CN101857843A - 诱导提高生防酵母对果实病害防治效力方法及所用培养基 - Google Patents
诱导提高生防酵母对果实病害防治效力方法及所用培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，包括活化培养基和种子培养基，活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、琼脂20g和几丁质1～50g，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCA活化培养基；种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和几丁质1～50g，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCB种子培养基。本发明还同时公开了利用上述培养基进行的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，包括对罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590进行活化和液体培养等步骤。
Description
技术领域
本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域。
背景技术
传统上，国内外对果实采后病害的控制主要依赖于杀菌剂。但是，随着人们对食品安全和环境保护意识的不断增强，化学杀菌剂的使用范围和剂量受到了越来越严格的限制。在欧美发达国家，许多高效但存在食品安全和环境污染隐患的化学杀菌剂被禁止使用。因此，研究、开发能替代化学杀菌剂的方法和技术具有重大的社会意义和广阔的应用前景。
在众多被研究的可能替代化学杀菌剂的方法中，利用拮抗微生物，特别是拮抗酵母抑制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外最为关注的新型采后病害控制方法之一(Droby等，2009)。这主要是由于酵母具有遗传稳定、抑菌谱广、效价高、一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物、安全性高等特点；且其对营养要求低，生长快；并有对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，并能与多种其它化学和物理处理相容。
但目前国内外已报道，甚至已商业化开发的拮抗酵母对果实病害的控制效力与化学杀菌剂相比还存在差距(Droby等，2009)。而且由于国内外研究的果实病害生防酵母均为非模式酵母，其遗传背景信息大多不明确，对其生防生理代谢的研究也尚少，严重限制了定向提高果实生防酵母活性技术的发展。
几丁质，又称甲壳素，广泛分布于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼，节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。几丁质不仅资源丰富，而且具有多种重要的生物学特性，因此几丁质的开发利用深受国内外的关注。一般认为，细菌细胞壁主要由肽聚糖等成分组成，丝状真菌细胞壁的主要成分是几丁质，而酵母细胞壁的主要是由β-葡聚糖(约占细胞壁干重35-60％)和几丁质(约占细胞壁干重1.5-6％)等成分组成。
中国发明专利(专利号03135134.4，一种防治植物寄生线虫的生防制剂)显示与含有几丁质等成分的物质混合后，能提高中华轮枝菌对防治植物寄生线虫的效果。中国发明专利(专利号：ZL200410075042.8，海洋小单孢菌抗菌活性物质发酵促进剂)将几丁质作为用于海洋小单孢菌(一种放线菌)抗菌活性物质发酵促进剂，可提高对枯草芽孢杆菌和念珠菌的抗菌效价。中国发明专利(专利号200510039128.X，一种抗灰霉病的生物杀菌剂及其制备方法)通过含几丁质等培养基培养木霉菌，可防治植物的灰霉病。此外，中国国家发明申请号：200710057189.8(一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法)公开了一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法。该方法在绿色木霉孢子培养后，与含有几丁质等物质混和，可以提高对蔬菜灰霉病、白粉病等的防治效果，提高绿色木霉在植株的定殖能力。中国国家发明申请号：200710300087.4(一种防治烟草黑胫病的菌株及其菌剂)公开了一种以0.8～2.0％胶体几丁质为碳源培养淡紫拟青霉的方法，通过该方法可提高其对烟草黑胫病的防治能力。此外，中国发明专利(专利号ZL200510090063.1，一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基)还公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方，该培养基由柠檬酸、大豆蛋白胨、硫酸锰、氯化钙和水组成。
但是，目前还没有专门用于诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基。
参考文献：
