CN111961763A - 一种新型冠状病毒检测基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因芯片，所述基因芯片能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS‑CoV‑2以及，如果存在的话，测定SARS‑CoV‑2的基因组序列；包含所述基因芯片的试剂盒；以及使用所述基因芯片来检测是否存在新型冠状病毒SARS‑CoV‑2以及，如果存在的话，测定SARS‑CoV‑2的基因组序列的方法。

Description

一种新型冠状病毒检测基因芯片

技术领域

本发明提供了一种基因芯片，所述基因芯片能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

背景技术

严重急性呼吸***综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引发的疫情已在全球蔓延，截至2020年7月14日，已造成全球超过1300万人确诊新型冠状病毒肺炎COVID-19，超过57万患者死亡，并且人数仍在迅速增加。随着世界范围内COVID-19疫情的发展，多个国家进入公共卫生紧急状态，全球科学家都在抓紧研究更好的检测、治疗、防控手段。目前，对于SARS-CoV-2病毒进行检测，总体可以分为抗体检测和核酸检测两大类。

抗体是病毒感染人体后，刺激人体免疫细胞特异性产生的一类免疫球蛋白，利用抗原和抗体特异性结合原理，可通过抗原检测抗体的存在，从而间接证明人体已感染新型冠状病毒。抗体检测最大的优势在于方便快捷，检测时间较短；但在疾病的感染早期，人体内可能还没有产生抗体，所以抗体检测存在窗口期，并且存在个体免疫应答差异，因此抗体检测对早期新型冠状病毒的检测仍存在假阴性的可能。同时，由于交叉反应，也可能产生假阳性。

核酸是病毒的遗传物质，对病毒序列的特征序列进行检测可用来确定是否发生病毒感染。核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性较高等特点，是确诊新冠肺炎的“金标准”。目前使用最广泛的核酸检测手段是实时荧光定量RT-PCR(q-PCR)技术，但q-PCR检测存在以下问题：(一)可能会出现假阴性：由于q-PCR检测是以点概面(仅针对病毒基因组上2-3个位点，覆盖<0.5％病毒基因组)，通过判断与扩增引物对应的长度为一百多个碱基对的病毒特征序列存在与否来判读是否为阳性感染病人，因此在遇到目标区域变异、目标区域降解、背景干扰等原因时容易导致检测失败，采样不当、标本保存不当、采用不同类型的标本以及使用不同厂家试剂都可能造成核酸检测结果出现“假阴性”从而导致漏诊；(二)检测精度低：一般检测精度在50-70％，所以需要通过二次或更多次重复检测来弥补缺陷；(三)对检测设备或平台要求较高：一方面，高灵敏度的q-PCR仪价格不菲；另一方面，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。另外，SARS-CoV-2作为一种RNA病毒，突变率极高，这可能助长其传播和毒性，并且由于快速突变，为其核酸检测的准确性带来很多负面影响。

根据国家药品监督管理局官网上的信息，截止2020年03月27日，国家药监局已经应急批准23个新型冠状病毒检测产品，其中新型冠状病毒核酸检测试剂15个，抗体检测试剂8个。这些新型冠状病毒检测产品并未克服上述抗体检测或核酸检测的缺点。

此外，Tomoko Matsuda等人于2020年2月20日发表在预印本网站arXiv上的研究报告(Phylogenetic analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus2 reflected the several routes of introduction to Taiwan,the United States,and Japan)显示：新型冠状病毒的来源始终存在争议，如果对阳性样本大规模测序，积累的大数据可以真正确定病毒来源和进化方向；摸清病毒来源、传播路径、演化方向，对下一步防控具有重大的意义。这表明：对SARS-CoV-2病毒进行多样本、大规模的精准测序将有助于查清病毒的来源和进化方向，以便指导后续的防控工作。

中国工程院院士李兰娟团队于2020年4月14日发表在预印本网站medRxiv上的研究报告(Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2,HangpingYao等人)指出：新型冠状病毒株的变异和多样性或被大大低估；不同变异毒株在细胞病变效应和病毒载量方面差异可达270倍；一种三核苷酸突变能大大增强病毒的复制速率和致病能力，发现这种突变的病人保持了45天的核酸阳性。这表明：SARS-CoV-2病毒检测不仅需要判断SARS-CoV-2存在与否，还需要精准判读SARS-CoV-2的基因变异情况，以便指导后续的隔离、治疗等措施。

Next-Generation Sequencing(二代测序)技术是病毒核酸检测的一种备选方法，其通过对病毒基因组全序列碱基进行测序解析，可以获得病毒基因组序列的全部信息。但是，二代测序的读长较短，导致对病毒的全基因组序列进行组装的困难较大，为了提高覆盖度和准确性，必须采用比较高的测序深度，从而加剧了二代测序成本高、时间长的缺点。鉴于此，二代测序技术只适合用于少量样本的科学研究，而不适合用于大规模的常规检测。事实上，目前在针对广泛人群进行SARS-CoV-2病毒筛查的实践中，也没有选择应用二代测序技术来进行筛查。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种新的方法，其能够检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，该方法能够实现早期诊断、方便快捷、高通量、高灵敏度、高特异性和高准确率，同时降低假阴性率和假阳性率。

发明内容

本发明提供了一种基因芯片，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述基因芯片包含29846组探针，每组探针包含8条长度为25bp的探针，这8条探针覆盖所述SARS-CoV-2基因组的同一区段，每组探针中的第一探针与所述SARS-CoV-2基因组的该区段完全相同，第二探针、第三探针和第四探针与所述第一探针仅在一个特定位点处不同且在该特定位点处分别为A、T、C、G中其余三种碱基，第五探针、第六探针、第七探针、第八探针分别与所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针完全互补，各组探针中的所述特定位点对应所述SARS-CoV-2基因组中的不同位点且所有所述特定位点全面覆盖了所述SARS-CoV-2基因组的第13-29858位，所述特定位点是所述探针中的第13位。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明所述的基因芯片。

本发明还提供了一种方法，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述方法包括以下步骤：

(1)对待检测的实验样本进行RNA提取、逆转录、扩增、荧光标记以及片段化；

(2)使步骤(1)的产物与如本发明所述的基因芯片杂交，

(3)基于所述基因芯片上的探针与所述步骤(1)的产物的杂交信号，确定所述待检测的实验样本中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

本发明还涉及如本发明所述的基因芯片或如本发明所述的试剂盒或如本发明所述的方法用于冠状病毒亚科内的新病毒预警的用途。

附图说明

图1示出了本发明的探针设计方法的示意图，其中各探针亚组中的特定位点(以粗体并加下划线显示)分别对应于SARS-CoV-2基因组第146、147、148、149位。举例来说，为了检测SARS-CoV-2基因组第146位的碱基，设计了8条长25bp的探针，其中图1中仅示出了4条，另外4条与图1中所示的4条反向互补；特定位点位于探针的中心，即第13位，第一探针在特定位点处的碱基为A(与SARS-CoV-2基因组第146位的碱基相同)，第二探针、第三探针、第四探针在特定位点处的碱基彼此不同地为C、T、G中的一种；除了特定位点所对应的第146位之外，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的序列与SARS-CoV-2基因组第134-145以及147-158位的碱基完全相同。

图2示出了：在本发明的一种实施方式中，芯片扫描的结果，其中基因芯片上固定有238768条探针，实验样本为阳性样本。

图3示出了：在本发明的一种实施方式中，芯片扫描的结果，其中基因芯片上固定有238768条探针，实验样本为阴性对照。

具体实施方式

与实践操作中普遍使用q-PCR技术以及仅科研工作中少量使用二代测序技术来进行新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测不同，本发明的发明人创造性地想到了利用重测序方法来检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

重测序芯片是一种特殊类型的基因芯片，其通过一个或多个连续的序列来判断检测结果，局部的干扰不影响最终的判别，在样本浓度低、背景信号高、检测样本复杂环境下，这个特性非常重要，可以大大提高检测灵敏度。此外，重测序芯片的覆盖率远大于q-PCR的覆盖率(<0.5％)，将覆盖率提高了约200倍，从而通过提高采集信息的丰富度，大幅度提高了检测灵敏度，可以在q-PCR检测的CT值大于阈值而导致检测结果假阴性时，依靠芯片探针的特异性区分有无新型冠状病毒信号，做出更准确的诊断。

