CN109294916A - 一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法 - Google Patents

一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于菌种保藏技术领域，尤其涉及一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。利用该保藏剂对基因工程菌进行保藏的方法是将菌种保藏剂放入厌氧管中通氮气排氧后高温灭菌；基因工程菌培养至对数生长期，取新鲜菌液等体积与无菌厌氧菌种保藏剂混合，此过程通氮气排氧后置于‑20℃或‑80℃下冷冻保藏。厌氧冷冻保藏方法能够达到严格厌氧，最大限度降低菌种的基础代谢水平，复苏率高，解决了基因工程菌质粒易丢失的问题，能够保证复壮后的基因工程菌高效维持外源DNA片段相应的功能。

Description

一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的 方法
技术领域
本发明属于菌种保藏技术领域，尤其涉及一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。
背景技术
菌种保藏在微生物研究及实际应用中必不可少，由于微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在长时间内使其不发生变异而又能够保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所述菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
低温冷冻保藏是菌种保藏最直接、最简单也是最常用的方法之一，具有保存费用低、不容易发生变异、操作简单、保存时间长等优点。其中保藏剂对于微生物的存活率有较大的影响，能够在保藏过程中保护菌体细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，减低细胞受到的生理损伤。
基因工程菌株中含有由载体质粒等携带的外源DNA片段，这些片段通常是遗传不稳定的，在传代过程中很容易丢失其外源质粒复制子，在菌种保藏和复壮阶段也很容易因丢失外源质粒而影响基因工程菌株的相关功能。
发明内容
为解决基因工程菌在超低温保藏和菌种复壮过程中容易丢失外源质粒复制子的问题，本发明提供了一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。
本发明的技术方案：
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。
进一步的，所述保藏剂还含有0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。
进一步的，所述低温保护剂为甘油、DMSO或丙三醇中的一种。
进一步的，所述抗生素选择剂为卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素中的一种或几种的组合。
进一步的，所述卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂。
进一步的，所述分散剂由3～5份脱脂牛奶和2～3份低聚糖组成。
进一步的，所述低聚糖为海藻糖、蔗糖或麦芽糖中的一种。
一种利用本发明所述菌种保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法，所述方法步骤如下：
步骤一、将菌种保藏剂放入厌氧管中，向厌氧管中通一定时间氮气后，盖上厌氧管的塞子和盖子，121℃高温灭菌20min待用；
步骤二、将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，在通氮气的情况下用将步骤一得到的无菌厌氧菌种保藏剂加入装有新鲜菌液的厌氧管中，向此厌氧管中通一定时间氮气，盖上塞子和盖子，置于-20℃或-80℃下冷冻保藏。
进一步的，步骤一和步骤二中向厌氧管中通氮气的时间均为10～15min。
进一步的，所述新鲜菌液与菌种保藏剂的体积比为1:1。
本发明的有益效果：
一、本发明提供的菌种保藏剂中含有低浓度的抗生素选择剂，提供了有利于携带质粒的基因工程菌细胞群体维持稳定的生长选择压，可以帮助维持质粒复制与染色体复制的协调，保证基因工程菌在超低温保藏和菌种复壮过程中维持由载体质粒携带的外源DNA片段的遗传稳定性，能够有效防止质粒的丢失。
二、本发明提供的菌种保藏剂通过低温保护剂产生的氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定基因工程菌细胞成分的构型，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。低聚糖和脱脂牛奶等则可为细胞提供能量，防止其衰亡，使细胞可以长时间维持生命活力，延长保藏期。
三、本发明提供的厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法，使菌种保藏剂和保藏过程都能够达到严格厌氧，最大限度地降低菌种的基础代谢水平，对有氧、严格厌氧或兼性厌氧的基因工程菌都能起到良好的保护作用，能够保护基因工程菌质粒稳定，复苏率高，并且既可以用于菌种的-20℃的冷冻保藏，也可用于-80℃的超低温冷冻保藏，有效延长菌种的保藏期达十年以上。
四、本发明提供的保藏方法操作简便，储存方便，细菌生存期长，-80℃保藏1年后复壮的菌体成活率高达96％，复壮后的基因工程菌仍能够保有外源DNA片段相应的功能。一株高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌应用本发明菌种保藏剂和保藏方法在-80℃保藏1年后，复壮的菌株发酵生产丙酮酸的产量较保藏前仅下降了5％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。
实施例2
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂、5～8份分散剂和0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。
实施例3
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、3～5份脱脂牛奶、2～3份低聚糖和0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。
实施例4
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：60份甘油、3份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、3份脱脂牛奶、2份海藻糖和0.2份的谷氨酸钠。
实施例5
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：70份DMSO、5份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、4份脱脂牛奶、3份蔗糖和0.3份的L-半胱氨酸。
实施例6
一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：80份丙三醇、4份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、5份脱脂牛奶、3份麦芽糖和0.4份的L-半胱氨酸。
上述实施例中使用的抗生素卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂，具体加入卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素哪一种取决于基因工程菌携带的质粒的选择性，可根据实际情况进行调整。
实施例7
利用实施例6制备的菌种保藏剂对一株高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌进行菌种保藏，其中使用的抗生素选择剂为浓度为23mg/L氨苄青霉素和氯霉素各2份，具体方法步骤如下：
步骤一、将菌种保藏剂放入厌氧管中，向厌氧管中通10～15min氮气后，盖上厌氧管的塞子和盖子，121℃高温灭菌20min待用；
步骤二、将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，在通氮气的情况下用针筒和针头将步骤一得到的无菌厌氧菌种保藏剂加入装有新鲜菌液的厌氧管中，所述新鲜菌液与菌种保藏剂的体积比为1:1，向此厌氧管中通10～15min氮气，盖上塞子和盖子，混匀后置于-20℃下冷冻保藏。
对比例1
使用实施例6制备的菌种保藏剂对与实施例7一样的高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌进行菌种保藏，其中使用的抗生素选择剂为浓度为23mg/L氨苄青霉素和氯霉素各2份，本对比例对菌种保藏剂不进行厌氧处理，直接将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，再将与新鲜菌液等体积的菌种保藏剂加入厌氧管，不做通氮气排氧的操作直接盖上塞子和盖子，混匀后置于-20℃下冷冻保藏。
一、复壮存活率及基因工程菌功能验证试验
将实施例7培养的高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌培养液，在菌种保藏前进行菌落计数，培养液稀释至10-7时，涂布平板的平均菌落数为26个；对此大肠杆菌基因工程菌进行常规发酵培养，得到丙酮酸产量为65g/L；经实施例7菌种保藏方法-20℃冷冻保藏一年后，进行常温复壮，传代3代后，用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，对培养液进行菌落计数，培养液稀释至10-7时，涂布平板的平均菌落数为24.5个，采用实施例7菌种保藏方法-20℃保藏1年后，复壮的大肠杆菌基因工程菌菌体成活率高达94％；对此大肠杆菌基因工程菌进行常规发酵培养，得到丙酮酸产量为60g/L，复壮的菌株发酵生产丙酮酸的产量较保藏前仅下降了7％。这说明基因工程菌携带的外源基因仍能高效的发挥其功能，没有在菌种保藏和复壮过程中发生丢失。
而采用对比例1保藏方法进行-20℃保藏1年后的高产丙酮酸大肠杆菌基因工程菌的复壮成活率为80％，复壮后的菌株丙酮酸产量为52g/L，较保藏前菌株的丙酮酸产量下降了20％。由此可知，本发明提供的厌氧冷冻保藏方法能够更高效的保持菌种的生物活性，更重要的是可以防止基因工程菌中由载体质粒等携带的外源DNA片段的丢失，保证基因工程菌的相应功能不因超低温菌种保藏而下降。
二、稳定性验证试验
将采用实施例7和对比例1厌氧冷冻和正常冷冻方法分别保藏1年的高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌进行复壮，分别传代10代后，用LB培养基37℃培养过夜，对培养液进行菌落计数，培养液稀释至10-7时，涂布平板的平均菌落数分别为24个和21个，菌体成活率为92％和80％。这两种复壮后传至10代的大肠杆菌基因工程菌进行常规发酵培养，采用实施例7厌氧冷冻保藏并复壮的菌种发酵得到丙酮酸产量为61g/L，复壮的菌株丙酮酸较保藏前仅下降了6％；采用对比例1正常冷冻保藏并复壮的菌种发酵得到丙酮酸产量为45g/L，复壮的菌株丙酮酸较保藏前仅下降了30％，由此对比可知，使用厌氧处理的保藏剂和厌氧处理保藏过程的低温冷冻保藏可以更好的维持基因工程菌中外源DNA的稳定性，经多次传代仍不会发生丢失。

