型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1483-1498bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:4；第三条探针M1的序列，在线粒体DNA A1555G的突变型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1563bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:5；第四条探针M2的序列，在线粒体DNA 1555的野生型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1562bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:6。
所述四条探针采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针,采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针分别带有以下发光猝灭荧光基团及LNA碱基；第一条探针N1为线粒体DNA C1494T的突变型LNA探针，其5′末端标记的是CY5荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第二条探针N2为线粒体DNA 1494的野生型LNA探针，其5′末端标记的是ROX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第三条探针M1为线粒体DNAA1555G的突变型LNA探针，其5′末端标记的是HEX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA 碱基；第四条探针M2为线粒体DNA 1555的野生型LNA探针，其5′末端标记的是FAM荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基。
各引物是：
引物F1：5′GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3′；
引物R1：5′CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3′；
探针的具体序列：
探针N1：5′CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC–BHQ13′，+为LNA碱基；
探针N2：5′ROX-CCGCCCGTCACCCTCC–BHQ13′；
探针M1：5′HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT–BHQ13′，+为LNA碱基；
探针M2：5′FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT–BHQ13′，+为LNA碱基。
本发明的技术方案之二：
一种试剂盒包含以上所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，还包括提取基因组DNA试剂、一管阴性对照DNA、一管阳性对照DNA和PCR反应混合液。
优选：它包括：
（1）提取人体基因组DNA试剂；
（2）引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2的混合液；
（3）一管阴性对照DNA；一管同时携带线粒体A1555G和C1494T突变位点的阳性对照DNA；
（4）PCR反应混合液包括：Tag DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR缓冲液、dNTP和ddH2O。
本发明的技术方案之三：
一种使用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的检测***包括能够检测四色荧光的荧光探针PCR仪和PCR管；所述PCR管中装有权利要求1-6所述的混合液、PCR反应混合液。
优选：引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2是在线粒体DNA设计一对引物，在线粒体DNA 1555位点设计野生型探针M2一条和突变型探针M1一条，另在线粒体DNA1494位点处设计野生型探针N2一条和突变型探针N1一条，以人体线粒体DNA为模板，在一个反应体系里应用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNA A1555G、C1494T的突变。
本发明的技术方案之四：
检测***的检测方法为：将提取好的人体DNA模板、引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2的混合液、PCR反应混合液等一起加入一个PCR管里，再分别设立阳性对照组和阴性对照组，应用能以检测四色荧光的多重实时荧光探针PCR仪，设置好反应条件，即根据不同波长的荧光信号得到线粒体DNA1555和1494位点的突变情况。
优选：PCR扩增一段靶序列即用实时荧光探针PCR检测此靶序列中的两个或多个位点的单核苷酸多态性SNP，即利用一对引物和四条或多条荧光探针同时实时检测两个或多个突变位点；在利用这一对上下游引物在扩增延伸过程中，利用taq DNA聚合酶的5‘-3’外切酶活性分别对与其靶序列相结合的探针降解，即一次循环上游引物延伸时能检测到一条探针的荧光信号，下游引物延伸时也能检测到一条探针的荧光信号，以便一个反应管里发出四种不同波长的荧光信号能区分两个位点的四种表现。
本发明具有以下特点：
（1）本发明的试剂盒中所用的引物和探针均经过大量实验仔细设计，做到了仅用两条引物和四条LNA探针，应用多重荧光探针PCR在一个反应体系里同时检测出两个突变位点的突变情况，经过严格试验调试避免了荧光发光基团的荧光信号相互干扰。
（2）理论上，样本基因组DNA经一次PCR反应，即在反应体系中仅加入了针对突变型位点（A1555G、C1494T）的探针NI、MI就可检测出突变位点，但同时我们还使用了野生型位点（1555、1494）的探针N2、M2，对未突变的位点进行验证结果，同时确认了此位点的突变情况。也就是说，同一个样本基因组DNA同一个位点经过突变型和野生型两个探针同时验证，从而使结果更加准确、可信。