本发明通过利用重测序芯片对SARS-CoV-2病毒的基因组进行全面覆盖的精准测序，克服了现有技术中已知的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测方法的缺点，实现了早期诊断、方便快捷、高通量、高灵敏度、高特异性和高准确率，同时降低了假阴性率和假阳性率。

在本文中使用时，“基因芯片”指的是采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地固定于硅片、玻璃片、塑料片或尼龙基底等固体支持物上，形成二维阵列，从而得到的芯片。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与固定在基因芯片上的已知序列的核酸探针杂交而对实验样本进行序列测定的方法。

在本文中使用时，“原位合成基因芯片”指的是通过原位光刻合成法或原位喷印合成法，把A、G、C、T四种碱基依次连接到基片的序列上，合成大量所需的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，从而得到的芯片。原位合成寡核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡核苷酸等诸多优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。

正冠状病毒亚科(学名：Orthocoronavirinae)通称冠状病毒(Coronavirus)，其属于网巢病毒目冠状病毒亚目冠状病毒科，是一类在动物与人类之间传播的人畜共患的单链RNA病毒。正冠状病毒亚科内的不同病毒种类具有一定的共性，例如基因组大小在26,000至32,000个碱基对之间，是基因组规模最大的一类RNA病毒；在电子显微镜下呈球状或椭圆形，上有规则排列的囊状胶原纤维突，形似皇冠状，并因此得名；病毒囊膜由双层脂质组成，穿插膜蛋白和纤突蛋白，某些还会有血凝素；病毒内部为RNA和衣壳蛋白组成的核蛋白核心，呈螺旋式结构。

目前有七个已知的人类冠状病毒种类，其中严重急性呼吸***综合症冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)以及严重急性呼吸***综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)三种可引起致命的呼吸***疾病；其余四种冠状病毒是人类感冒的常见病原体，通常不会造成严重疾病，只限于可能会在少数免疫力差的患者身上出现肺炎等并发症。

SARS-CoV-2是一种有包膜的单股、正链RNA病毒，其基因组长度为29903bp。基因组的5’端带有帽子结构，其后包含6-10个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)。占据基因组2/3的第一个ORF编码复制酶，基因组的另1/3主要编码结构蛋白，一般包括棘突蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)、核蛋白(nucleocapsid，N)。E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程，N蛋白包裹基因组形成核蛋白复合体。

本发明的基因芯片是基于对SARS-CoV-2病毒的全基因组进行重测序设计而成的。它利用芯片探针密度高、数量多的优点，为待测序的病毒基因组每一个位点设计了一组探针(针对每一位碱基设计了对应位置分别为A、T、G、C的四条探针，正负链各有四条，因此总共八条探针)，来检测每一个碱基。当带有荧光标记的目标核酸序列与基因芯片上的探针杂交时，相应位置分别包含A、T、G、C的四条探针或完全匹配杂交或非特异杂交，从而产生明显的亮度差别，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可确定目标核酸的序列。

因此，本发明提供了一种基因芯片，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述基因芯片包含29846组探针，每组探针包含8条长度为25bp的探针，这8条探针覆盖所述SARS-CoV-2基因组的同一区段，每组探针中的第一探针与所述SARS-CoV-2基因组的该区段完全相同，第二探针、第三探针和第四探针与所述第一探针仅在一个特定位点处不同且在该特定位点处分别为A、T、C、G中其余三种碱基，第五探针、第六探针、第七探针、第八探针分别与所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针完全互补，各组探针中的所述特定位点对应所述SARS-CoV-2基因组中的不同位点且所有所述特定位点全面覆盖了所述SARS-CoV-2基因组的第13-29858位，所述特定位点是所述探针中的第13位。

本发明的基因芯片至少能够实现2个功能：(1)检测是否存在SARS-CoV-2；

(2)在检测出存在SARS-CoV-2的情况下，还能够同时确定SARS-CoV-2的基因组序列。

虽然SARS-CoV-2的基因组长度为29903bp，但基因组最后33个碱基构成了polyA尾巴，因此没有针对这33个位点设计探针；此外，鉴于特定位点是探针中的第13位，因此基因组序列的前12个碱基和尾部12个碱基是无法设计探针的，所以本发明的基因芯片包含(29903-33-12-12＝)29846组探针。由于每组探针包含8条探针，每条探针长度均为25bp，因此本发明的基因芯片包含29846(组)×8(条)＝238768条长度为25bp的探针。

每组探针所包含的8条探针可以分为2个亚组，第一亚组(由第一探针、第二探针、第三探针和第四探针组成)中的4条探针与第二亚组(由第五探针、第六探针、第七探针和第八探针组成)中的4条探针完全互补。第一亚组/第二亚组中的四条探针之间唯一的差别是：在特定位点彼此不同地为A、T、G、C中的一种。

在本文中使用时，“特定位点”指的是同一组中第一亚组或第二亚组的4条探针在该位点彼此不同地为A、T、G、C中的一种，但在其它位点完全相同；特点位点位于探针的中心，即，第13位。

举例来说，标准探针中的一组探针包含8条探针，这8条探针均覆盖SARS-CoV-2基因组的第X至(X+24)位，第一探针的序列与SARS-CoV-2基因组的第X至(X+24)位的序列完全相同，如果第一探针在特定位点(即，对应于SARS-CoV-2基因组的第X+12位的位点)为A，则第二探针、第三探针和第四探针在特定位点彼此不同地为T、G、C中的一种，但在另外24个位点与第一探针完全相同；第五探针、第六探针、第七探针、第八探针分别与所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针完全互补。需要说明的是，以上示例只是为了更好地阐释本发明，并不表示对本发明的任何限制。

在本发明的基因芯片中，各组探针中的特定位点对应SARS-CoV-2基因组中的不同位点，且所有特定位点全面覆盖了SARS-CoV-2基因组的第13-29858位。也就是说，本发明基因芯片上的29846组探针中的29846个特定位点彼此不同地对应于SARS-CoV-2基因组的第13-29858位，从而使得SARS-CoV-2基因组的每一个位点都能够被精准测序，以实现高灵敏度、高准确率、全面覆盖的基因组测序。

在本发明的一些实施方式中，利用本发明的基因芯片，能够以一步法快速完成SARS-CoV-2病毒基因组全长序列的阅读并获得关于所有已知基因变异的信息。在此基础上，通过参照已知的病毒变异进化树，能够分析获得病毒来源和传播路径。此外，通过观察、总结与特定病毒基因变异对应的COVID-19患者的预后，还能够分析获得不同变异病毒的毒性演变趋势。

在一种实施方式中，利用本发明的基因芯片对普查(例如，通过q-PCR核酸检测或抗体检测进行)显示呈SARS-CoV-2阳性的患者进行大规模检测，以获得大量SARS-CoV-2病毒的基因组全长序列和基因变异信息。基于所获得的深度基因信息和变异信息大数据，能够进行SARS-CoV-2病毒毒性演变趋势研究、来源研究、传播研究等，从而为后续的预防、诊断、治疗提供有价值的指引信息。

此外，由于本发明的基因芯片是采用重测序技术，因此出现的新变种病毒、未知的病毒只要还属于冠状病毒亚科，检测就不受影响；在这种情况下，会在正常测序位置出现异常信号，从而能够第一时间获得新病毒预警。因此，本发明的基因芯片还特别适合用于对菜场、超市、商场、车站、公交、地铁、航空器等人流密集的关键流行病传播点进行冠状病毒亚科的持续跟踪检测，以实现早期发现恶性传染病发生趋势，从而有效指导快速、准确地作出后续决策。

在本发明的实施方式中，本发明的基因芯片可以是本领域已知的任何类型的基因芯片，例如原位合成基因芯片、点样合成基因芯片、微珠基因芯片等。在本发明的一些优选实施方式中，本发明的基因芯片是原位合成基因芯片。由于原位合成基因芯片能够实现更高的密度和更低的成本，且样本数越多、测序规模越大，平均成本越低，这相对于只适合用于少量样本测序且成本高昂的二代测序技术具有极大的优势。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明所述的基因芯片。

在本发明的实施方式中，所述试剂盒除了基因芯片之外还包括用于进行RNA提取和/或逆转录和/或扩增和/或荧光标记和/或片段化和/或杂交和/或染色和/或清洗/洗涤/漂洗的试剂。

在本文中使用时，“逆转录”指的是以RNA为模板合成DNA的过程。由于SARS-CoV-2是RNA病毒，因此逆转录使得以SARS-CoV-2的RNA基因组为模板合成cDNA。