Claims (10)

1.一种菌种保藏剂，其特征在于，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。
2.根据权利要求1所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述保藏剂还含有0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。
3.根据权利要求1或2所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述低温保护剂为甘油、DMSO或丙三醇中的一种。
4.根据权利要求3所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述抗生素选择剂为卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求4所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂。
6.根据权利要求5所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述分散剂由3～5份脱脂牛奶和2～3份低聚糖组成。
7.根据权利要求6所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述低聚糖为海藻糖、蔗糖或麦芽糖中的一种。
8.一种利用权利要求1-7任一所述菌种保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
步骤一、将菌种保藏剂放入厌氧管中，向厌氧管中通一定时间氮气后，盖上厌氧管的塞子和盖子，121℃高温灭菌20min待用；
步骤二、将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，在通氮气的情况下将步骤一得到的无菌厌氧菌种保藏剂加入装有新鲜菌液的厌氧管中，向此厌氧管中通一定时间氮气，盖上塞子和盖子，置于-20℃或-80℃下冷冻保藏。
9.根据权利要求8所述一种利用菌种保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程均的方法，其特征在于，步骤一和步骤二中向厌氧管中通氮气的时间均为10～15min。
10.根据权利要求8或9所述一种利用菌种保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程均的方法，其特征在于，所述新鲜菌液与菌种保藏剂的体积比为1:1。
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