Droby S.，Wisniewski M.，Macarisin D.，Wilson C.2009.Twenty years of postharvestbiocontrol research：Is it time for a new paradigm？Postharvest Biology and Technology 52：137-145.(爵劳比等，2009，20年采后生物防治研究：采后生物学和技术，52：137-145.)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，以及利用该培养基进行的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，包括活化培养基和种子培养基；
活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、琼脂20g和几丁质1～50g，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCA活化培养基；
种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和几丁质1～50g(较优为1～20g)，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCB种子培养基。
本发明还同时提供了利用上述培养基进行的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，生防酵母为罗伦隐球酵母，其保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590；依次进行以下步骤：
1)、活化：
①、罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在NYCA活化培养基中25～28℃培养46～50小时，然后在相同条件下重复传代培养2次；
②、将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYCB种子培养基中，于150～200rpm、25～28℃的条件下培养22～26小时；然后在上述相同条件下重复培养1次；
2)、液体培养：
将步骤1)活化所得的酵母按照5％重量比的接种量接到NYCB种子培养基中，于150～200rpm、25～28℃的条件下培养24～144小时。
作为本发明的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法的改进：将步骤2)液体培养后的所得物依次进行以下步骤：
离心分离：
将步骤2)液体培养后的所得物在3000rpm离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗以去除培养介质；
悬浮和确定浓度：
用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，并用无菌蒸馏水调整到细胞浓度为1×106细胞/毫升～1×109细胞/毫升。
本发明利用几丁质作为拮抗酵母活性激发子，从而来诱导培养获得对果实病害控制更高活性的方法。利用本发明的培养基对罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590进行培养，所得酵母细胞具有更好的对果实进行防腐保鲜的效果。本发明所得的浓度为1×106细胞/毫升～1×109细胞/毫升的悬浮酵母细胞能作为果实生物保鲜剂，将上述果实生物保鲜剂对采前果实进行表面喷洒(果实表面润湿即可)或采后浸泡1-5分钟的方法，可防治青霉病等；果实包括苹果、梨和桃等等。
综上所述，采用本发明所提供的拮抗酵母诱导培养方法，能有效激发拮抗酵母的活性，具有促进拮抗酵母在果实内生长繁殖，增强抑菌物质分泌和病原菌水解酶活性等作用，从而显著抑制果实病害的发生和发展。本发明具有安全高效、环境友好，病害防治效果突出等优点。本发明的使用有利于转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是几丁质对罗伦隐球酵母在液体培养基中生长的影响对比图；
图中：(a)为在NYDB或在不同几丁质含量的NYCB中培养的对比图；
(b)为在不同葡萄糖浓度的NYCB中培养的对比图；
图2是几丁质培养后罗伦隐球酵母在梨果实体内的生长动态对比图；
图中：
6-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
6-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
7-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
7-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
8-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
8-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
图3是几丁质培养后罗伦隐球酵母在苹果果实体内的生长动态对比图；
图4是几丁质培养后的罗伦隐球酵母对苹果诱导抗性的增强效应对比图；
图中：
7-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
7-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
8-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