在本文中使用时，“片段化”指的是利用酶切或超声处理等方法将DNA切断/打断，使产物在一定长度范围内的过程。在本发明的优选实施方式中，片段化产物的长度为30-70bp，更优选地40-60bp，最优选地45-55bp。

在本文中使用时，“实验样本”包括“生物样本”和“非生物样本”。“生物样本”指的是从生物体(例如，人)获得的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子或者肺泡灌洗液等样本；如果生物体感染了SARS-CoV-2，则从此类样本中能够提取出SARS-CoV-2的RNA。“非生物样本”指的是从环境(例如，水、拖把、门把手、桌面、地板等)中提取的样本；如果环境中包含SARS-CoV-2，则从此类样本中能够提取出SARS-CoV-2的RNA。

另外，本发明提供了一种方法，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述方法包括以下步骤：

(1)对待检测的实验样本进行RNA提取、逆转录、扩增、荧光标记以及片段化；

(2)使步骤(1)的产物与根据本发明所述的基因芯片杂交，

(3)基于所述基因芯片上的探针与所述步骤(1)的产物的杂交信号，确定所述待检测的实验样本中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

在本发明的实施方式中，待检测的实验样本的逆转录和扩增可分开进行或同时进行。在本发明的一些实施方式中，通过一步法来进行逆转录和扩增，即在一个步骤中同时进行逆转录和扩增。在本发明的一些实施方式中，通过两步法分别进行逆转录和扩增，即先进行逆转录，再进行扩增。

在本发明的优选实施方式中，步骤(1)的产物的长度为30-70bp，更优选地40-60bp，最优选地45-55bp。

此外，本发明还涉及如本发明所述的基因芯片或如本发明所述的试剂盒或如本发明所述的方法用于冠状病毒亚科内的新病毒预警的用途。

此外，本发明还包括以下方面所述的实施方案。

第一方面：一种基因芯片，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述基因芯片包含29846组探针，每组探针包含8条长度为25bp的探针，这8条探针覆盖所述SARS-CoV-2基因组的同一区段，每组探针中的第一探针与所述SARS-CoV-2基因组的该区段完全相同，第二探针、第三探针和第四探针与所述第一探针仅在一个特定位点处不同且在该特定位点处分别为A、T、C、G中其余三种碱基，第五探针、第六探针、第七探针、第八探针分别与所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针完全互补，各组探针中的所述特定位点对应所述SARS-CoV-2基因组中的不同位点且所有所述特定位点全面覆盖了所述SARS-CoV-2基因组的第13-29858位，所述特定位点是所述探针中的第13位。

第二方面：如第一方面所述的基因芯片，其中所述基因芯片是原位合成基因芯片。

第三方面：一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面或第二方面所述的基因芯片。

第四方面：一种方法，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述方法包括以下步骤：

(1)对待检测的实验样本进行RNA提取、逆转录、扩增、荧光标记以及片段化；

(2)使步骤(1)的产物与如第一方面或第二方面所述的基因芯片杂交，

(3)基于所述基因芯片上的探针与所述步骤(1)的产物的杂交信号，确定所述待检测的实验样本中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

第五方面：如第四方面所述的方法，其中所述步骤(1)的产物的长度为30-70bp，优选地40-60bp，更优选地45-55bp。

第六方面：如第一方面或第二方面所述的基因芯片或如第三方面所述的试剂盒或如第四方面或第五方面所述的方法用于冠状病毒亚科内的新病毒预警的用途。

上文针对本发明的基因芯片、试剂盒、方法、用途的各个组成部分、步骤所述的各种实施方式和优选项可以相互组合(只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。

下面将结合附图和实施例以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不旨在限制本发明的保护范围。本发明的保护范围仅通过权利要求来限定。

实施例

除非另有说明，否则以下实施例中所采用的酶及其buffer购买自New EnglandBiolabs(NEB)公司。实施例中使用的基因芯片获自生捷科技(杭州)有限公司，该芯片上固定有238768条如本文所述的标准探针。分子生物学中的常规操作流程可见例如《分子克隆实验指南》。SARS-CoV-2的基因组序列信息可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列NC_045512.2。实施例中使用的引物、探针的序列信息如下表1中所示。

表1：相关引物、探针的序列信息

实施例1：利用本发明的基因芯片通过两步法来检测SARS-CoV-2

1.1实验样本

使用浙江省疾控中心提供的SARS-CoV-2病毒RNA样本作为阳性样本，使用正常人细胞表达的RNA(使用全血样本，利用Lucigen公司MasterPure^TMComplete DNA and RNAPurification Kit提取)作为阴性对照。

1.2逆转录

进行以下实验操作时，利用RNA酶消除剂(Vazyme)对实验环境、实验器材等进行清洁。

(1)将以下成分添加到无核酸酶微量离心管中：

逆转录体系1：12μL

成分	来源	体积
			dATP、dTTP、dGTP、dCTP(10mM)	生工生物工程(上海)股份有限公司	1μL
N6-1引物(50μM)	上海捷瑞生物工程有限公司	1μL
			N6-3引物(100nM)	上海捷瑞生物工程有限公司	1μL
总RNA(10ng/ul)	浙江省疾控中心	9μL

(2)将混合物加热至65℃，持续5min，然后在冰上孵育1min；

(3)通过瞬时离心收集试管中的内容物，然后添加以下成分：

逆转录体系2：7μL

成分	来源	体积
			5X First-Strand Buffer	ThermoFisher	4μL
DTT(0.1M)	ThermoFisher	1μL
			RNaseOUT<sup>TM</sup>Recombinant RNase Inhibitor(40units/μl)	ThermoFisher	1μL
SuperScript<sup>TM</sup>III RT(200units/μl)	ThermoFisher	1μL

(4)轻轻吹打混合，在25℃下孵育5min，然后在50℃下孵育60min，接着在70℃下加热15min以灭活反应；

(5)加入1μL RNase H(5U/μL，NEB)，然后在37℃下消化20min，接着在94℃下加热2min以灭活反应；

(6)通过瞬时离心收集试管中的内容物，然后添加以下成分：

聚合体系：25μL

成分	来源	体积
			10×NEB Buffer 2	NEB	2μL
N6-5引物(100nM)	上海捷瑞生物工程有限公司	2.5μL
			ss cDNA	步骤(5)的产物	20μL
Klenow(3’-5’，Exo-)(5units/μl)	NEB	0.5μL

(7)轻轻吹打混合，在37℃下孵育60min，然后在75℃下加热20min以灭活反应。

1.3PCR扩增

(1)将解冻的试剂涡旋混匀，瞬时离心；随后将以下成分添加到0.2mL PCR管中，以制备扩增混合液；

PCR体系：20μL

成分	来源	体积
			Biotin-11-dUTP(1mM)	ThermoFisher	0.2μL
N6-2引物(10μM)	上海捷瑞生物工程有限公司	1μL
			ds DNA	如实施例1.2中所述获得	2μL
2×PrimeSTAR Max	Takara	10μL
			dd H<sub>2</sub>O	SWAN	6.8μL

(2)将制备好的扩增混合液涡旋数秒混匀，瞬时离心，然后放入PCR仪(BIO-RAD，T100^TMThermal Cycler)中并设置程序如下：

(3)用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；

(4)使用清洁回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，Vazyme)根据制造商的说明书进行回收，然后使用Qubit4(Fluorometer，Invitrogen)检测回收产物的浓度。

1.4PCR产物片段化

(1)将回收得到的PCR产物与下表中所示的成分混合，以制备片段化产物混合液：

反应体系：50μL

成分	来源	体积
			PCR产物(40ng/ul)	如实施例1.3中所述获得	18μL
10×DNase Reaction Buffer	ThermoFisher	5μL
			DNase I(1/100U/μL)	ThermoFisher	2μL
dd H<sub>2</sub>O	SWAN	25μL

注：DNase I在加入之前需在37℃下预热10min；

(2)将制备好的片段化产物混合液涡旋数秒混匀，瞬时离心，然后放入PCR仪(BIO-RAD，T100^TMThermal Cycler)中并设置程序如下：

温度	时间
		37℃	20min
95℃	15min
		4℃	保持

(3)用2％琼脂糖凝胶检测片段化产物，结果显示：片段化产物的大小为50-100bp。

(4)使用Qubit4(Fluorometer，Invitrogen)测定片段化产物的浓度，结果显示：片段化产物的浓度为20ng/ul。

1.5片段化产物杂交

1.5.1预杂交

1)开启45℃杂交箱，提前30min预热(或到温度稳定)；

3)将50ml 6M NaCl饱和溶液加入到密封杂交盒中，与杂交板一起放到45℃杂交箱中提前预热30min；

4)准备Wash A、Wash B，配方如下所示。

Wash A	1L	Wash B	1L
				20×SSC	100mL	20×SSC	25mL
10％Tween-20	1mL	10％Tween-20	1mL
				ddH2O	899mL	ddH2O	874mL

