CN106282394A - 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒 - Google Patents

高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高通量检测玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25分型的方法及其试剂盒。具体来说，本发明涉及用于高通量检测玉米南方锈病抗性材料的SNP分子标记物，其鉴定方法，用于检测这些SNP分析标记物的方法，引物组以及试剂盒。

Description

高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及玉米南方锈病抗性的分子鉴定，特别是涉及用于玉米南方锈病抗性分子鉴定的分子标记的高通量检测。
背景技术
玉米南方锈病是一种毁灭性的气流传播的玉米病害，主要由多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw.)引起。玉米南方锈病主要发生在热带与亚热带地区，近年来在温带地区也时有发生。病害暴发时，玉米叶片被病菌橙黄色的孢子所覆盖，导致叶片很快干枯死亡，对玉米生产造成很大的损失，严重时甚至绝收。采用先进的分子育种手段，充分利用玉米资源库中的抗性资源，进行抗病育种和抗病性改良是控制玉米南方锈病最经济有效的途径。
研究表明，在玉米10号染色体短臂上，存在一个抗南方锈病的主效基因簇。这个抗南方锈病的主效基因簇包括来源于对南方锈病免疫自交系P25的抗病主效基因RppP25。基因定位结果表明抗南方锈病基因RppP25位于标记P091与M271之间的40kb区间内。
因此，亟待开发适合高通量检测与玉米南方锈病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与玉米南方锈病抗性相关的分子标记物的试剂盒和方法。
发明内容
本发明根据包含抗玉米南方锈病基因位RppP25的抗南方锈病主效基因簇位点在中国玉米种质资源中的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)信息，获得适合高通量检测玉米抗南方锈病主效基因簇位点多态性的SNP作为分子标记物，并且设计出了用于检测所获得的SNP的标记引物，以及相应的检测分型方法，可以用于玉米南方锈病抗性的分子诊断与分子标记辅助遗传改良。
一方面，本发明提供了适合高通量检测玉米南方锈病抗性的玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自表3中所列的如下SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869，以玉米参考基因组B73V3版本染色体10为准，所述A003135对应的位置为3,020,570，等位位点1为T，等位位点2为C；A003857对应的位置为2,437,710，等位位点1为A，等位位点2为G；A003858对应的位置为2,450,914，等位位点1为C，等位位点2为T；A003859对应的位置为2,469,304，等位位点1为A，等位位点2为C；A003864对应的位置为4,002,339，等位位点1为A，等位位点2为G；A003865对应的位置为4,652,445，等位位点1为T，等位位点2为C；A003866对应的位置为4,668,571，等位位点1为A，等位位点2为G；A003869对应的位置为4,696,425，等位位点1为G，等位位点2为T。
SNP位点等位基因型分型有三种：等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，等位基因1和等位基因2杂合型。
另一方面，本发明提供了用于早期高通量检测玉米穗轴颜色的方法，所述方法包括从待检测的玉米品种获得的核酸样品中鉴定至少一种选自表3中所列的如下SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。
本领域技术人员可以根据已知序列的具体SNP位点选择鉴定方法，所述方法例如可以是：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增。具体的鉴定试剂可以选自例如等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，本发明中的鉴定试剂包括等位基因特异性引物。所述特异性引物可以是选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ IDNO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQID NO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQID NO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQID NO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ IDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQID NO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ IDNO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ IDNO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ IDNO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
另外，在已知玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位点的特定SNP标记物的前提下，采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪些特异性引物组。本领域技术人员根据表3中所列的如下SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869可以设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了上述SNP标记物这个前提，因此都在本发明的保护范围内。
另一方面，本发明提供了选自表3中的如下SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869的一种或者多种在高通量检测玉米南方锈病抗性中的应用。
另一方面，本发明提供了筛选玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位点与玉米南方锈病抗性相关的SNP分子标记物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)选择玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)区段附近的SNP；(2)根据所选择的SNP，基于LGC公司的KASP Master Mix试剂盒设计对应于每个SNP的KASP引物组；(3)以玉米基因组DNA作为模板，利用步骤(2)设计的KASP引物组进行PCR扩增；(4)对经PCR扩增后的SNP位点进行基因分型，寻找基因分型成功的SNP标记物；以及(5)将基因分型成功的SNP标记物与有统计学意义的数量的已知玉米南方锈病抗病表型的样品进行对比，进行T-TEST计算，选择差异达到显著水平的P<0.05的SNP分子标记物作为与玉米南方锈病抗性相关的SNP分子标记物。
优选地，所述与玉米南方锈病抗性相关的SNP分子标记物为选自表3中的玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位点的如下SNP标记物的一种或者多种：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。
另一方面，本发明提供了用于鉴定选自表3中的如下SNP标记物的等位基因特异性引物组：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。
