CN104120166A - 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 - Google Patents
荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104120166A CN104120166A CN201310142789.XA CN201310142789A CN104120166A CN 104120166 A CN104120166 A CN 104120166A CN 201310142789 A CN201310142789 A CN 201310142789A CN 104120166 A CN104120166 A CN 104120166A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pds gene
- probe
- wild
- type
- type probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150108119 PDS gene Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 92
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 35
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 4
- -1 dNTP Substances 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 239000002585 base Substances 0.000 claims 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 abstract description 11
- 210000002905 vestibular aqueduct Anatomy 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 abstract 1
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 241001643597 Evas Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102000011384 Pendrin Human genes 0.000 description 2
- 108050001616 Pendrin Proteins 0.000 description 2
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000370738 Chlorion Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010011882 Deafness congenital Diseases 0.000 description 1
- 206010011891 Deafness neurosensory Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014016 Ear malformation Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 1
- 101150030803 SLC26A4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009966 Sensorineural Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 231100000879 sensorineural hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000023573 sensorineural hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋基因PDS2168A＞G突变的方法及试剂盒。针对PDS2168A＞G突变位点，设计特异性突变型探针和野生型探针并分别标记不同颜色的荧光，突变位点两侧设计扩增引物。对一个待测样本用含野生型探针、突变型探针及扩增引物的PCR反应体系进行扩增，通过与质控品比较荧光曲线模式判断样本是否存在PDS基因2168A＞G突变。本发明能为耳聋患者尤其是伴大前庭水管综合征的病因诊断提供临床参考，也能筛查新生儿、孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断、新生儿先天耳聋病因诊断提供帮助。试剂盒具有闭管高通量自动化操作及分析的特点，尤其适合临床实验室使用。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种探针特异性的实时PCR技术检测耳聋基因PDS 2168A＞G突变的方法及其试剂盒。
背景技术
耳聋是造成语言交流障碍最常见的疾病，新生儿耳聋的发病率为0.1％～0.3％。我国听力语言残疾者甚众，并以每年新生3万聋儿的速度增长，我国累计约有30万对生育至少一个聋儿的育龄夫妇面临再次生育的选择。耳聋发生的原因、是否具有遗传性、下一次生育是否安全是耳聋家庭极为关心的问题。大前庭水管综合征(Enlarge vestibular aqueduct syndrome.EVAS)是一种发病率较高的常染色体隐性遗传性听力障碍性疾病。影像学检查资料表明在儿童感音神经性聋患者中，大前庭水管是最常见的一种内耳畸形，在遗传性聋人群中发病率约为1％～1.3％，在某些地区甚至可达7％。SLC26A4基因定位于7q31，其mRNA全长4930bp，共有21个外显子.开放阅读框架2343bp，贯穿于外显子2和外显子21，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘氯离子转运有关突变的特点。2168A＞G突变是EVAS患者中最常见的SLC26A4基因突变位点之一，对中国人群进行2168A＞G突变的普遍筛查，可降低大前庭水管患儿的出生率。
目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的专利201010599385.X，采用特异性引物及探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术进行突变检测，该方法操作上复杂，仪器昂贵，也不易普及推广。
本方法采用一种实时荧光聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测PDS基因2168A＞G突变的方法，针对PDS基因2168A＞G位点设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在PDS基因2168位点两侧翼序列区设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单，检测单个位点突 变需要1个PCR反应管实现的优点。适合临床实验室使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PDS基因2168A＞G突变的实时荧光PCR检测方法和试剂盒，可用于临床样本的检测。
本发明的具体技术路线为：
1)PDS基因外显子19区域(SEQ ID NO：5)的2168A＞G位点处设计野生型探针及突变型探针，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖PDS基因2168A＞G位点，其中野生型探针(SEQ ID NO：3)针对PDS基因2168A＞G野生型位点，突变型探针(SEQ ID NO：4)针对PDS基因2168A＞G突变位点。
2)探针5’端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA或BHQ1等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是覆盖PDS基因2168A＞G位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5’端标记的荧光发生基团及其相应的3’端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基团，如FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的Taqman探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman探针或现有技术能够实现的在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。
3)PDS基因2168位点上游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列，能够扩增出含有PDS基因2168位点的长度为50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向引物(SEQ ID NO：1)及反向引物(SEQ ID NO：2)为能扩增出含有PDS基因2168位点的60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