1.5.2杂交

1)按下表所示制备杂交混合液；

杂交体系：65.35μL

成分	来源	体积
			20X SSC	Invitrogen	14μL
10％Tween-20	Sigma	0.35μL
			Cy3-AM1(10nM)	上海捷瑞生物工程有限公司	1μL
片段化PCR产物(20ng/ul)	如实施例1.4中所述获得	48μL

2)将杂交混合液涡旋5s混匀，瞬时离心，然后在95℃下变性15min，降温至45℃后将杂交混合液转移入杂交板与芯片对应位置，扣上芯片板，检查确保无气泡产生；

3)确认无气泡后，放入45℃杂交箱中杂交2h。

注：加样时将杂交板放在45℃PCR仪上保温。

1.5.3清洗

1)准备工作：

a)开启39℃杂交箱提前预热30min(或直到温度稳定)；

b)将20mL Wash A与清洗板置于25℃杂交箱中(室温)预热10min；

c)将20mL Wash B与清洗板置于39℃杂交箱中预热10min。

2)清洗操作：

a)杂交结束后，将芯片板和杂交板从密封杂交盒取出，将芯片板转移至20mL WashA清洗板中孵育3min；转移芯片时速度非常快，避免芯片表面变干；

b)3min后，将芯片板取出，放置在装有20mL Wash B的清洗板中，在39℃下孵育3min。

1.5.4染色

1)将50μL Stain 1(SAPE染液(购自Invitrogen))加入到染色板1芯片对应位置；

2)将芯片板从Wash B中取出，置于染色板1中，室温(25℃)孵育10min；

3)将芯片板从染色板1中取出置于装有20mL Wash A的清洗板中，室温(25℃)孵育5min。

1.5.5芯片扫描成像

用1mL的4×SSC漂洗一次后，利用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)进行荧光信号检测，然后使用VirusHunter分析软件读取扫描结果。

阳性样本的芯片扫描结果如图2所示，测得的具体序列信息如SEQ ID No.6所示。将SEQ ID No.6与NCBI参考序列NC_045512.2(第13-29858位碱基)进行比对，结果显示：覆盖度为99.9％，一致性为99.3％，从而证明了本发明的基因芯片具有高通量、高灵敏度和高准确率。阴性对照的芯片扫描结果如图3所示。从图3中可以明显看出，芯片上的荧光强度非常弱，原因在于未感染SARS-CoV-2的正常人的RNA在经受逆转录、扩增、片段化之后，不能与本发明的基因芯片进行非特异性杂交，因此其存在不会干扰对SARS-CoV-2的检测，从而证明了本发明的基因芯片具有高特异性。

虽然已经阐明并描述了本发明的特定实施方式，但并不意味着这些实施方式阐明了并描述了本发明的所有可能形式。更确切地，用在本说明书中的文字仅仅是描述性的文字并非限制性的。对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开的一般范围的情况下，可以进行各种其它改变和修改。因此，在所附权利要求中，旨在包括在本发明范围内的所有这些改变和修改。

序列表

<110> 生捷科技（杭州）有限公司

生捷科技（嘉兴）有限公司

<120> 一种新型冠状病毒检测基因芯片

<130> D-CF200241

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gccggagctc tgcagatatc nnnnnn 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gccggagctc tgcagatatc 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gccggagctc tgcagatatc tttttttttt tttttttttt 40

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gccggagctc tgcagatatc attaaaggtt 30

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcgtagctag cgtact 16

<210> 6

<211> 29846

<212> DNA

<213> 阳性样本测序结果()

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (124)..(124)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (126)..(128)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (223)..(223)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2471)..(2471)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2473)..(2474)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2479)..(2479)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (3277)..(3277)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (3479)..(3480)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4025)..(4025)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4528)..(4528)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4612)..(4612)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4859)..(4860)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4864)..(4864)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4892)..(4892)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4901)..(4902)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4940)..(4940)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5014)..(5015)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5017)..(5017)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5103)..(5104)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5107)..(5107)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5110)..(5110)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5272)..(5272)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5737)..(5737)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5739)..(5739)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5741)..(5743)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5858)..(5858)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6086)..(6086)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6090)..(6090)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6236)..(6236)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6706)..(6706)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6733)..(6733)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7602)..(7602)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7812)..(7812)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8513)..(8513)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8515)..(8515)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8584)..(8584)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8936)..(8936)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9350)..(9350)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9731)..(9731)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12937)..(12937)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12945)..(12945)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13130)..(13130)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13152)..(13153)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13270)..(13272)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14840)..(14840)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14946)..(14947)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15360)..(15360)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15626)..(15626)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16082)..(16082)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17851)..(17852)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17855)..(17855)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18369)..(18369)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19119)..(19121)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19125)..(19125)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (20295)..(20295)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (20531)..(20531)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (20535)..(20535)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21402)..(21402)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21404)..(21404)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22383)..(22383)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22528)..(22529)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22633)..(22633)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22900)..(22900)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23343)..(23343)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23768)..(23769)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24238)..(24239)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24241)..(24241)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24248)..(24249)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24251)..(24251)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24377)..(24377)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25856)..(25856)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25987)..(25987)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26036)..(26036)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26082)..(26083)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26209)..(26209)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26473)..(26473)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26476)..(26476)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26549)..(26549)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26579)..(26580)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26582)..(26584)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27330)..(27331)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27335)..(27335)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27663)..(27663)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27708)..(27708)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27710)..(27710)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (29837)..(29837)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