8-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
9-D代表NYDB培养基培养的原始接入浓度为109个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液，
9-C代表NYCB培养基培养的原始接入浓度为109个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液；
图5是不同浓度几丁质培养基对罗伦隐球酵母几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影响对比图；
图中，(a)为不同浓度几丁质培养基对罗伦隐球酵母几丁质酶活性的影响对比图；
(b)为不同浓度几丁质培养基对β-1，3-葡聚糖酶活性的影响对比图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施例。
实施例1、
一、培养基的配置：
NYCA活化培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、琼脂20g和几丁质5g，水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，30分钟)后得NYCA活化培养基；
NYCB种子培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和几丁质5g，水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，30分钟)后得NYCB种子培养基。
二、菌种活化和制备：
1)、活化：
①、选用于低温(4℃)下保存在NYCA活化培养基中的罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590；
将上述罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在NYCA活化培养基中28℃培养48小时，然后在相同条件下重复传代培养2次(每次均为在NYCA活化培养基基中28℃培养48小时)。
②、将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYCB种子培养基中，于200rpm、28℃的条件下培养24小时；
然后在上述相同条件下重复培养1次，即将NYCB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYCB种子培养基中，于200rpm、28℃条件下培养24小时。
2)、液体培养：
将步骤1)活化所得的酵母按照5％重量比的接种量接到NYCB种子培养基中(即酵母与NYCB种子培养基的重量比为5％)，于200rpm、28℃的条件下培养24小时。
3)、离心分离：
将步骤2)液体培养后的所得物在3000rpm条件下离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；
4)、悬浮和确定浓度：
用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到浓度为1×106细胞/毫升～1×109细胞/毫升；得C.laurentii悬浮液。
实施例2、将NYCB种子培养基中几丁质的重量由5g改成10g，其余同实施例1。
实施例3、将NYCB种子培养基中几丁质的重量由5g改成20g，其余同实施例1。
实验1、对果实的生防实验：
实验1.1、对梨的生防实验：
以相同品种及成熟度的梨果实作为实验对象，用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。
实验组1～实验组5、对比组1～对比组3以及空白对照组均为：
先加入30μl不同的试剂，加入试剂2小时后在每个伤口加入等量(30μl)的P.expansum孢子悬浮液，浓度为1×104spores/ml。处理完毕后在常温下(20-25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每天定时对果实伤口处病害发生和发展情况进行观察和记录，结果以平均病害发生率(％)和平均病斑直径(mm)表示。每处理重复4次，每个重复24个果实。整个实验重复2次以上。
每个伤口处加入的30μl试剂具体如下：
实验组1、果实伤口处加入30μl实施例1所得的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液(NYCB种子培养基中几丁质浓度为0.5％)；
实验组2、果实伤口处加入30μl实施例2所得的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液(NYCB种子培养基中几丁质浓度为1％)；
实验组3、果实伤口处加入30μl实施例3所得的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液(NYCB种子培养基中几丁质浓度为2％)；
实验组4、果实伤口处加入30μl实施例2所得的浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液(NYCB种子培养基中几丁质浓度为1％)；
实验组5、果实伤口处加入30μl实施例2所得的浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液(NYCB种子培养基中几丁质浓度为1％)；