（3）本发明检测突变位点应用荧光探针检测有其他方法无可比拟的优势，检测时间短，直接用提取好的模版检测一般用时1个小时即可一管出两个位点的结果，不需要后期开盖，可在扩增过程中直接读取位点的突变情况。
（4）应用本发明检测线粒体DNA A1555G/C1494T突变位点比测序法、限制性酶切法、溶解曲线法等，灵敏度高、特异性好、准确性高、线性稳定、可控污染性低、操作流程简单、结果判定直观；现在一般医院都有实时荧光定量PCR仪，无需再另置设备即可实现全面推广；所以本试剂盒可适合一般医院、分子生物学实验室推广，便于在全国范围内施行母系遗传药物耳聋线粒体DNAA155G、C1494T突变的大规模筛查和预防性检查，从而可有效减少氨基糖甙类抗生素敏感人群发生药物性耳聋机会。
附图说明
图1是携带线粒体DNAA1555G突变型的样本PCR扩增曲线图。
图2是线粒体DNA 1555野生型的样本PCR扩增曲线图。
图3是携带线粒体DNAC1494T突变型的样本PCR扩增曲线图。
图4是线粒体DNA 1494野生型的样本PCR扩增曲线图。
具体实施方式
以下是结合实例说明本发明线粒体DNA1555、1494位点突变四色实时荧光PCR检测方法和试剂盒，以使使用者更好的理解本发明在实际应用中的特点。
1、引物和探针设计
应用Primer5.0软件协助设计引物和探针，以已公开的人类线粒体DNA（12SrRNA）参考序列（NCBI数据库序列NC 01920）为模板，进行引物和探针设计，设计方案如下：
（1）针对线粒体DNA 1555和1494两个位点放在一对引物之间进行有效扩增，上游引物F1的3′末端要在位点1494以前，下游引物R1的3′末端要在位点1555以后；
上游引物F1：5′GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3′（SEQ ID NO:1），长21bp，位于线粒体DNA核酸序列1445-1465bp之间。
下游引物R1：5′CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3′（SEQ ID NO:2），长20bp，是位于线粒体DNA核酸序列1589-1608bp之间的反义链。
（2）针对线粒体DNAC1494T位点突变型和野生型设计两条和上游引物同向的探针，并在其5′末端分别标记不同的荧光发光基团、3′末端BHQ1猝灭基团和中间加上LNA碱基；
线粒体DNA C1494T突变型探针N1：5′CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC–BHQ13′（SEQ ID NO:3），长14bp，位于线粒体DNA核酸序列1484-1497bp之间，+为LNA碱基。
线粒体DNA 1494野生型探针N2：5′ROX-CCGCCCGTCACCCTCC–BHQ13′（SEQ ID NO:4），长16bp，位于线粒体DNA核酸序列1483-1498bp之间。
（3）针对线粒体DNAA1555G位点突变型和野生型设计两条和上游引物同向的探针，并在其5′末端分别标记不同的荧光发光基团、3′末端BHQ1猝灭基团和中间加上LNA碱基；
线粒体DNAA1555G突变型探针M1：5′HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT–BHQ13′（SEQ IDNO:5），长16bp，位于线粒体DNA核酸序列1548-1563bp之间，+为LNA碱基。
线粒体DNA 1555野生型探针M2：5′FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT–BHQ13′（SEQ ID NO:6），长15bp，位于线粒体DNA核酸序列1548-1562bp之间，+为LNA碱基。
2、线粒体DNAA1555G、C1494T位点突变四色实时荧光PCR检测试剂盒的组成（50人份/盒）：
（1）提取基因组DNA试剂：
（2）引物（F1、R1）和探针（N1、N2、M1、M2）的混合液：
（3）1管阴性对照DNA，浓度20ng/ul，100ul；1管阳性对照DNA，浓度20ng/ul，100ul；
（4）PCR反应混合液包括：TagDNA聚合酶、MgCl2、10×PCR缓冲液、dNTP和ddH2O。
3、检测样本
选择携带线粒体DNAA1555G突变的母系遗传药物性耳聋患者5个和携带线粒体DNA C1494T突变的母系遗传药物性耳聋患者3个作为受检者，再选择5个正常人作为受检者，共计受检人数13人。
4、基因组DNA提取
分别抽取13个受检者的静脉抗凝全血0.5-5ml，各取0.5ml抗凝全血到1.5mlEP管中，分别加入1000ml红细胞裂解液（20mmol/L Tris-HCL，pH7.6）室温静置5分钟，充***解红细胞，12000rpm离心1分钟，收集白细胞沉淀；再向此EP管中加入700ul的红细胞裂解液和5ul的蛋白酶K溶液，充分混合均匀，65℃水浴消化15分钟，待消化液降至室温，加入250ul预冷的醋酸钾溶液，充分混合均匀，此时可见明显的蛋白沉淀，12000rpm低温离心10分钟，取上清约800ul置另一干净的1.5ml的EP管中，再加入700ul异丙醇，上下颠倒混合10次混匀，静置10分钟沉淀DNA，12000rpm离心5分钟，小心弃去上清，加750ul75%乙醇洗涤DNA，12000rpm离心2分钟，弃去上清，重复洗涤一次；开盖挥发干燥5分钟，用TE缓冲液溶解后-20℃保存备用。
5、提取好的样本DNA用可检测四色波长的多通道实时荧光PCR仪扩增检测；
将上述设计好的一对引物和四条探针序列，通过人工合成并标记（委托生物公司），以上述提取好的样本DNA为模板，加入引物（F1、R1）和探针（N1、N2、M1、M2）的混合液、PCR反应混合液；再同时设立阳性对照DNA组、阴性对照DNA组、无模板对照组。
表1一个PCR扩增反应体系
| 10ng 模版DNA |
| 350-500nM 每种引物 |
| 200-300nM 每种探针 |
| 200uM dNTP |
| 3mM MgCL2 |
| 2.00-3.00U TaqDNA聚合酶 |
| 5ul 10×PCR缓冲液 |
| 加d dH2O到20ul |
设备仪器：应用罗氏light cycler 480荧光PCR仪检测；