tgnntcntta atctcccccc caacgcgtgt agcctanaaa ctggcctnat tcgatactag 60

aacttcaaaa tcactgtggc cgtgattcgg ctgcatcctt agtggccaca cgcaatataa 120

ttgnannngc attaccgcgc aaggcaggac acgagcggct cgtttatctt ccgcaggatg 180

cttacgattt cgaccgcgtt gcagccgatc atgagcacat ctnggtttcg tcagtgtgcg 240

agcgaggggg gatacggaac gcattgtgcc tagttagtac gagaaaacaa acgtccaact 300

cagattcatc aatttacagc ttcgcggggt gctcgtacgt cggtttggag gagacgtgga 360

ggaggactta tcagaggcac gtcaacatct tcgagatggc acttgtggct tagtagaagt 420

tgaaaaaggc gttttgcctc aacttgaaca gccctatgtg ttcatcaaac gttcggatgc 480

tcgtactgca cctcaaggtc atgttatggt tgagctggta gcagaactcg aaggcattca 540

gtacggtcgt agtggtgaga cacttggtgt ccttgtccct catgtgggcg aaataccagt 600

ggcttaccgc aaggttcttc ttcgtaagaa cggtaataaa ggagctggtg gccatagtta 660

cggcgccgat ctaaagtcag ttgacttagg cgacgagctt ggcactgatc cttatgaaga 720

ttttcaagaa aactggaaca ctaaacatag cagtggtgtt acccgtgaac tcatgcgtga 780

gcttaacgga ggggcataca ctcgctatgt cgataacaac ttctgtggcc ctgatggcta 840

ccctcttgag tgcattaaag accttctagc acgtgctggt aaagcttcat gcactttgtc 900

cgaacaactg gactttattg acactaagag gggtgtatac tgctgccgtg aacatgagca 960

tgaaattgct tggtacacgg aacgttctga aaagagctat gaattgcaga caccttttga 1020

aattaaattg gcaaagaaat ttgacacctt caatggggaa tgtccaaatt ttgtatttcc 1080

cttaaattcc ataatcaaga ctattcaacc aagggttgaa aagaaaaagc ttgatggctt 1140

tatgggtaga attcgatctg tctatccagt tgcgtcacca aatgaatgca accaaatgtg 1200

cctttcaact ctcatgaagt gtgatcattg tggtgaaact tcatggcaga cgggcgattt 1260

tgttaaagcc acttgcgaat tttgtggcac tgagaatttg actaaagaag gtgccactac 1320

ttgtggttac ttaccccaaa atgctgttgt taaaatttat tgtccagcat gtcacaattc 1380

agaagtagga cctgagcata gtcttgccga ataccataat gaatctggct tgaaaaccat 1440

tcttcgtaag ggtggtcgca ctattgcctt tggaggctgt gtgttctctt atgttggttg 1500

ccataacaag tgtgcctatt gggttccacg tgctagcgct aacataggtt gtaaccatac 1560

aggtgttgtt ggagaaggtt ccgaaggtct taatgacaac cttcttgaaa tactccaaaa 1620

agagaaagtc aacatcaata ttgttggtga ctttaaactt aatgaagaga tcgccattat 1680

tttggcatct ttttctgctt ccacaagtgc ttttgtggaa actgtgaaag gtttggatta 1740

taaagcattc aaacaaattg ttgaatcctg tggtaatttt aaagttacaa aaggaaaagc 1800

taaaaaaggt gcctggaata ttggtgaaca gaaatcaata ctgagtcctc tttatgcatt 1860

tgcatcagag gctgctcgtg ttgtacgatc aattttctcc cgcactcttg aaactgctca 1920

aaattctgtg cgtgttttac agaaggccgc tataacaata ctagatggaa tttcacagta 1980

ttcactgaga ctcattgatg ctatgatgtt gacatctgat ttggctacta acaatctagt 2040

tgtaatggcc tacattacag gtggtgttgt tcagttgact tcgcagtggc taactaacat 2100

ctttggcact gtttatgaaa aactcaaacc cgtccttgat tggcttgaag agaagtttaa 2160

ggaaggtgta gagtttctta gagacggttg ggaaattgtt aaatttatct caacctgtgc 2220

ttgtgaaatt gtcggtggac aaattgacac ctgtgcaaag gaaattaagg agagtgttca 2280

gacattcttt aagcttgtaa ataaattttt ggctttgtgt gctgactcta tcattattgg 2340

tggagctaaa cttaaagcct tgaatttagg tgaaacattt gtcacgcact caaagggatt 2400

gtacagaaag tgtgttaaat ccagagaaga aactggccta ctcatgcctc taaaagcccc 2460

aaaagaaatt ntnnaaggng agggagaaac acttcccaca gaagtgttaa cagaggaagt 2520

tgtcttgaaa actggtgatt tacaaccatt agaacaacct actagtgaag ctgttgaagc 2580

tccattggtt ggtacaccag tttgtattaa cgggcttatg ttgctcgaaa tcaaagacac 2640

agaaaagtac tgtgcccttg cacctaatat gatggtaaca aacaatacct tcacactcaa 2700

aggcggtgca ccaacaaagg ttacttttgg tgatgacact gtgatagaag tgcaaggtta 2760

caagagtgtg aatatcactt ttgaacttga tgaaaggatt gataaagtac ttaatgagaa 2820

gtgctctgcc tatacagttg aactcggtac agaagtaaat gagttcgcct gtgttgtggc 2880

agatgctgtc ataaaaactt tgcaaccagt atctgaatta cttacaccac tgggcattga 2940

tttagatgtg tggagtatgg ctacatacta cttatttgat gagtctggtg agtttaaatt 3000

ggcttcacat atgtattgtt ctttctaccc cccagatgag gatgaagaag aaggtgattg 3060

tgaagaagaa gagtttgagc catcaactca atatgagtat ggtactgaag atgattacca 3120

atacaaacct ttggaatttg gtgccacttc tgctgctctt caacctgaag aagagcaaga 3180

agaagattgg ttagatgatg atagtcaaca aactgtcggt caacaagacg gcagtgagga 3240

caatcagaca actactattc aaacaattgt tgaggtncat cctcaattag agatggaact 3300

tacaccagtt gttcagacta ttgaagtgaa tagttttagt ggttatttaa aacttactga 3360

caatgcacaa gataaaaatg cagacattgt ggaagaagct aaaaaggtaa aaccaacagt 3420

ggttgttaat gcagccaatg tttaccttta acatggagga ggtgttgcag gagcctaann 3480

gatggctact aacaatgcca tgcaagttga atctgatgat tacatagcta ctaatggacc 3540

acgtaaagtg ggtggtagtt gtgttttaag cggacacaat cttgctaaac actgtcttca 3600

tgttgtcggc ccaaatgtta acaaaggtga agacattcaa cttcttaaga gtgcttatga 3660

aaattttaat cagcacgaag ttctacttgc accattatta tcagctggta tttttggtgc 3720

tgaccctata cattctttaa gagtttgtgt agatactgtt cgcacaaatg tctacttagc 3780

tgtctttgat aaaaatctct atgacaaact tgtttcaagc tttttggaaa tgaagagtga 3840

aaagcaagtt gaacaaaaga tcgctgagat tcctacggag gaagttaagc catttataac 3900

tgaaagaaaa ccttcagttg aacagagaaa acaagatgat aagaaaatca aagcttgtgt 3960

tgaagaagtt acaacaactc tggaagaaac taagttcctc acagaaaact tgttacttta 4020

tattnactac catggcaatc ttcatccaga ttctgccact cttgttagtg acattgacat 4080

cactttctgc aagaaagatg ctccatatat agtgggtgat gttgttcaag agggtgtttt 4140

aactgctgtg gttataccta ctaaaaaggc tggtggcact actgaaatgc tagcgaaagc 4200

tttgagaaaa gtgccaacag acaattatat aaccacttac gcgggtcagg gtttaaatgg 4260

ttacactggg gaggaggcaa agacagtgct taaaaagtgt aaaagtgcct tttacattct 4320

accatctatt atcttgaatg agaagcaaga aattcttgga actgtttctt ggaatttgcg 4380

agaaatgctt gcacatgcag aagaaacacg caaattaatg cctgtctgtg tggaaactaa 4440

agccatagtt tcaactatac agcgtaaata taagggtact aaaatacaag agggtgtggt 4500

tgattatggt gctagatttt acttttcngc aagcaaaaca actgtagcgt cacttatcaa 4560

cacacttaac gatctaaatg aaactcttgt tacaatgcca cttggctagg cnacacatgg 4620

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tgtttcttca cctgatgctg ttacagcgta taatggttat cttacttctt cttctaaaac 4740

acctgaagaa cattttattg aaaccatctc acttgctggt tcctataaag attggtccta 4800

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aaanactagt aatcctacca cattccacct anatggtgca nngatcacct ttgacaatct 4920

taagacactt ctttctgtgn gagaagtgag gactattaag gtgtttacat cagtagacaa 4980

cattaacctc cacacgcaag ttgtggacat gganntnaca tatggacaac agtttggtcc 5040

aactgatttg gatggagctg atgttactaa aataaaacct cataattcac atgaaggtaa 5100

ttnnggntcn cttttaccta atgatgacac tctacgtgtt gaggcttttg agtactacca 5160

cacaactgat cctagttttc tgggtaggta catgtcagca ttaaatcaca cgaaaaagtg 5220

gaaataccca caagttaatg cgttcacttc tattaaatgg gcagataaca cnagttatct 5280

tgccactgca ttgttaacac tccaacaaat agagttgaag tttaatccac ctgctctaca 5340

agatgcttat tacagagcaa gggctggtga tgctgctaac ttttgtgcac ttatcttagc 5400

ctactgtaat aagacagtag gtgagttagg tgatgttaga gaaacaatga gttacttgtt 5460

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tgaacaattt aagaaaggtg ttcagatacc ttgtacgtgt ggtaaacaag ctacaaaata 5640