对比实验：
以NYDA活化培养基替代NYCA活化培养基，以NYDB种子培养基替代NYCB种子培养基，其余均同实施例1，得对比例。
NYDA活化培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和琼脂20g，水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，30分钟)后所得NYDA活化培养基。
NYDB种子培养基：将牛肉浸膏8g、酵母粉5g和葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，30分钟)后所得NYDB种子培养基。
对比组1、果实伤口处加入30μl对比例所得的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液；
对比组2、果实伤口处加入30μl对比例所得的浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液；
对比组3、果实伤口处加入30μl对比例所得的浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
空白对照组：果实伤口处加入30μl的无菌水。
以下结果分别为在处理后5天和6天检测而得，具体结果如表1所示：
表1、对梨青霉病的控制效果
表中数字为平均数±标准误。
实验1.2、对苹果的生防实验：
将实验1.1中的梨改成苹果，并选取实验1.1中的若干个实验组和对比组，其余等同实验1.1，结果如表2所示：
表2、对苹果青霉病的控制效果
表中数字为平均数±标准误。
实验1.3、对桃果实的生防实验：
将实验1.1中的梨改成油桃，并选取实验1.1中的若干个实验组和对比组，其余同实验1.1，结果如表3所示(为病原菌接种后第6天的统计数)：
表3、对桃青霉病的控制效果
| 度为0％) | ||
| 空白对照组 | 100±0 | 21.1±0.6 |
表中数字为平均数±标准误。
从上述实验1.1～实验1.3说明：
与利用现有技术给出的NYDA活化培养基和NYDB种子培养基相比，利用本发明的NYCA活化培养基和NYCB种子培养基培养的C.laurentii能显著提高其拮抗效力，即降低了水果果实的发病率(％)、减小了水果果实的病斑直径(mm)。C.laurentii的拮抗效力总体上与酵母的浓度成正相关。
实验2、几丁质对罗伦隐球酵母在培养基中生长的影响：按5％(V/V)接种量将罗伦隐球酵母菌接入不同的NYCB培养基中(几丁质含量分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0％，w/v；葡萄糖均为10g；)以NYDB为对照；
或者该不同的NYCB培养基为：几丁质恒定1％(w/v)，葡萄糖加入量分别设置在每L中含0、2、4、8、10、12、14、16、18和20克。
在28℃条件下震荡培养(200rpm)24-144小时后，取样在显微镜下用血球计数器对酵母数量进行统计，结果以每ml总酵母数量为单位(log细胞数/毫升)。每个处理重复3次，每重复4个独立样品。整个实验重复2次。
结果如下：
C.laurentii在含0.1-2.0％(w/v)几丁质的NYCB培养基中培养24-144小时的生长量没有显著差异，C.laurentii在不同葡萄糖浓度的NYCB培养基中培养24-144小时的生长量没有显著差异(图1)。
实验3、几丁质培养后的罗伦隐球酵母在果实伤口处的生长动态：用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口，在每个伤口处加入等量(30μl)的经过NYCB培养基(10g几丁质，10g葡萄糖)培养后C.laurentii细胞悬浮液。以在正常NYDB培养基培养的作为对照。处理后贮藏在常温(20℃)下，并定期取样对酵母的群体数量进行测定。测定方法是用打孔器将果实伤口处组织完全取出(确保酵母的完全提取)，放于定量无菌蒸馏水中，并用捻钵捣碎，取样在显微镜下用血球计数器对酵母菌数量进行统计，结果以每个伤口处总酵母数量为单位(log细胞数/孔)。每个处理重复3次，每重复6个果实。整个实验重复2次。
1、梨果实果实生物防腐保鲜实验设置以下处理：
(1)处理1：果实伤口处加入上述体积经过NYDB培养基培养的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
(2)处理2：果实伤口处加入上述体积经过NYCB培养基(几丁质浓度为1％，10g葡萄糖)培养的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
(3)处理3：果实伤口处加入上述体积经过NYDB培养基培养的浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
(4)处理4：果实伤口处加入上述体积经过NYCB培养基(几丁质浓度为1％，10g葡萄糖)培养的浓度为107个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
(5)处理5：果实伤口处加入上述体积经过NYDB培养基培养的浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