循环条件：95℃预变性10min；接着95℃变性10s，58℃退火延伸45s（采集信号），40次循环。
等位基因分析的数据处理，如图1-4显示了4种结果，
图1所示：一个线粒体DNAA1555G突变型受检者，显示一个位点A1555G的突变型而不是野生型的探针信号被检测到；
图2所示：一个1555野生型受检者显示1555野生型探针的荧光信号；
图3所示：显示一个位点C1494T的突变型而不是野生型的探针信号被检测到。
图4所示：一个1494野生型受检者显示1494野生型探针的荧光信号。
6、结果判定
13名受检者，5名为线粒体DNAA1555G突变型患者，3名为线粒体DNAC1494T突变型患者，5名为线粒体DNA 1555和1494野生型个体。
7、结果验证
将所选的受检者全部用测序法对线粒体DNA（12S rRNA）进行直接测序分析，测序结果与线粒体DNAA1555G、C1494T位点突变四色实时荧光PCR检测试剂盒的检测结果完全吻合，说明本试剂盒使用的方法完全可用于线粒体DNAA1555G和C1495T突变检测。
检测结果表2
| 受检者编号 | 是否耳聋患者 | 本试剂盒法检测 | 测序法检测 |
| S001 | 是 | A1555G阳性 | A1555G阳性 |
| S002 | 是 | A1555G阳性 | A1555G阳性 |
[0085]
| S003 | 是 | A1555G阳性 | A1555G阳性 |
| S004 | 是 | A1555G阳性 | A1555G阳性 |
| S005 | 是 | A1555G阳性 | A1555G阳性 |
| S006 | 是 | C1494T阳性 | C1494T阳性 |
| S007 | 是 | C1494T阳性 | C1494T阳性 |
| S008 | 是 | C1494T阳性 | C1494T阳性 |
| S009 | 不是 | 1555、1494阴性 | 1555、1494阴性 |
| S010 | 不是 | 1555、1494阴性 | 1555、1494阴性 |
| S011 | 不是 | 1555、1494阴性 | 1555、1494阴性 |
| S012 | 不是 | 1555、1494阴性 | 1555、1494阴性 |
| S013 | 不是 | 1555、1494阴性 | 1555、1494阴性 |
序列表
〈110〉郭丽敏
〈120〉一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液及试剂盒和检测***
〈160〉
〈170〉
〈210〉1
〈211〉21
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉1
GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC
〈210〉2
〈211〉20
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉2
CACTCTGGTTCGTCCAAGTG
〈210〉3
〈211〉14
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉3
CGCCCGTCACTCTC
〈210〉4
〈211〉16
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉4
CCGCCCGTCACCCTCC
〈210〉5
〈211〉16
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉5
ACGACTTGCCTCCTCT
〈210〉6
〈211〉15
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉6
CGACTTGTCTCCTCT。
Claims (13)
1.一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述混合液包括引物F1、R1和四条探针N1、N2、M1、M2的混合液；
第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物；
四条探针分别为以人体线粒体DNA为模板在线粒体DNA A1555位点设计的野生型探针一条和突变型探针一条，另在线粒体DNA C1494位点处设计的野生型探针一条和突变型探针一条。
2.如权利要求1所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述一对引物是依据已公开的人类线粒体DNA序列设计的；第一条引物序列F1是有意义链，为上游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1445-1465bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1；第二条引物序列R1是反义链，为下游通用引物，位于线粒体DNA的核苷酸序列1589-1608bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:2，也包括这两条引物的互补链。
3.如权利要求1或2所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于四条探针之间不能存在相互干扰四条探针的四种荧光发光猝灭基团不能相互抑制或抵消，以便发出四种不同波长的荧光信号能区分两个位点的四种表现。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述四条探针是包括应用TaqMan-LNA、TaqMan-MGB、TaqMan-AllGlo技术标记设计的探针。