4)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括：耐热DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，正向引物(SEQ ID NO：1)，反向引物(SEQ ID NO：2)，野生型探针(SEQ ID NO：3)，突变型探针(SEQ ID NO：4)。
5)从待测样本中提取DNA，加入反应体系，进行荧光定量PCR反应。
6)依据野生型、突变型探针标记的不同颜色显示确定样本的基因型。只有野生型探针的颜色显示时，样本为野生型，反之为突变型，如果两种颜色都存在，则样本为杂合型。
本发明提供的PDS基因2168A＞G突变检测试剂盒主要包括以下组分：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品，DNA裂解液，红细胞裂解液和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明依据下述原理来实现，为了检测PDS(SEQ ID NO：5)基因2168A＞G位点，设计覆盖2168A＞G位点的突变型探针与野生型探针，野生型探针只能与野生型样本模板完全匹配，突变型探针只能与突变型样本模板完全匹配，由于突变型探针与野生型探针5’端标记的荧光报告基团不同，即二者发射波长不同的荧光，在荧光PCR仪上被分别记录并在分析软件中以不同颜色或不同的标记反映出来。
根据本发明的一个优选的实施方案，试剂盒中PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物(SEQ ID NO：1)，反向引物(SEQ ID NO：2)，野生型探针(SEQ ID NO：3)，突变型探针(SEQ ID NO：4)。
正向引物(SEQ ID NO：1)：5’-CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3’
反向引物(SEQ ID NO：2)：5’-TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3’
野生型荧光探针(SEQ ID NO：3)：5’FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13’
突变型荧光探针(SEQ ID NO：4)：5’FAM-TTTGACGGTCCGTGATGCTATA-BHQ13’
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中也可以仅加入突变型探针，当模板是突变型时，则最终可检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本含有突变位点，当模板是野生型时，则最终不能检测到突变型探针发射出的荧光，因而确定样本不含有突变位点。理论上，一个体系中可以仅加入突变型探针，但是当同时加入野生型探针时，可以起到反向校正的双保险作用，使结果更加准确可靠。仅加入突变型探针的试剂盒中PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向引物(SEQ ID NO：1)，反向引物(SEQ ID NO：2)，突变型探针(SEQ ID NO：4)。
正向引物(SEQ ID NO：1)：5’CTTTGACGACAACATTAGAAAGG-3’
反向引物(SEQ ID NO：2)：5’-TTGACCCTCTTGAGATTTCACT-3’
野生型荧光探针(SEQ ID NO：3)：5’FAM-TTTGACGGTCCATGATGCTATA-BHQ13’
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阳性质控品为经过测序检验结果为PDS基因2168A＞G纯合突变型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或质粒载体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水或鲑鱼***DNA，也可以为经过测序检验结果为PDS基因2168A＞G野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或相应的质粒载体；
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中待检测靶核酸样品来自从各种途径获取的被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织等等。
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的DNA提取液主要包含Chelex-100。也可以使用其它试剂盒或方法提取的DNA作为进行荧光PCR的模板。
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中用于判定检测方法有效性的标准是：每次检测都使用PCR反应液分别检测阳性质控品和阴性质控品，对于阳性质控品，依据突变型探针产生的颜色荧光曲线作为阳性质量控制标准，阳性质控品的Ct值应小于30。对于以经过测序检验结果为PDS基因2168A＞G位点野生纯合型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的PCR产物或相应的质粒载体阴性质控品，依据野生型探针产生的颜色荧光曲线作为阴性质量控制标准，阴性质控品的Ct值应小于30；对于以蒸馏水、纯水、生理盐水或鲑鱼***DNA的阴性质控品，野生型和突变型探针产生的颜色荧光曲线的Ct值均应大于35。
根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，在试剂盒的PCR缓冲液中加入甲酰胺或二甲基亚砜等PCR反应添加剂减少高GC含量或二级结构对PCR反应的影响。
附图说明
图1显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，‘S’型曲线是突变型探针颜色荧光曲线，野生型探针颜色荧光曲线无扩增。
图2显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，‘S’型曲线是野生型探针颜色荧光曲线，突变型探针颜色荧光曲线无扩增。该阴性质控品为经过测序检验结果为PDS基因2168位点突变纯合型的质粒载体。
图3显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，野生型与突变型探针颜色荧光曲线Ct值均无扩增。该阴性质控品为鲑鱼***DNA。
图4显示试剂盒检测PDS基因2168A＞G纯合突变型人外周血组织标本的扩增曲线。结果同图1。
图5显示试剂盒检测PDS基因2168A＞G野生型人外周血组织标本的扩增曲线。结果同图2。
图6显示试剂盒检测PDS基因2168A＞G杂合型人外周血组织标本的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，两条‘S’型曲线分别表示野生型与突变型探针颜色荧光曲线，可见2条曲线的Ct值接近。
图7显示DNA提取失败的人外周血组织的扩增曲线，结果同图3。野生型及突变型探针颜色荧光曲线均无扩增，说明DNA提取失败。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：PDS基因2168A/G突变检测试剂盒及其使用
试剂盒的组成
PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1管(20ul)，阴性质控品1管(20ul)，DNA提取液1管(3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。
PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0.2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0.2uM正向引物(SEQ ID NO：1)、0.2uM反向引物(SEQ ID NO：2)、0.2uM野生型荧光探针(SEQ ID NO：3)，0.2uM突变型荧光探针(SEQ ID NO：4)。
操作步骤：
1)基因提取：取100ul EDTA抗凝外周血，加入600ul红细胞裂解液，室温放置5-10分钟，期间混匀数次，5000rpm离心5分钟，弃上清，然后加入DNA裂解液100ul，混匀，99度10分钟，离心，取上清作为DNA摸板进行后续工作。也可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行基因提取，提取过程按照相应的试剂盒说明进行。
2)PCR检测：取PCR反应液23ul置入PCR管中，加入2ul样品DNA，混匀后置于荧光定量PCR仪中。
阳性质控：分别取阳性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
阴性质控：分别取阴性质控品2ul加入PCR反应液中，余同样品操作。
PCR扩增参数：50℃ 2min，95℃ 2min，然后进行40个循环：95℃ 30sec→61℃ 20sec，反应结束后将结果保存待进一步分析。
3)结果分析：依据阳性质控品、阴性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果存在2条不同颜色的荧光曲线，则样本为杂合型。
实施例2：PDS基因2168A/G突变检测试剂盒及其使用
试剂盒的组成
PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1管(20ul)，阴性质控品1管(20ul)，DNA提取液1管(3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。
PCR反应液包括：1XPCR Buffer、0.2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0.2uM正向引物(SEQ ID NO：1)、0.2uM反向引物(SEQ ID NO：2)、0.2uM突变型荧光探针(SEQ ID NO：4)。
操作步骤同实施例1。
结果分析：依据阳性质控品荧光颜色曲线对样本进行分析。如果存在与阳性质控品荧光颜色相同的曲线，则样本存在PDS基因2168A/G突变，不能区分杂合还是纯合突变。如果不存在荧光曲线，则样本判定为野生型。
Claims (7)
1.一种采用实时荧光聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测PDS基因2168A＞G突变的方法，其特征在于以PDS基因第19外显子位点(2168A＞G)设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在PDS基因2168A＞G碱基两侧设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。
2.一种用实时荧光PCR方法检测PDS基因2168A＞G突变的试剂盒，其特征在于试剂盒主要包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品。
3.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PDS基因2168A＞G碱基上游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列，能够扩增出含有PDS基因2168A＞G区域的长度为50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向引物(SEQ ID NO：1)及反向引物(SEQ ID NO：2)为能扩增出含有PDS基因第19外显子位点(2168A＞G)区域60-150bp片段的特异性核苷酸序列。
4.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PDS基因2168A＞G区域设计野生型探针及突变型探针，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖PDS基因2168区域，其中野生型探针(SEQ ID NO：3)针对PDS基因2168A＞G野生型位点，突变型探针(SEQ ID NO：4)针对PDS基因2168A＞G突变位点。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PCR反应液中包含荧光检测物质。荧光检测物质为荧光探针，其中探针5’端标记荧光发生基团，3’端标记荧光淬灭基团。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述的方法和试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内容：PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向型引物、反向型引物、野生型荧光探针、突变型荧光探针。
7.根据权利要求1、2所述的方法及权利6所述的试剂盒，其特征在于待检测靶核酸样品来自被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织；阳性质控品为经过测序检验结果为PDS基因2168A＞G纯合突变型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或含有相应序列的PCR产物或质粒载体；阴性质控品为蒸馏水、纯水、生理盐水、鲑鱼***DNA；阴性质控品也可以为经过测序检验结果为PDS基因2168A＞G野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或含有相应序列的PCR产物或质粒载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310142789.XA CN104120166A (zh) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310142789.XA CN104120166A (zh) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104120166A true CN104120166A (zh) | 2014-10-29 |
Family
ID=51765796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310142789.XA Pending CN104120166A (zh) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104120166A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711367A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种迟发性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 |
| CN106929608A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-07 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr方法及试剂盒 |
| CN107058538A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-08-18 | 昆明理工大学 | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 |
| CN117987539A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-05-07 | 北京诺禾致源科技股份有限公司 | 用于检测abcg8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102108410A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-06-29 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 用于确定大前庭水管综合症性耳聋pds基因突变的基因组合、引物、探针和用途 |
| CN102108412A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-06-29 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒 |
| CN102465174A (zh) * | 2010-11-09 | 2012-05-23 | 王宝恒 | 荧光定量pcr技术检测gjb2基因突变的方法及其试剂盒 |
| CN102719538A (zh) * | 2012-06-07 | 2012-10-10 | 上海交通大学 | 非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法 |
| CN102864232A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-09 | 潮州凯普生物化学有限公司 | 耳聋易感基因联合检测试剂盒 |
-
2013
- 2013-04-24 CN CN201310142789.XA patent/CN104120166A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102465174A (zh) * | 2010-11-09 | 2012-05-23 | 王宝恒 | 荧光定量pcr技术检测gjb2基因突变的方法及其试剂盒 |
| CN102108410A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-06-29 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 用于确定大前庭水管综合症性耳聋pds基因突变的基因组合、引物、探针和用途 |
| CN102108412A (zh) * | 2010-12-22 | 2011-06-29 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒 |
| CN102719538A (zh) * | 2012-06-07 | 2012-10-10 | 上海交通大学 | 非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法 |