(6)处理6：果实伤口处加入上述体积经过NYCB培养基(几丁质浓度为1％，10g葡萄糖)培养的浓度为106个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
2、苹果果实生物防腐保鲜实验设置以下处理：
(1)处理1：果实伤口处加入上述体积经过NYDB培养基培养的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液；
(2)处理2：果实伤口处加入上述体积经过NYCB培养基(1％几丁质，10g葡萄糖)培养的浓度为108个细胞/毫升的C.laurentii悬浮液。
C.laurentii在梨和苹果果实伤口处的生长速度分别如图2和图3所示，说明C.laurentii本发明经过本发明培养基的诱导培养后在梨和苹果果实伤口处的生长速度明显优于在常规培养基中的生长速度。
实验4、培养液上清液对果实病害的抑制效应：
实施例1的步骤3)离心分离所得液体经0.45μm膜过滤，得培养液上清液。
实验4.1、培养液上清液对梨果实病害的抑制，设置以下处理：
以相同品种及成熟度的梨果实作为实验对象，用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口(使用5mm直径打孔器)，先加入30μl不同的试剂，2小时后在原伤口接入病原菌P.expansum孢子悬浮液(1×104个孢子/毫升)30μl。上述处理完成后，将果实贮藏于常温(20-25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。4天后对病害发生率(％)进行统计。每个处理重复3次，每重复12个果实，整个实验重复2次。
每个伤口处加入的30μl试剂具体如下：
无菌水，对照；
NYDB培养基培养后的上清液；
NYCB培养基(几丁质含量为0.5％，10g葡萄糖)培养后的上清液；
NYCB培养基(几丁质含量为1％，10g葡萄糖)培养后的上清液。
培养液上清液的抑菌效果如表4所示。
表4、培养液上清液对梨青霉病的控制效果
表中数字为平均数±标准误。
实验4.2、培养液上清液对苹果病害的抑制，设置以下处理：
将实验4.1中的梨改成苹果，并选取实验4.1中的若干个实验组和对比组，其余同实验4.1，结果如表5所示：
表5、培养液上清液对苹果青霉病的控制效果
表中数字为平均数±标准误。
实验4.3培养液上清液对桃病害的抑制设置以下处理：
将实验4.1中的梨改成桃，每个伤口处加入的30μl试剂具体如下：
无菌水，对照；
NYDB培养基培养后的上清液；
NYDB培养基培养后的上清液并经过100℃、15分钟加热处理；
NYCB培养基(几丁质浓度为1％，葡萄糖10克)培养后的上清液；
NYCB培养基(几丁质浓度为1％，葡萄糖10克)培养后的上清液并经过100℃、15分钟加热处理；
其余内容同实验4.1，结果如表6所示：
表6、培养液上清液对桃青霉病的控制效果
| 平均病斑直径(mm) | |
| 无菌水，对照 | 19.6±0.8 |
| NYDB培养基培养后的上清液 | 18.7±0.4 |
| NYDB培养基培养后的上清液并经过100℃、15分钟加热处理 | 19.2±0.7 |
| NYCB培养基(几丁质浓度为1％)培养后的上清液 | 13.8±0.6 |
| NYCB培养基(几丁质浓度为1％)培养后的上清液并经过100℃15分钟加热处理 | 19.0±0.9 |
表中数字为平均数±标准误。
根据上述表格可知，C.laurentii在NYDB中培养后的上清液没有抑菌效力。而在NYCB培养基培养后，C.laurentii的发酵上清液(培养液上清液)显示了出对扩展青霉在梨果实伤口处侵染的抑制作用。特别是完全抑制了早期(第4天)病害症状的出现，而且到第7天时仍能显著抑制青霉病的病斑直径(表4)。在苹果果实伤口上也有类似的结果(表5)。在水蜜桃果实上(表6)，NYDB中培养后酵母上清液，同样对P.expansum没有抑制作用。但在NYCB培养基(几丁质1％)培养后的酵母上清液，能对桃果实青霉病产生20％左右的抑制作用(平均病斑直径)。NYCB培养基加热后的发酵上清液没有抑菌性能。
实验5、对果实伤口***抗性的诱导：果实先用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口处30μl等量以下处理：
在NYDB培养基培养的浓度为107个细胞/毫升酵母悬浮液；
在NYDB培养基培养的浓度为108个细胞/毫升酵母悬浮液；
在NYDB培养基培养的浓度为109个细胞/毫升酵母悬浮液；
NYCB培养基中(1％几丁质，葡萄糖10克)培养的浓度为107个细胞/毫升酵母悬浮液；
NYCB培养基(1％几丁质，葡萄糖10克)培养的浓度为108个细胞/毫升酵母悬浮液；
NYCB培养基(1％几丁质，葡萄糖10克)培养的浓度为109个细胞/毫升酵母悬浮液；
无菌水(作为对照)。
上述处理完成后，将果实贮藏于常温(20-25℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。72小时后在离原伤口5mm处新开一个同样大小的伤口，并接入病原菌P.expansum孢子悬浮液(1×104个孢子/毫升)。病原菌接种处理后果实继续贮藏在原先同样条件下，4天后对病害发生率(％)进行统计。每个处理重复3次，每重复12个果实，整个实验重复2次。
结果如下：
在NYDB中培养的C.laurentii在最高使用浓度(109个细胞/毫升)能诱导苹果果实产生对青霉病的抗性，而在较低浓度(107个细胞/毫升和108个细胞/毫升)均不能诱导果实的抗性(图4)。