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cataaaacca gttacttata aattggatgg tgttgtttgt acagaaattg accctaagtt 5940

ggacaattat tataagaaag ccaattctta tttcacagag caaccaattg atcttgtacc 6000

aaaccaacca tatccaaacg caagcttcga taattttaag tttgtatgtg atgatatcaa 6060

atttgctgat gatttaaacc atctgnaccn ttataagaaa cctgcttcaa gagagcttaa 6120

agttacattt ttccctgact taaatggtgg tgtggtggct attgattata aacactacac 6180

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tgcaactaat aaagccacgt ataaaccaaa tacctggtgt atacgttgtc tttggagcac 6300

aaaaccagtt gaaacatcaa tttcgtttga tgtactgagg tcggaggacg cgcagggaat 6360

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acttaaacca gcaaataata gtttaaaaat tacagaagag gttggccaca cagatctaat 6540

ggctgcttat gtagacaatt ctagtcttac tattaagaaa cctaatgaat tatctagagt 6600

attaggtttg aaaacccttg ctactcatgg tttagctgct gttaatagtg tcccttggga 6660

tactatagct aattatgcta agccttttct taacaagctt gtcgcnctaa caaccaacat 6720

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gctacaattg tgtactttta ctagaagtac cacttctaga attaaagcat ctatgccgac 6840

tactatagca aagaatactg ttaagagtgt cggtaaattt tgtctagagg cttcatttaa 6900

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tttaggcgtg ccttcttact gtactggtta cagagaaggc tatttgaact ctactaatgt 7080

cactattgca acctactgta ctggttctat accttgtagt gtttgtctta gtggtttaga 7140

ttctttagac acctatcctt ctttagaaac tatacaaatt accatttcat cttttaaatg 7200

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gtttttctat gtacttggat tggctgcaat catgcaattg tttttcagct attttgcagt 7320

acattttatt agtaattctt ggcttatgtg gttaataatt aatcttgtac aaatggcccc 7380

gatttcagct atggttagaa tgtacatctt ctttgcatca ttttattatg tatggaaaag 7440

ttatgtgcat gttgtagacg gttgtaattc atcaacttgt atgatgtgtt acaaacgtaa 7500

tagagcaaca agagtcgaat gtacaactat tgttaatggt gttagaaggt ccttttatgt 7560

ctatgctaat ggaggtaaag gcttttgcaa actacacaat tncggttgtg ttaattgtga 7620

tacattctgt gctggtagta catttattag tgatgaagtt gcgagagact tgtcactaca 7680

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agcgtctgtt tactacagtc agcttatgtg tcaacctata ctgttactag atcaggcatt 7980

agtgtctgat gttggtgata gtgcggaagt tgcagttaaa atgtttgatg cttacgttaa 8040

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atggtttagt cagcgtggtg gtagttatac taatgacaaa gcttgcccat tgattgctgc 8820

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aactaatggt gactttttgc atttcttacc tagagttttt agtgcagttg gtaacnatag 8940

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tgctgaatgt acaattttta aagatgcttc tggtaagcca gtaccatatt gttatgatac 9060

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atttattggt gctttggaca tatcagcatc tatagtagct ggtggtattg tagctatcgt 9420

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tactaatgat gtttcttttt tagcacatat tcagtggatg gttatgttca cacctttagt 9660

acctttctgg ataacaattg cttatatcat ttgtatttcc acaaagcatt tctattggtt 9720

ctttagtaat ntcctaaaga gacgtgtagt ctttaatggt gtttccttta gtacttttga 9780

agaagctgcg ctgtgcacct ttttgttaaa taaagaaatg tatctaaagt tgcgtagtga 9840

tgtgctatta cctcttacgc aatataatag atacttagct ctttataata agtacaagta 9900

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tgagggttgt atggtacaat taacttgtgg tacaactaca cttaacggtc tttggcttga 10140

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ttatgaagat ttactcattc gtaagtctaa tcataatttc ttggtacagg ctggtaatgt 10260

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actcgtttat aaagtttatt atggtaatgc tttagatcaa gccatttcca tgtgggctct 11460

tataatctct gttacttcta actactcagg tgtagttaca actgtcatgt ttttggccag 11520

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tgttcccttg aacataatac ctcttacaac agcagccaaa ctaatggttg tcataccaga 12480

ctataacaca tataaaaata cgtgtgatgg tacaacattt acttatgcat cagcattgtg 12540

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ggacaattca cctaatttag catggcctct tattgtaaca gctttaaggg ccaattctgc 12660

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tgcaacagaa gtgcctgcca attcaactgt attatctttc tgtgcatttg ctgtagatgc 13080

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gatgttgtac gnncacactg gtactggtca ggcaataaca gttacaccgg gagccaatat 13200

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tgctaatgac cctgtgggtt ttacacttaa aaacacagtc tgtaccgtct gcggtatgtg 13380

gaaaggttat ggctgtagtt gtgatcaact ccgcgaaccc atgcttcagt cagctgaagc 13440

acaatcgttt ttaaacgggt ttgcggtgta agtgcagccc gtcttacacc gtgcggcaca 13500

ggcactagta ctgatgtcgt atacagggct tttgacatct acaatgataa agtagctggt 13560

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ttaattgatt cttactttgt agttaagaga cacactttct ctaactacca acatgaagaa 13680

acaatttata atttacttaa ggattgtcca gctgttgcta aacatgactt ctttaagttt 13740

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ttttacgcat gtttgcgtaa acatttctca atgatgatac tctctgacga tgctgttgtg 15720

tgtttcaata gcacttatgc atctcaaggt ctagtggcta gcataaagaa ctttaagtca 15780

gttctttatt atcaaaatca tgtttttatg tctgaagcaa aatgttggac tgagactgac 15840

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gattatgtgt accttcctta cccagatcca tcaagaatcc taggggccgg ctgttttgta 15960

gatgatatcg taaaaacaga tggtacactt atgattgaac ggttcgtgtc tttagctata 16020

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catgtcatat caacatcaca taaattagtc ttgtctgtta atccgtatgt ttgcaatgct 16380

ccaggttgtg atgtctgtga tgtgactcaa ctttacttag gaggtatgag ctattattgt 16440

aaatcacata aaccacccat tagttttcca ttgtgtgcta atggacaagt ttttggttta 16500

tataaaaata catgtgttgg tagcgataat gttactgact ttaatgcaat tgcaacatgt 16560

gactggacaa atgctggtga ttacatttta gctaacacct gtactgaaag actcaagctt 16620

tttgcagcag aaacgctcaa agctactgag gagacattta aactgtctta tggtattgct 16680

actgtacgtg aagtgctgac tgacagagaa ttacatcttt catgggaagt tggtaaacct 16740

agaccaccac ttaaccgaaa ttatgtcttt actggttatc gtgtaactaa aaacagtaaa 16800

gtacaaatag gagagtacac ctttgaaaaa ggtgactatg gtgatgctgt tgtttaccga 16860

ggtacaacaa cttacaaatt aaatgttggt gattattttg tgctgacatc acatacagta 16920

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tacccaacac tcaatatctc agatgagttt tctagcaatg ttgcaaatta tcaaaaggtt 17040

ggtatgcaaa agtattctac actccaggga ccacctggta ctggtaagag tcattttgct 17100

attggcctag ctctctacta cccttctgct cgcatagtgt atacagcttg ctctcatgcc 17160

gctgttgatg cactatgtga gaaggcatta aaatatttgc ctatagataa atgtagtaga 17220

attatacctg cacgtgctcg tgtagagtgt tttgataaat ccaaagtgaa ttcaacatta 17280

gaacagtatg tcttttgtac tgtaaatgca ttgcctgaga cgacagcaga tatagttgtc 17340

tttgatgaaa tttcaatggc cacaaattat gatttgagtg ttgtcaatgc cagattacgt 17400

gctaagcgct atgtgtacat tggcgaccct gctcaattac ctgcaccacg cacattgcta 17460

actaagggca cactagaacc agaatatttc aattcagtgt gtagacttat gaaaactata 17520

ggtccagaca tgttcgaagg aacttgtcgg cgttgtcctg ctgaaattgt tgacactgtg 17580

agtgctttgg tttatgataa taagcttaaa gcacataaag acaaatcagc tcaatgcttt 17640

aaaatgtttt ataagggtgt tatcacgcat gatgtttcat ctgcaattaa caggccacaa 17700

ataggcgtgg taagagaatt ccttacacgt aaccctgctt ggagaaaagc tgtctttatt 17760

tcaccttata attcacagaa tgctgtagcc tcaaagattt tgggactacc aactcaaact 17820

gttgattcat cacagggctc agaatatgcg nngcncatat tcactcaaac cactgaaaca 17880

gctcactctt gtaatgtaaa cagatttaat gttgctatta ccagagcaaa agtaggcata 17940

ctttgcataa tgtctgatag agacctttat gacaagttgc aatttacaag tcttgaaatt 18000

ccacgtagga atgtggcaac tttacaagct gaaaatgtaa caggactttg taaagattgt 18060

agtaaggtaa tcactgggtt acatcctaca caggcaccta cacacctcag tgttgccact 18120

aaattcaaaa ctgaaggttt atgtgttgac atacctggca tacctaagga catgacctat 18180

agaagactca tctccctgat gggttttaaa atgaattatc aagttaatgg ttaccctaac 18240

atgtttatca cccgcgaaga agctataaga catgtacgtg catggattgg cttcgatgtc 18300

gaggggtgtc atgctactag agaagctgtt ggtaccaatt tacctttaca gctaggtttt 18360

tctacaggng ttaacctagt tgctgtacct acaggttatg ttgatacacc taataataca 18420

gatttttcca gagttagtgc taaaccaccg cctggagatc aatttaaaca cctcatacca 18480

cttatgtaca aaggacttcc ttggaatgta gtgcgtataa agattgtaca aatgttaagt 18540

gacacactta aaaatctctc tgacagagtc gtatttgtct tatgggcaca tggctttgag 18600

ttgacatcta tgaagtattt tatgaaaata ggacctgagc gcacctgttg tctatgtgat 18660

agacgtgcca catgcttttc cactgcttca gacacttatg cctgatggca tcattctatt 18720

ggatttgatt acgtctataa tccgtttatg attgatgttc aacaatgggg ttttacaggt 18780

aacctacaaa gcaaccatga tctgtattgt caagtccatg gtaatgcaca tgtagctagt 18840

tgtgatgcaa tcatgactag gtgtctagct gtccacgagt gctttgttaa gcgtgttgac 18900

tggactattg aatatcctat aattggtgat gaactgaaga ttaatgcggc ttgtagaaag 18960

gttcaacaca tggttgttaa agctgcatta ttagcagaca aattcccagt tcttcacgac 19020

attggtaacc ctaaagctat taagtgtgta cctcaagctg atgtagaatg gaagttctat 19080

gatgcacagc cttgtagtga caaagcttat aaaatagann ncatnttcta ttcttatgcc 19140

acacattctg acaaattcac agatggtgta tgcctatttt ggaattgcaa tgtcgataga 19200

tatcctgcta attccattgt ttgtagattt gacactagag tgctatctaa ccttaacttg 19260

cctggttgtg atggtggcag tttgtatgta tataaacatg cattccacac accagctttt 19320

gataaaagtg cttttgttaa tttaaaacaa ttaccatttt tctattactc tgacagtcca 19380

tgtgagtctc atggaaaaca agtagtgtca gatatagatt atgtaccact aaagtctgct 19440

acgtgtatta cacgttgcaa tttaggtggt gctgtgtggt aacatcatgc taatgagtac 19500

agattgtatc tcgatgctta taacatgatg atctcagctg gctttagctt gtgggtttac 19560

aaacaatttg atacttataa cctctggaac acttttacaa gacttcagag tttagaaaat 19620

gtggctttta atgttgtaaa taagggacac tttgatggac aacagggtga agtaccagtt 19680

tctatcatta ataacactgt ttacacaaaa gttgatggtg ttgatgtaga attgtttgaa 19740

aataaaacaa cattgtgtgt taatgtagca tttgagcttt gggctaagcg caacattaaa 19800

ccagtaccag aggtgaaaat actcaataat ttgggtgtgg acattgctgc taatactgtg 19860

atctgggact acaaaagaga tgctccagca catatatcta ctattggtgt ttgttctatg 19920

actgacatag ccaagaaacc aactgaaacg atttgtgcac cactcactgt cttttttgat 19980

ggtagagttg atggtcaagt agacttattt agaaatgccc gtaatggtgt tcttattaca 20040

gaaggtagtg ttaaaggttt acaaccatct gtaggtccca aacaagctag tcttaatgga 20100

gtcacattaa ttggagaagc cgtaaaaaca cagttcaatt attataagaa agttgatggt 20160

gttgtccaac aattacctga aacttacttt actcagagta gaaatttaca agaatttaaa 20220

cccaggagtc aaatggaaat tgatttctta gaattagcta tggatgaatt cattgaacgg 20280

tataaattag aaaanttaac cttcgaacat atcgtttatg gagattttag tcatagtcag 20340

ttaggtggtt tacatctact gattggacta gctaaacgtt ttaaggaatc accttttgaa 20400

ttagaagatt ttattcctat ggacagtaca gttaaaaact atttcataac agatgcgcaa 20460

acaggttcat ctaagtgtgt gtgttctgtt gttgatttat tacttgatga ttttgttgaa 20520

ataataaaat nacangattt atctgtagtt tctaaggttg tcaaagtgac tattgactat 20580

acagaaattt catttatgct ttggtgtaaa gatggccatg tagaaacatt ttacccaaaa 20640

ttacaatcta gtcaagcgtg gcaaccgggt gttgctgtgc ctaatcttta caaaatgcaa 20700

agaatgctat tagaaaagtg tgaccttcaa aattatggtg atagtgcaac attacctaaa 20760

ggcataatga tgaatgtcgc aaaatatact caactgtgtc aatacttaaa cacattaaca 20820

ttagctgtac cctataatat gagagttata cattttggtg ctggttctga taaaggagtt 20880

gcaccaggta cagctgtttt aagacagtgg ttgcctacgg gtacgctgct tgtcgattca 20940

gatcttaatg actttgtctc tgatgcagat tcaactttga ttggtgattg tgcaactgta 21000

catacagcta ataaatggga tctcattatt agtgatatgt acgaccctaa gactaaaaat 21060

gttacaaaag aaaatgactc taaagagggt tttttcactt acatttgtgg gtttatacaa 21120

caaaaactag ctcttggagg ttccgtggct ataaagataa cagaacattc ttggaatgct 21180

gatctttaga agctcatggg acacttcgca tggtggacag cctttgttac taatgtgaat 21240

gcgtcatcat ctgaagcatt tttaattgga tgtaattatc ttggcaaacc acgcgaacaa 21300

atagatggtt atgtcatgca tgcaaattac atattttgga ggaatacaaa tccaattcag 21360

ttgtcttcct attctttatt tgacatgagt aaatttcccc tnantgttag gggtactgct 21420

gttatgtctt taaaagaagg tcaaatcaat gatatgattt tatctcttct tagtaaaggt 21480

agacttataa ttagagaaaa caactgattt gttatttcta gtgatgttct tgctaacaac 21540

taaacgaaca atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa 21600

tcttacaacc agaactcaat tacaccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta 21660

ttaccctgac aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc 21720

tttcttttcc aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa 21780

gaggtttgat taccctgtcc taccatttga tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa 21840

gtctaacata ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct 21900

acttattgtt aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa 21960

tgatccattt ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt 22020

cagagtttat tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat 22080

ggaccttgaa ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat 22140

tgatggttat tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc 22200

tcagggtttt tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag 22260

gtttcaaact ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg 22320

ttggacagct ggtgctgctg cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt 22380

aangtataat gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc 22440

agaaacaaag tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa 22500

ctttagagtc caaccaacag aatctgcnna tagatttcct aatattacaa acttgtgccc 22560

ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag 22620

aatcagcaac tgngttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt 22680

tcagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc 22740

agattcattt gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa 22800

gattgctgat tattattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa 22860

ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg tgatgattcn tacctgtata gattgtttag 22920

gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag 22980

cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt 23040

ccaacccact aatggtgttg gtgaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact 23100

tctacatgca ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa 23160

atgtgtcaat ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa 23220

aaagtttctg cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg 23280

aaacccacag acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtga 23340

tgnggcacca ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg 23400

cacagaagtc cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc 23460

tacaggttct aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa 23520

caactcccag gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca 23580

gactaattct cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat 23640

gtcacttggt gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa 23700

ttttactatt agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga 23760

ttgtagcnng tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg 23820

cagtttttgt acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa 23880

cacccaagaa gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt 23940

tggtggtttt aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt 24000

tattgaagat ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata 24060

tggtgattgc cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtggacaaa agtttaacgg 24120

ccttactgtt ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact 24180

gttagcgggt acaatcactt ctggttggac ctttggtgcg ggtgctgcat tacaaatnnc 24240

ntttgcanng ngcatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttcagtc 24300

cgagaaccaa aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc 24360

actttcttcc acagagngac attttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca 24420

agctttaaac acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt 24480

aaatgatatc ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat 24540

cacaggcaga cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga 24600

aatcagagct tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc 24660

aaaaagagtt gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agccagcacc 24720

tcatggtgta gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac 24780

tgctcctgcc atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc 24840

aaatggcaca cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac 24900

agacaacaca tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt 24960

ttatgatcct ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa 25020

gaatcacaca tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt 25080

aaacattcaa aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct 25140

catcgatctc caagagcctg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg 25200

gctaggtttt atggctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat 25260

gaccagttgc tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga 25320

tgaagacgac tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aaacgaactt 25380