所述等位基因特异性引物组可以是根据LGC公司的KASP Master Mix试剂盒设计的KASP引物组，例如，可以是选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ IDNO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQID NO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQID NO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQID NO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ IDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQID NO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ IDNO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ IDNO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ IDNO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
另外，在已知玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位点的特定SNP标记物的前提下，采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪些特异性引物组。本领域技术人员根据表3中所列的如下SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869可以设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了上述SNP标记物这个前提，因此都在本发明的保护范围内。
另一方面，本发明提供了用于鉴定选自表3中的如下SNP标记物的试剂盒：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。，所述试剂盒包含选自如下的试剂：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，所述试剂盒包含等位基因特异性引物组。进一步优选地，所述等位基因特异性引物组为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ IDNO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQID NO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQID NO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQID NO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ IDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQID NO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ IDNO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ IDNO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ IDNO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
本领域技术人员能够根据具体的SNP标记物设计其它适于本发明用于检测本发明的SNP标记物的等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针，只要等位基因特异性寡核苷酸、DNA探针和RNA探针能够与所述SNP标记物进行等位基因特异性杂交。
优选地，所述试剂固定在基质上。进一步优选地，所述试剂排列在阵列上。
另一方面，本发明提供了用于鉴定表3中的一种或者多种如下SNP标记物的试剂在早期鉴定玉米穗轴颜色中的应用：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。
优选地，用于鉴定用于鉴定表3中的一种或者多种如下SNP标记物的试剂选自：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，所述等位基因特异性引物为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ IDNO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQID NO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQID NO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQID NO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ IDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQID NO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ IDNO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ IDNO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ IDNO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术术语，具有与本发明所属技术领域的普通专业人员通常理解的相同的意义。
“SNP”，即“单核苷酸多态性”是指基因组中单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。
“等位基因”是指位于一对同源染色体的给定基因座位置上的一对基因。SNP等位基因就是表征所述SNP的两个核苷酸。
“等位基因特异性寡核苷酸”是指与包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸杂交的寡核苷酸。
“等位基因特异性杂交”是指当等位基因特异性寡核苷酸与其靶核酸杂交时，所述等位基因特异性寡核苷酸与包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸特异性碱基配对。
“等位基因特异性引物”是指能用于扩增包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸的特异性引物。
本发明所鉴定的SNP分子标记物、用于检测所述SNP分子标记物的引物以及相应的检测分型方法具有通量高，成本低，准确率高的特点，为分子标记法辅助选择不同玉米南方锈病抗病的玉米后代提供了新的技术手段，可以用于玉米南方锈病抗病的分子鉴定。
附图说明
图1显示了KASP法检测样品中成功分型的各基因型点簇分布图。
图2显示了玉米染色体10上根据本发明鉴定的8个SNP标记物与玉米南方锈病抗病主效基因RppP25的物理连锁关系(B73参考基因组V3版本)。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1玉米南方锈病抗病主效基因RppP25(RppP25基因)位点的SNP分子标记物的选择
RppP25基因位于玉米染色体10的3,130,061至3,133,063区段内(参考玉米基因组B73V3版本的位置)，从中玉金标记玉米56K SNP芯片上，在2,100,671和4,992,947区间内选择8个SNP位点进行标记物开发，见表1。
表1与RppP25基因相连锁的SNP位点信息
(染色***置为玉米参考基因组B73V3版本位置)
位点名称 染色体号 染色***置(V3) 等位位点1 等位位点2
SYN17244 10 3,020,570 T C
SYN17617 10 2,437,710 A G
PZE-110002424 10 2,450,914 C T
PZE-110002524 10 2,469,304 A G
PZE-110004402 10 4,002,339 A G
SYN4482 10 4,652,445 T C
SYN4502 10 4,668,571 A G
SYN4481 10 4,696,425 G T
根据市售获得的LGC公司的KASP Master Mix检测试剂盒，采用Primer3引物设计软件进行引物设计，设计结果见表2，共设计了8个KASP标记物引物组，每个标记物引物组包含特异引物1、特异引物2和通用引物，其中特异引物1和特异引物2的5’端分别连接了Allele-1tail和Allele-2tail。Allele-1tail和Allele-2tail这两条加尾序列分别标记了FAM和HEX荧光基团，具体序列显示如下：