而经过NYCB培养基培养后的C.laurentii，在接种处理到苹果果实上后，其对苹果抗性的诱导能力显著增强，且在较低浓度(108个细胞/毫升)时也能诱导果实产生对青霉病的抗性。
实验6、罗伦隐球酵母对几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶的活性：
实验6.1、罗伦隐球酵母对几丁质酶活性：
酵母经过NYDB或NYCB培养基(分别含0.1、0.5、1或2％几丁质，葡萄糖均为10克)培养后所得的培养物经过3000rpm离心、0.45μm膜过滤后所得上清液作为酶测定提取液。反应液组成为：1ml浓度为0.4％(w/v)胶体几丁质，1ml 50mmol/l醋酸缓冲液(Ph 5.0)，1ml上清液。反应液在37℃培养反应1小时后，离心去除沉淀，所得的上清液取0.5ml加入10μl浓度为20％(w/v)的蜗牛酶溶液，继续在37℃培养反应1小时。释放出的N-乙酰葡萄糖胺含量按以下方法进行测定：加入0.2ml浓度为0.8mol/l四硼酸纳，沸水浴中加热3分钟，迅速冷却；加入预先用2.7ml冰醋酸和0.3ml浓度为10％的二甲氨苯甲醛〔dimethylaminobenzaldehyde，DMAB，用冰醋酸和浓盐酸按87.5∶12.5(体积比)比例配制而成〕混合的溶液，37℃培养反应20分钟后迅速冷却；在585nm测定吸光度。以反应0小时样品作为对照，同时测定N-乙酰葡萄糖胺含量；用N-乙酰葡萄糖胺做标准曲线；以每ml上清液每小时分解胶体几丁质产生释放1nmol N-乙酰葡萄糖胺作为一个酶活力单位(U)；每个处理设3个重复，整个实验重复2次。
实验6.2、对β-1.3-对葡聚糖酶活性：
酵母经过NYDB或NYCB培养基(分别含0.1、0.5、1或2％几丁质，葡萄糖均为10克)培养后所得的培养物经过3000rpm离心、0.45μm膜过滤后所得上清液作为酶测定提取液。反应液组成为：1ml浓度为0.4％(w/v)昆布多糖(Sigma)溶液，1ml 50mmol/l醋酸缓冲液(Ph 5.0)，1ml上清液。在37℃培养反应l小时后，加入1.5mL3.5一二硝基水扬酸试剂(DNS)试剂，在沸水浴中保温10分钟，取出试管，冷却后测定530nm吸光度；并以反应0小时样品同时做测定葡萄糖含量；用葡萄糖做标准曲线；以每ml上清液每小时分解产生1nmol葡萄糖作为一个酶活力单位(U)；每个处理设3个重复，整个实验重复2次。
上述实验6.1和实验6.2的统计分析为：每个单独的试验中每个处理至少设3个以上重复，并按照完全随机区组原则进行设计。每个独立的试验至少重复2次。实验结果用SPSS/PC统计软件进行统计分析。当组内比较个数为3个及3个以上时，采用Duncan′s多重比较进行方差分析，分离平均数；当组内个数为2个时，采用独立样品t检验进行平均数分离。
结果如图5所示；C.laurentii在NYCB培养基(0.5-2％几丁质)培养24小时后，其上清液中的几丁质酶活性显著提高，特别是在最佳浓度(1％)时，几丁质酶活性是未添加几丁质对照的5倍左右。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的培养基，包括活化培养基和种子培养基，其特征是：
所述活化培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、琼脂20g和几丁质1～50g，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCA活化培养基；
所述种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和几丁质1～50g，水定容至1000ml，高压灭菌后得NYCB种子培养基。
2.利用权利要求1所述培养基进行的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：所述生防酵母为罗伦隐球酵母，其保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCCNO.3590；依次进行以下步骤：
1)、活化：
①、罗伦隐球酵母CGMCC NO.3590在NYCA活化培养基中25～28℃培养46～50小时，然后在相同条件下重复传代培养2次；
②、将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYCB种子培养基中，于150～200rpm、25～28℃的条件下培养22～26小时；然后在上述相同条件下重复培养1次；
2)、液体培养：
将步骤1)活化所得的酵母按照5％重量比的接种量接到NYCB种子培养基中，于150～200rpm、25～28℃的条件下培养24～144小时。
3.根据权利要求2所述的诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，其特征是：将步骤2)液体培养后的所得物依次进行以下步骤：
离心分离：
将步骤2)液体培养后的所得物在3000rpm离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗以去除培养介质；
悬浮和确定浓度：
用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，并用无菌蒸馏水调整到细胞浓度为1×106细胞/毫升～1×109细胞/毫升。
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