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于第一条探针N1的序列，在线粒体DNA C1494T的突变型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1484-1497bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3；第二条探针N2的序列，在线粒体DNA 1494的野生型位点附近设计，是有意义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1483-1498bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:4；第三条探针M1的序列，在线粒体DNAA1555G的突变型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1563bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:5；第四条探针M2的序列，在线粒体DNA 1555的野生型位点附近设计，是反义链，也包括其互补链，位于线粒体DNA的核苷酸序列1548-1562bp之间，其序列为序列表中的SEQ ID NO:6。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种应用于检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于所述四条探针采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针,采用TaqMan-LNA技术标记设计的探针分别带有以下发光猝灭荧光基团及LNA碱基；第一条探针N1为线粒体DNA C1494T的突变型LNA探针，其5′末端标记的是CY5荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第二条探针N2为线粒体DNA1494的野生型LNA探针，其5′末端标记的是ROX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第三条探针M1为线粒体DNAA1555G的突变型LNA探针，其5′末端标记的是HEX荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基；第四条探针M2为线粒体DNA 1555的野生型LNA探针，其5′末端标记的是FAM荧光报告基团，3′末端标记的是BHQ1荧光猝灭基团，加LNA碱基。
7.如权利要求1-6任一项所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，其特征在于；
各引物是：
引物F1：5′GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC 3′；
引物R1：5′CACTCTGGTTCGTCCAAGTG 3′；
探针的具体序列：
探针N1：5′CY5-CGCC+C+GTCA+CTCTC–BHQ13′，+为LNA碱基；
探针N2：5′ROX-CCGCCCGTCACCCTCC–BHQ13′；
探针M1：5′HEX-ACGACTTGCCT+C+CT+CT–BHQ13′，+为LNA碱基；
探针M2：5′FAM-CGA+CTTGTCT+C+CT+CT–BHQ13′，+为LNA碱基。
8.一种试剂盒，其特征在于包含如权利要求1-7任一项所述的一种应用于检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的混合液，还包括提取基因组DNA试剂、一管阴性对照DNA、一管阳性对照DNA和PCR反应混合液。
9.如权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于它包括：
（1）提取人体基因组DNA试剂；
（2）引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2的混合液；
（3）一管阴性对照DNA；一管同时携带线粒体A1555G和C1494T突变位点的阳性对照DNA；
（4）PCR反应混合液包括：Tag DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR缓冲液、dNTP和ddH2O。
10.一种使用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的检测***，其特征在于包括能够检测四色荧光的荧光探针PCR仪和PCR管；所述PCR管中装有权利要求1-6所述的混合液、PCR反应混合液。
11.根据权利要求10所述的一种使用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的检测***，其特征是：引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2是在线粒体DNA设计一对引物，在线粒体DNA 1555位点设计野生型探针M2一条和突变型探针M1一条，另在线粒体DNA 1494位点处设计野生型探针N2一条和突变型探针N1一条，以人体线粒体DNA为模板，在一个反应体系里应用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNAA1555G、C1494T的突变。
12.如权利要求10或11所述的一种使用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNA A1555G、C1494T突变的检测***，其特征在于检测***的检测方法为：将提取好的人体DNA模板、引物F1、R1和探针N1、N2、M1、M2的混合液、PCR反应混合液等一起加入一个PCR管里，再分别设立阳性对照组和阴性对照组，应用能以检测四色荧光的多重实时荧光探针PCR仪，设置好反应条件，即根据不同波长的荧光信号得到线粒体DNA 1555和1494位点的突变情况。
13.如权利要求12所述的一种使用多重实时荧光探针PCR检测线粒体DNAA1555G、C1494T突变的检测***，其特征在于检测***的检测方法为：PCR扩增一段靶序列即用实时荧光探针PCR检测此靶序列中的两个或多个位点的单核苷酸多态性SNP，即利用一对引物和四条或多条荧光探针同时实时检测两个或多个突变位点；在利用这一对上下游引物在扩增延伸过程中，利用taq DNA聚合酶的5‘-3’外切酶活性分别对与其靶序列相结合的探针降解，即一次循环上游引物延伸时能检测到一条探针的荧光信号，下游引物延伸时也能检测到一条探针的荧光信号，以便一个反应管里发出四种不同波长的荧光信号能区分两个位点的四种表现。
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