Allele-1tail：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
Allele-2tail：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT
表2标记物引物组设计
实施例2高通量检测玉米南方锈病抗病主效基因RppP25位点的SNP分子标记物
采用实施例1设计的8个KASP引物组，以玉米基因组DNA作为模板，经PCR扩增后对SNP位点进行分析。
1.提取样品基因组DNA：
按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)，并按照试剂盒说明书提取供试玉米样品基因组DNA，具体步骤如下：
(1)在液氮中研磨100mg新鲜或20℃冷冻的样品材料；
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预装有700μl，65℃预热的缓冲液GP1的离心管中，所述缓冲液GP1中含有终浓度为0.1wt％的巯基乙醇，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；注：若提取富含多酌或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿(1:1)进行等体积抽提；
(4)小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μl的缓冲液GP2，充分混匀；
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
(6)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
(7)向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液；
(8)重复步骤(7)；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50-200μl洗脱缓冲液TE(pH值在7.0-8.5之间)，室温放置2-5min。12000rpm离心2min收集DNA溶液；以及
(11)用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
2.PCR扩增：
以步骤1制得的基因组DNA为模板，DNA稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；PCR整个过程在Douglas Scenfitic Array Tape平台上完成；在Nexar工作站上将DNA和PCR mix加入384PCR反应Array Tape中；在Soellex水浴中完成PCR反应；在Araya上完成检测荧光强度，读取数据；在Intellics管理***中完成程序设定和数据分析；引物的核苷酸序列如表2所示。
PCR反应体系为3μl，组分如下：
PCR扩增反应条件为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应，94℃预变性20秒，65℃-55℃60秒，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应，94℃预变性20秒，55℃60秒，35个循环。
在Araya荧光阅读仪上读取荧光信号。数据读取使用Douglas Scenfitic公司Intellics软件进行。结果分析使用Douglas Scenfitic公司Intellics软件进行。
3.基因分型
SNP位点等位基因型分型有三种：等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，等位基因1和等位基因2杂合型。如上述2所述，对PCR扩增反应获得的结果进行分析。参见图1，SNP位点等位基因1纯合型(簇1)、SNP位点等位基因2纯合型(簇2)、等位基因1和等位基因2杂合型(簇3)，分别组成分型明确的三个群，阴性对照(簇4)没有明显扩增，这样的基因型点簇分布图对应基因分型成功的标记物，8个标记物均为基因分型成功的标记物(参见表3)。
表3分型结果
标记物名称 位点名称 分型结果
A003135 SYN17244 成功
A003857 SYN17617 成功
A003858 PZE-110002424 成功
A003859 PZE-110002524 成功
A003864 PZE-110004402 成功
A003865 SYN4482 成功
A003866 SYN4502 成功
A003869 SYN4481 成功
4.基因型与表型的关联
按照表4对上述分型成功的8个标记物的三种等位基因分型(等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，等位基因1和等位基因2杂合型)分别赋予数字2，0和1。
表4标记物基因型数字化
参见表5，对88份已知表型样品的玉米南方锈病表型与基因型进行对比，在表型分组之间对标记物结果进行T-TEST计算，P<0.05说明两组间差异达到显著水平，分别计算了高抗&抗病/高感&感病和高抗/高感表型和基因型的P值，P值<0.05的标记物作为可用标记物。参见表6，表4所示的8个标记物的P值均小于0.05，因此均可以用来区分玉米高抗&抗病/高感&感病和高抗/高感(参见表表5、表6与图2)。图2显示了玉米染色体10上玉米南方锈病表型与基因型成功关联的8个标记物与玉米南方锈病抗病主效基因RppP25的物理连锁关系(基因组位V3)。8个标记物分布在GRMZM2G060884两侧1.6M范围之内(图2)。
表6基因型和玉米南方锈病表型的关联性
表5表型数据和基因型数据对比
注：“0”、“1”和“2”是根据附表1基因型数字化后的结果，“\”是表示没有检测或失败没有分型结果，“HR”、“R”、“S”和“HS”分别表示玉米南方锈病高抗、抗、感和高感表型。
序列表
<110> 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司
<120> 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒
<130> PM2089YJ66CN
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgaggacgag gacgacgcg 39
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tggaggacga ggacgacgca 40
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcacatgtc agcctcaaga cc 22
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgggcgtcaa gtgcgatctc t 41
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tggcgtcaag tgcgatctcc 40
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgctcctcac aggatacatg aagaat 26
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgactaatag ctgcatacca ctcag 45
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat ttagactaat agctgcatac cactcaa 47
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gagaccctat tactcgtatt gttggca 27
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tgatgacagc agctagcagt gaaaa 45
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tatgacagca gctagcagtg aaag 44
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cagagctaag tgagacagtg agagt 25
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tacagtgata tctgcagaag ctatgt 46
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcagtgatat ctgcagaagc tatgc 45
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttttgtggtc ctcaccttct ttctctt 27
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc tcaatgggga aagctggatc aac 43
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tgcaatgggg aaagctggat caat 44
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gttttgcacg gcgcattgtg aaga 24
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tccgggagac aagcaacgac a 41
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tcgggagaca agcaacgacg 40
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcgctagagc ctctggacta cat 23
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gaaggtgacc aagttcatgc tggttgggac acaccagtta gg 42
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaaggtcgga gtcaacggat tgggttggga cacaccagtt agt 43
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgtttcgcca ctctggcatc ctat 24

Claims (13)

1.用于高通量检测玉米南方锈病抗性的玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物为选自如下的SNP标记物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869，以玉米参考基因组B73V3版本染色体10为准，所述A003135对应的位置为3,020,570，等位位点1为T，等位位点2为C；A003857对应的位置为2,437,710，等位位点1为A，等位位点2为G；A003858对应的位置为2,450,914，等位位点1为C，等位位点2为T；A003859对应的位置为2,469,304，等位位点1为A，等位位点2为C；A003864对应的位置为4,002,339，等位位点1为A，等位位点2为G；A003865对应的位置为4,652,445，等位位点1为T，等位位点2为C；A003866对应的位置为4,668,571，等位位点1为A，等位位点2为G；A003869对应的位置为4,696,425，等位位点1为G，等位位点2为T。
2.用于高通量检测玉米南方锈病抗性的方法，其特征在于所述方法包括从待检测的玉米品种获得的核酸样品中鉴定至少一种权利要求1限定的SNP标记物，所述方法选自：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述等位基因-特异性引物延伸中采用的等位基因特异性引物为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ IDNO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ IDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ IDNO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ IDNO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
4.权利要求1限定的一种或者多种SNP分子标记物在鉴定玉米南方锈病抗性中的应用。
5.用于筛选玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25位点与玉米南方锈病抗性相关的SNP分子标记物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)选择玉米南方锈病抗病主效基因Rpp25区段附近的SNP；(2)根据所选择的SNP，基于LGC公司的KASP Master Mix试剂盒设计对应于每个SNP的KASP引物组；(3)以玉米基因组DNA作为模板，利用步骤(2)设计的KASP引物组进行PCR扩增；(4)对经PCR扩增后的SNP位点进行基因分型，寻找基因分型成功的SNP标记物；以及(5)将基因分型成功的SNP标记物与有统计学意义数量的已知玉米南方锈病抗性表型的样品进行对比，进行T-TEST计算，选择差异达到显著水平P<0.05的SNP分子标记物作为与玉米南方锈病抗性相关的SNP分子标记物。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述SNP为权利要求1限定的SNP。
7.用于鉴定权利要求1限定的SNP标记物的引物组。
8.根据权利要求7的引物组，其特征在于所述引物组选自：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ IDNO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ IDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ IDNO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ IDNO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
9.用于鉴定权利要求1限定的SNP标记物的试剂盒，所述试剂盒包含选自如下的试剂之一：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
10.根据权利要求9的试剂盒，所述等位基因特异性引物为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ IDNO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ IDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ IDNO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ IDNO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
11.根据权利要求9的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的试剂固定在基质上或排列在阵列上。
12.用于鉴定权利要求1限定的一种或者多种SNP分子标记物的试剂在检测玉米南方锈病抗性中的应用，所述用于鉴定权利要求1限定的一种或者多种SNP分子标记物的试剂选自：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
13.根据权利要求12的应用，其特征在于所述等位基因特异性引物为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ IDNO:7)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ IDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ IDNO:10)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ IDNO:13)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ IDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18)；
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21)；和
(8)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22)，特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。
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