atggatttgt ttatgagaat cttcacaatt ggaactgtaa ctttgaagca aggtgaaatc 25440

aaggatgcta ctccttcaga ttttgttcgc gctactgcaa cgataccgat acaagcctca 25500

ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca gagcgcttcc 25560

aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt tcactttgtt 25620

tgcgacttgc tgttgttgtt tgtaacagtt tactcacacc ttttgctcgt tgctgctggc 25680

cttgaagccc cttttctcta tctttatgct ttagtctact tcttgcagag tataaacttt 25740

gtaagaataa taatgaggct ttggctttgc tggaaatgcc gttccaaaaa cccattactt 25800

tatgatgcca actattttct ttgctggcat actaattgtt acgactattg tataanttac 25860

aatagtgtaa cttcttcaat tgtcattact tcaggtgatg gcacaacaag tcctatttct 25920

gaacatgact accagatggg tggttatact gaaaaatggg aatctggagt aaaagactgt 25980

gttgtgngac acagttactt cacttcagac tattaccagc tgtactcaac tctatngagt 26040

acagacactg gtgttgaaca tgttaccttc ttcatctaca cnnagattgt tgatgagcct 26100

gaagaacatg tccaaattca cacaatcgac ggttcatccg gagttgttaa tccagtaatg 26160

gaaccaattt atgatgaacc gacgacgact actagcgtgc ctttgtaanc acaagctgat 26220

gagtacgaac ttatgtactc attcgtttcg ggagagacag gtacgttaat agttaatagc 26280

gtacttcttt ttcttgcttt cgtggtattc ttgctagtta cactagccat ccttactgcg 26340

cttcgattgt gtgcgtactg ctgcaatatt gttaacgtga gtcttgtaaa accttctttt 26400

tacgtttact ctcgtgttaa aaatctgaat tcttctagag ttcctgatct tctggtctaa 26460

acgaactaaa tgntanatta gtttttctgt ttggaacttt aattttagcc ttggcagatt 26520

ccaacggtac atgtaccgtt gaagagctna gcaagctcct tgaacaatgg aacctagcnn 26580

cnnnattcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc aacaggaata 26640

ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta actttagctt 26700

gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt gctatcgcaa 26760

tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc agactgtttg 26820

cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc aacgtgccac 26880

tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc ggagctgtga 26940

tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac atcaaggacc 27000

tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa ttgggagctt 27060

cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg attggcaact 27120

ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt gtacagtaag 27180

tgacaacaga tgtttcatct cgttgacttt caggttacta tagcagagat attactaatt 27240

attatgagga cttttaaagt ttccatttgg aatcttgatt acatcataaa cctcataatt 27300

aaaaatttat ctaagtcact aactgagaan nacanttctc aattagatga agagcaacca 27360

atggagattg attaaacgaa catgaaaatt attcttttct tggcactgat aacactcgct 27420

acttgtgagc tttatcacta ccaagagtgt gttagaggta caacagtact tttaaaagaa 27480

ccttgctctt ctggaacata cgagggcaat tcaccatttc atcctctagc tgataacaaa 27540

tttgcactga cttgctttag cactcaattt gcttttgctt gtcctgacgg cgtaaaacac 27600

gtctatcagt tacgtgccag atcagtttca cctaaactgt tcatcagaca agaggaagtt 27660

cangaacttt actctccaat ttttcttatt gttgcggcaa tagtgttncn aacactttgc 27720

ttcacactca aaagaaagac agaatgattg aactttcatt aattgacttc tatttgtgct 27780

ttttagcctt tctgctattc cttgttttaa ttatgcttat tatcttttgg ttctcacttg 27840

aactgcaaga tcataatgaa acttgtcacg cctaaacgaa catgaaattt cttgttttct 27900

taggaatcat cacaactgta gctgcatttc accaagaatg tagtttacag tcatgtactc 27960

aacatcaacc atatgtagtt gatgacccgt gtcctattca cttctattct aaatggtata 28020

ttagagtagg agctagaaaa tcagcacctt taattgaatt gtgcgtggat gaggctggtt 28080

ctaaatcacc cattcagtac atcgatatcg gtaattatac agtttcctgt tcacctttta 28140

caattaattg ccaggaacct aaattgggta gtcttgtagt gcgttgttcg ttctatgaag 28200

actttttaga gtatcatgac gttcgtgttg ttttagattt aatctaaacg aacaaactaa 28260

aatgtctgat aatggacccc aaaatcagcg aaatgcaccc cgcattacgt ttggtggacc 28320

ctcagattca actggcagta accagaatgg agaacgcagt ggggcgcgat caaaacaacg 28380

tcggccccaa ggtttaccca ataatactgc gtcttggttc accgctctca ctcaacatgg 28440

caaggaagac cttaaattcc ctcgaggaca aggcgttcca attaacacca atagcagtcc 28500

agatgaccaa attggctact accgaagagc taccagacga attcgtggtg gtgacggtaa 28560

aatgaaagat ctcagtccaa gatggtattt ctactaccta ggaactgggc cagaagctgg 28620

acttccctat ggtgctaaca aagacggcat catatgggtt gcaactgagg gagccttgaa 28680

tacaccaaaa gatcacattg gcacccgcaa tcctgctaac aatgctgcaa tcgtgctaca 28740

acttcctcaa ggaacaacat tgccaaaagg cttctacgca gaagggagca gaggcggcag 28800

tcaagcctct tctcgttcct catcacgtag tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg 28860

cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat ggctggcaat ggcggtgatg ctgctcttgc 28920

tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa atgtctggta aaggccaaca 28980

acaacaaggc caaactgtca ctaagaaatc tgctgctgag gcttcgagca agcctcggca 29040

aaaacgtact gccactaaag catacaatgt aacacaagct ttcggcagac gtggtccaga 29100

acaaacccaa ggaaattttg gggaccagga actaatcaga caaggaactg attacaaaca 29160

ttggccgcaa attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat 29220

tggcatggaa gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga 29280

tgacaaagat ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgcata 29340

caaaacattc ccaccaacag agcctaaaaa ggacaaaaag aagaaggctg atgaaactca 29400

agccttaccg cagagacaga agaaacagca aactgtgact cttcttcctg ctgccgattt 29460

ggatgatttc tccaaacaat tgcaacaatc catgagcagt gctgactcaa ctcaggccta 29520

aactcatgca gaccacacaa ggcagatggg ctatataaac gttttcgctt ttccgtttac 29580

gatatatagt ctactcttgt gcagaatgaa ttctcgtaac tacatagcac aagtagatgt 29640

agttaacttt aatctcacat agcaatcttt aatcagtgtg taacattagg gaggacttga 29700

aagagccacc acattttcac cgaggccacg cggagtacga tcgagtgtac agtgaacaat 29760

gctagggaga gctgcctata tggaagagcc ctaatgtgta aaattgattt tagtagtgct 29820

atccccctct gattttnatg gccatg 29846

Claims (6)

1.一种基因芯片，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述基因芯片包含29846组探针，每组探针包含8条长度为25bp的探针，这8条探针覆盖所述SARS-CoV-2基因组的同一区段，每组探针中的第一探针与所述SARS-CoV-2基因组的该区段完全相同，第二探针、第三探针和第四探针与所述第一探针仅在一个特定位点处不同且在该特定位点处分别为A、T、C、G中其余三种碱基，第五探针、第六探针、第七探针、第八探针分别与所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针完全互补，各组探针中的所述特定位点对应所述SARS-CoV-2基因组中的不同位点且所有所述特定位点全面覆盖了所述SARS-CoV-2基因组的第13-29858位，所述特定位点是所述探针中的第13位。

2.如权利要求1所述的基因芯片，其中所述基因芯片是原位合成基因芯片。

3.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的基因芯片。

4.一种方法，其能够用于检测是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列，所述方法包括以下步骤：

(1)对待检测的实验样本进行RNA提取、逆转录、扩增、荧光标记以及片段化；

(2)使步骤(1)的产物与如权利要求1或2所述的基因芯片杂交，

(3)基于所述基因芯片上的探针与所述步骤(1)的产物的杂交信号，确定所述待检测的实验样本中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2以及，如果存在的话，测定SARS-CoV-2的基因组序列。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述步骤(1)的产物的长度为30-70bp，优选地40-60bp，更优选地45-55bp。

6.如权利要求1或2所述的基因芯片或如权利要求3所述的试剂盒或如权利要求4或5所述的方法用于冠状病毒亚科内的新病毒预警的用途。

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