| CN102864232A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-09 | 潮州凯普生物化学有限公司 | 耳聋易感基因联合检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王默进等: "运用TaqMan 探针实时荧光PCR技术检测AKAP10 基因2073A/G单核苷酸多态性", 《四川大学学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711367A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-06-17 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种迟发性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 |
| CN104711367B (zh) * | 2015-04-03 | 2016-06-22 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种迟发性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 |
| CN107058538A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-08-18 | 昆明理工大学 | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 |
| CN107058538B (zh) * | 2017-04-20 | 2021-01-19 | 昆明理工大学 | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 |
| CN106929608A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-07 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr方法及试剂盒 |
| CN117987539A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-05-07 | 北京诺禾致源科技股份有限公司 | 用于检测abcg8突变基因的试剂在制备用于检测谷固醇血症1型患者或携带者的试剂盒中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Switaj et al. | Recent trends in molecular diagnostics for Toxoplasma gondii infections | |
| US8980555B2 (en) | Rapid genotyping analysis and devices thereof | |
| Costa et al. | Genotyping of the protozoan pathogen Toxoplasma gondii using high-resolution melting analysis of the repeated B1 gene | |
| CN107254531B (zh) | 早发性结直肠癌辅助诊断的遗传生物标志物及其应用 | |
| WO2014139330A1 (en) | Rapid genotyping analysis and kits thereof | |
| CN102465174A (zh) | 荧光定量pcr技术检测gjb2基因突变的方法及其试剂盒 | |
| CN102534031A (zh) | 一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用 | |
| EP2964780B1 (en) | Discrimination of blood type variants | |
| CN110699446B (zh) | 一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用 | |
| CN111676283B (zh) | 与高原肺水肿发生相关的线粒体dna单核苷酸多态性的应用 | |
| Okay et al. | Significant performance variation among PCR systems in diagnosing congenital toxoplasmosis in São Paulo, Brazil: analysis of 467 amniotic fluid samples | |
| CN104120166A (zh) | 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 | |
| CN106521023A (zh) | 一种检测中国人HPFH和δβ‑地中海贫血的试剂盒及方法 | |
| EP2130917A1 (en) | Probe for detecting polymorphism in gene involved in immunity, and use thereof | |
| CN106834434B (zh) | 用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN105441540A (zh) | 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用 | |
| Kosek et al. | High degree of Plasmodium vivax diversity in the Peruvian Amazon demonstrated by tandem repeat polymorphism analysis | |
| CN108715893B (zh) | 一组与放疗引起的放射性脑损伤相关的snp标志物及其应用 | |
| CN115029444A (zh) | 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 | |
| CN109182493A (zh) | 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法 | |
| CN104120167A (zh) | 荧光pcr技术检测pds基因ivs7-2a>g突变的方法及其试剂盒 | |
| US20070128602A1 (en) | Polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide poylmorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the polynucleotide | |
| CN104789673B (zh) | rs1800818在检测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征中的应用 | |
| CN102534030A (zh) | 4个聋病易感基因联合检测试剂盒及其应用 | |
| CN104099402A (zh) | 单管荧光PCR技术检测GJB2基因235delC突变的方法及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHI GUIZHI Free format text: FORMER OWNER: WANG BAOHENG Effective date: 20150807 Owner name: WANG BAOHENG Effective date: 20150807 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Shi Guizhi Inventor after: Wang Baoheng Inventor before: Wang Baoheng Inventor before: Shi Guizhi |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WANG BAOHENG SHI GUIZHI TO: SHI GUIZHI WANG BAOHENG |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150807 Address after: 250002, room 2, building 9, building 501, provincial court dormitory, sunshine Shun two district, Shizhong District, Ji'nan City, Shandong Applicant after: Shi Guizhi Applicant after: Wang Baoheng Address before: 250002, room 2, building 9, building 501, provincial court dormitory, sunshine Shun two district, Shizhong District, Ji'nan City, Shandong Applicant before: Wang Baoheng |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Shi Guizhi Document name: the First Notification of an Office Action |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141029 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |