CN102640001A - 预测纤维化进展的生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法和试剂盒，以及用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法、监测疗法在减低纤维化在患有纤维化的受试者中进展方面的有效性的方法、选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法和用于抑制具有纤维化的细胞或受试者中纤维化进展的方法。所述方法均基于确定Toll样受体9(TLR9)的水平。

Description

预测纤维化进展的生物标记物

相关申请

本申请要求2009年11月5日提交的美国临时专利申请系列号61/258293的优先权。前述申请的完整内容通过引用方式并入本文作为参考。

发明背景

纤维化是过多纤维性组织的形成。纤维化可以是应答于坏死、损伤或慢性炎症的结果，其可以由多种因素例如药物、毒素、辐射、扰动组织或细胞稳态的任何过程、毒性损伤、改变的血流、感染(病毒性、细菌性、螺旋体性和寄生虫性感染)、贮积病和导致有毒代谢物积累的疾病引起。纤维化在心脏、肺、腹膜和肾中最常见。

一种类型的肺纤维化是特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis；IPF)。IPF是死亡率高和临床需要未满足的一种慢性、通常进展性肺病。广泛认为，IPF因对肺的未知侵害所致，所述侵害导致以严重肺泡破坏、程度不一的炎症伴发胞外基质过度沉积和正常肺功能最终丧失为标志的不可逆性瘢痕化(Wynn，T.A.(2008)J Pathol 214：199-210)。不完全了解IPF的发病机理，不过持续的成纤维细胞增殖和活化仍处于治疗性干预IPF的可靶向机制的最前线。通过产生胞外基质(ECM)蛋白，成纤维细胞是稳态和正常伤口修复的基础。在纤维化疾病中，成纤维细胞增殖失调、其分化成肌成纤维细胞和过多产生ECM导致正常间质构造破坏。

已经日益明确，IPF患者中的病程变化极大，一些患者在延长的时间段上显示相对病情稳定性，而其他患者显示病情快速进展(Martinez，F.J.等人(2005)Ann Intern Med 142：963-967)。虽然一些IPF患者显示生理衰退，但是其他IPF患者遭遇IPF的急剧劣化、急剧恶化(AE-IPF)(Hyzy，R.等人(2007)Chest 132，1652-1658；Collard，H.R.等人2007)Am J RespirCrit Care Med 176：636-643)。因而，已经越来越多地使用包括生理学进展、AE-IPF和/或全因死亡率的复合方法来定义IPF患者中的病情进展。对于IPF的精确防治，需要旨在理解病因学、风险因素和病情进展发病机理的严谨研究。由于许多现有疗法研究强调中期结果，因而在初始评价期间定义病程将具有巨大的实践价值。

因而，本领域迫切需要针对患有纤维化(例如IPF)的患者中纤维化进展的更好预测指示物以及用于抑制患有纤维化的患者中纤维化进展的更有效方法。

发明概述

本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法和试剂盒，以及用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法、监测疗法在减低纤维化在患有纤维化的受试者中进展方面的有效性的方法、选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法和用于抑制具有纤维化的细胞或受试者中纤维化进展的方法。

本发明至少部分地基于以下发现：TLR9在头一年随访期间临床划归为显示快速病情进展的IPF患者的肺活组织检查样品中过量表达。本发明至少部分地还基于以下发现：肺成纤维细胞中的TLR9表达被细菌和病毒DNA上存在的未甲基化的CpG DNA基序在体外上调。使用来自快速或稳定进展者的人肺成纤维细胞进入免疫缺陷性C.B.17SCID/bg小鼠的过继转移模型，显示来自快速进展者的成纤维细胞引起鼠肺中增加的纤维化，其中当小鼠接收单次鼻内CpG攻击时，所述纤维化恶化。本文中提出的数据首次显示，CpG诱导人CD14+单核细胞分化为纤维细胞样细胞并且介导人A549肺上皮细胞中的EMT。

因而，本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法。所述方法包括确定Toll样受体9(TLR9)在来自所述受试者的样品中的表达水平；并且比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平增加是所述纤维化将快速进展的指示，因而预测在患有纤维化的所述受试者中纤维化的进展。

在另一个方面，本发明提供了用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法。所述方法包括使一等分试样的来自所述受试者的样品与化合物文库的每个成员分别接触；确定所述化合物文库的成员对Toll样受体9(TLR9)在每个所述等分试样中的表达水平的影响；和选择所述化合物文库的成员，与对照样品中TLR9的表达水平相比，所述成员降低等分试样中TLR9的表达水平，从而鉴定出可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物。

在又一个方面，本发明提供了监测疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性的方法。所述方法包括确定Toll样受体9(TL9R)在样品中的表达水平，所述样品来自施用所述疗法的至少一部分至所述受试者之前和之后的受试者；并且比较TLR9在来自施用所述疗法之前的受试者的样品中的表达水平与TLR9在来自施用所述疗法至少一部分之后的受试者的样品中的表达水平，其中与TLR9在来自施用所述疗法之前的受试者的样品中的表达水平相比，TLR9在来自施用所述疗法至少一部分之后的受试者的样品中的表达水平降低是所述受试者应答于所述疗法的指示，从而监测到所述疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性。

在另一个方面，本发明提供了选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法。所述方法包括确定Toll样受体9(TLR9)在来自患有纤维化的受试者的样品中的表达水平，并且比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的较高表达水平是所述受试者应当参与所述临床试验的指示，从而选出参与治疗纤维化的临床试验的受试者。

在本发明的一个实施方案中，所述纤维化选自特发性肺纤维化、肝移植后的肝纤维化、慢性丙型肝炎病毒感染后的肝纤维化、和局灶性节段性肾小球硬化中的间质纤维化。在本发明的另一个实施方案中，所述纤维化选自胰和肺的囊性纤维化、注射纤维化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性块状纤维化、肾源性***性纤维化。在一个实施方案中，所述纤维化由外科植入人工器官引起。

本发明的方法还可以包括确定来自该受试者的样品中存在或不存在未甲基化的CpG；确定来自该受试者的样品中存在或不存在γ疱疹病毒；和/或确定该样品中额外标记物的表达水平，其中所述的额外标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9。

TLR9在该样品中的表达水平可以通过检测该样品中存在TLR9基因的转录的多核苷酸或其部分来确定。检测步骤可以包括检测cDNA和/或扩增所述转录的多核苷酸的步骤。TLR9在该样品中的表达水平也可以通过检测该样品中存在TLR9蛋白来确定，例如通过使用与该蛋白质特异性结合的抗体或其抗原结合片段检测。

TLR9在该样品中的表达水平可以通过使用选自聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量性逆转录酶PCR分析、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、免疫组织化学、ELISA测定法、阵列分析和它们的组合或次级组合的技术来确定。

从该受试者获得的样品可以包括液体，如选自通过支气管灌洗收集的液体、血液、呕吐物、关节内液体、唾液、淋巴液、囊液、尿、通过腹膜淋洗收集的液体和妇科液体中的液体。在一个实施方案中，来自该受试者的样品是通过支气管灌洗收集的液体。从该受试者获得的样品也可以或备选地包括组织或其组分，如选自肺、***、软骨、肺、肝脏、肾、肌肉组织、心脏、胰、骨和皮肤的组织。在一个实施方案中，该组织是肺或其组分。

在本发明的一个实施方案中，所述受试者是人。

在另一个方面，本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的试剂盒。所述试剂盒包括用于确定Toll样受体9(TLR9)表达水平的设备和使用此试剂盒来预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的说明书。

在另一个方面，本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的试剂盒。所述试剂盒包括用于从所述受试者获得生物学样品的设备，用于确定该样品对TGFβ和CpG的反应性的设备，和使用此试剂盒来预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的说明书。在一个实施方案中，此类试剂盒还包含用于确定Toll样受体9(TLR9)表达水平的设备。在另一个实施方案中，此类试剂盒不包含用于确定TLR9表达水平的设备。

在多个实施方案中，本发明的试剂盒还可以包含用于从受试者获得生物学样品的设备；对照样品；用于确定存在或不存在未甲基化的CpG的设备；用于确定存在或不存在γ疱疹病毒的设备；和/或用于确定额外标记物的表达水平的设备，其中所述的额外标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9。

在又一个方面，本发明提供了抑制细胞中纤维化进展的方法，所述细胞例如是肺细胞、肝细胞、肾细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、皮肤细胞、眼细胞或胰细胞。所述方法包括使细胞与有效量的TLR9拮抗剂接触，因而抑制该细胞中纤维化的进展。

在另一个方面，本发明提供了用于通过以下方式抑制受试者(例如人受试者)中纤维化进展的方法：施用有效量的TLR9拮抗剂至该受试者，因而抑制此受试者中纤维化的进展。在一个实施方案中，此类方法还可以包括施用额外的治疗剂至所述受试者。

在一个实施方案中，将所述拮抗剂静脉内、肌内或皮下施用至所述受试者。

在另一个实施方案中，所述纤维化选自特发性肺纤维化、肝移植后的肝纤维化、慢性丙型肝炎病毒感染后的肝纤维化、和局灶性节段性肾小球硬化中的间质纤维化。在本发明的又一个实施方案中，所述纤维化选自胰和肺的囊性纤维化、注射纤维化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性块状纤维化、肾源性***性纤维化。在一个实施方案中，所述纤维化由外科植入人工器官引起。

在一个实施方案中，TLR9拮抗剂选自抗体，例如鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体和嵌合抗体、Fab、Fab’₂、ScFv、SMIP、亲和体(affibody)、avimer、versabody、纳米体(nanobody)或结构域抗体；小分子；核酸，例如反义分子，例如RNA干扰剂和核酶；融合蛋白；adnectin；适体(aptamer)；anticalin；脂笼蛋白；或TLR9衍生的肽化合物。

本发明的其他特征和优点将从以下详细描述并且从权利要求书中显而易见。

附图简述

图1A-1D描述了患有特发性肺纤维化(IPF)的快速和缓慢进展形式的患者的多种临床特征和TLR9表达。A.划归为快速或缓慢进展者的IPF患者的存活。B.具有缓慢(1、2)和快速(3、4)进展的患者中IPF的代表性组织学，以20x和40×放大率显示。C.定量性TaqMan PCR分析在来自快速和缓慢进展者的上叶SLB中的TLR9基因表达。所示的数据是与正常SLB mRNA值的均数相比，全部合并上叶mRNA值的均数(相对GAPDH持家基因标准化)。误差线显示快速(n＝10)和稳定(n＝13)进展者患者组中全部数据的SEM。通过采用Welch校验的非成对t检验确定双尾P-值。D.在来自总计7位缓慢进展者(1)和5位快速进展者(3)的SLB中的TLR9的代表性免疫组织化学染色，以20×放大率显示。在2和4中显示用同种型对照(IgG)染色的相应视野。

图2A-2F描述诱导人CD14+分化为纤维细胞样细胞。A.CD14+单核细胞体外分化的实验方案。B.单核细胞的显微照片，所述单核细胞在无血清培养基或含有10ng/ml TGFβ的无血清培养基中培养并且在第3日不予刺激(1、2)、用50μg/mL非刺激性CpG(3、4)、50μg/mL CpG(5、6)或50g/mL聚IC(7、8)刺激。C.纤维细胞标记物的qRT-PCR分析。在无血清培养基中培养3日，同时在+/-CpG的情况下培养24小时的单核细胞中的αSMA基因表达(1)。在无血清培养基中或在TGFβ、+/-CpG或聚I:C的情况下培养3日的单核细胞中的胶原蛋白I基因表达(2)。D.在无血清培养基(1)或TGFβ(2)；无血清培养基+CpG(3)或TGFβ+CpG(4)中培养的单核细胞中胶原蛋白I的荧光ICC(40×放大率)。在TGFβ+CpG中培养的单核细胞的同位素对照(5)。作为来自单核细胞的总CD14+CD45+细胞百分数的胶原蛋白表达的代表性(n＝3)FC，其中所述单核细胞在无血清培养基和含有CpG的无血清培养基中培养。E.在含有TGFβ(1)或TGFβ+CpG(2)的无血清培养基中培养的单核细胞的前向散射和侧向散射FC。用抗CD14染色，作为总细胞的百分数的CD14的代表性(n＝3)FC，其中所述总细胞来自在无血清培养基中培养的单核细胞(3)或在含有TGFβ的无血清培养基中培养的单核细胞(4)。用抗CD45染色并针对CD14表达设门的，作为CD14-细胞的百分数的CD45的代表性(n＝3)FC，其中所述CD14-细胞来自在无血清培养基中培养的单核细胞(5)或在含有TGFβ的无血清培养基中培养的单核细胞(6)。将代表性数据(n＝3)图示为用抗CD45染色并针对CD14表达设门时的CD14+细胞的百分数，其中所述CD14+细胞来自在无血清培养基中培养的单核细胞和在含有TGFβ的无血清培养基中培养的单核细胞。

图3A-3E描述了人A549细胞中由CpG诱导的上皮-间充质转换(EMT)。A.A549细胞的代表性显微照片(n＝5)，所述A549细胞在培养基(DMEM+10％FCS)(1)、TGFβ(2)和升高的CpG浓度：5μg/mL(3)、10μg/mL(4)、50μg/mL(5)、100μg/mL(6)和200μg/mL(7)中培养96小时。B.随升高浓度的CpG培养96小时的A549细胞中αSMA(1)、波形纤维蛋白(2)和e-钙黏着蛋白(3)的qRT-PCR分析。C.随升高浓度的CpG培养96小时的A549细胞中IFNα的qRT-PCR分析。D.A549细胞中胶原蛋白1的荧光ICC(40×放大率)，所述A549细胞在培养基(1)、10μg/mLCpG(2)、50μg/mL CpG(3)和100μg/mL CpG(4)中培养96小时。使用100μg/mL CpG培养的细胞时，胶原蛋白1抗体的同位素对照(5)。E.在CpGEMT测定中A549细胞内TLR9的siRNA敲低：在用非靶向性对照siRNA、亲环蛋白B对照siRNA和TLR9 siRNA进行siRNA处理后的A549细胞裂解物中TLR9蛋白和加载了β-肌动蛋白的对照的蛋白质印迹法分析；(1-4)在CpGDNA处理之前，在培养基和仅转染剂(5)、含有非靶siRNA(6)和含有TLR9 siRNA(7)中培养的A549细胞的显微照片；在siRNA处理后并且用培养基和仅转染剂(8)、非靶siRNA+75μg/ml CpG(9)和TLR9siRNA+75μg/ml CpG-DNA刺激72小时(10)的A549细胞的代表性显微照片(n＝4)；在siRNA处理过并且用75μg/ml CpG培养72小时的A549细胞中波形纤维蛋白(11)和e-钙黏着蛋白(12)的qRT-PCR分析。数据是均数±SD。＊＊＊p＜0.0001。

图4A-4J描述了快速和缓慢进行性IPF肺成纤维细胞中的TLR9表达和对CpG的应答。A.在IL-4(10ng/ml)存在或不存在的情况下不用CpG-ODN处理(未处理)或用CpG-ODN(10μg/ml)处理24小时的代表性快速UIP/IPF(n＝5-8)(a)和缓慢IPF(n＝5-8)(b)成纤维细胞细胞系中，TLR9基因表达的qRT-PCR分析。在每个疾病组内部与相应的未处理成纤维细胞相比计算倍数增加。对IFNα(c和d)、PDGF(e和f)、MCP-1/CCL2(g和h)和MCP-3/CCL3(i和j)，使用Bioplex分析快速或缓慢IPF成纤维细胞条件培养基。成纤维细胞细胞系在IL-4(10ng/ml)存在或不存在的情况下不用CpG-ODN处理(未处理)或用CpG-ODN(10μg/ml)处理24小时。数据代表至少5个缓慢IPF成纤维细胞细胞系和5个快速IPF成纤维细胞细胞系。数据是均数±SEM。＊＊p＜0.001和＊＊＊p＜0.0001。

图5A-5C了描述在IPF的人SCID小鼠模型中的快速进行性人肺成纤维细胞中CpG诱导的纤维化恶化。A.用于建立AE-IPF的人SCID模型的实验方案。B.来自小鼠的用Masson三色染色以描述纤维化程度的代表性小鼠肺切片，其中所述小鼠接受正常人肺成纤维细胞并且在第35日用盐水(1)或CpG(2)作鼻内攻击，接受快速UIP/IPF人肺成纤维细胞并且在第35日用盐水(3)或CpG(4)作鼻内攻击，以及接受缓慢UIP/IPF人肺成纤维细胞并且在第35日用盐水(5)或CpG(6)作鼻内攻击。C.在来自盐水或CpG攻击的小鼠的一半肺匀浆中的羟脯氨酸水平，其中所述小鼠接受快速UIP/IPF人肺成纤维细胞(1)和稳定UIP/IPF人肺成纤维细胞(2)。数据是来自每个时间点上5只小鼠的均数±SEM。数据是均数±SEM。＊＊p＜0.001。

发明详述

本发明至少部分地基于以下发现：TLR9在头一年随访期间临床划归为显示快速病情进展的IPF患者的肺活组织检查样品中过量表达。本发明至少部分地还基于以下发现：肺成纤维细胞中的TLR9表达因细菌和病毒DNA上存在的未甲基化的CpG DNA基序在体外上调。使用来自快速或稳定进展者的人肺成纤维细胞进入免疫缺陷性C.B.17 SCID/bg小鼠的过继转移模型，显示来自快速进展者的成纤维细胞引起鼠肺中增加的纤维化，其中当小鼠接收单次鼻内CpG攻击时，所述纤维化恶化。本文中提出的数据首次显示，CpG诱导人CD14+单核细胞分化为纤维细胞样细胞并且介导人A549肺上皮细胞中的EMT。

因此，本文中提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法和试剂盒，以及用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法、监测疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性的方法、选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法和用于抑制具有纤维化的细胞或受试者中纤维化进展的方法。

虽然在特发性肺纤维化(IPF)中鉴定到本文所述的TLR9表达水平改变，但是本发明的方法无论如何不限于用于IPF的预后、诊断、表征、治疗和预防，例如，本发明的方法可以适用于如本文所述的任何纤维化疾病。

本发明的多个方面在以下的子部分中进一步详细描述。

I.定义

如本文所用，以下每个术语具有与其在这个部分中相关的意思。

冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文所用，术语“纤维化”指细胞、器官或组织中过多纤维状***的异常形成或发育。纤维化作为细胞、器官或组织中因例如物理损伤、炎症、感染和暴露于毒素所致的修复性或反应性过程的部分而出现。存在几种类型的纤维化，例如，胰和肺的囊性纤维化；注射纤维化，其可以作为肌内注射并发症出现，特别在儿童中；心内膜心肌纤维化(endomyocardial fibrosis)；肺部的肺纤维化；纵隔纤维化；骨髓纤维化；腹膜后纤维化；进行性块状纤维化、煤矿工人尘肺的并发症和肾源性***性纤维化。

如本文所用，术语“纤维化”可以与包括以纤维化为特征的任何病症、病状或疾病的术语“纤维化病症”、“纤维化病状”和“纤维化疾病”互换地使用。纤维化病症的实例包括但不限于脉管纤维化、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化)、胰纤维化、肝纤维化(例如，肝移植后或丙型肝炎病毒感染后)、肾纤维化(例如，局灶节段肾小球硬化和肾源性***性纤维化中的间质纤维化)、骨骼肌纤维化、心肌纤维化(例如，心内膜心肌纤维化、特发性心肌病)、皮肤纤维化(例如，硬皮病、创伤后、手术性皮肤瘢痕化、疤痕疙瘩和皮肤疤痕疙瘩形成)、眼纤维化(例如，青光眼、眼的硬化、结膜和角膜瘢痕化和翼状胬肉)、进行性***性硬化症(PSS)、慢性移植物抗宿主病、Peyronie病、膀胱镜检查后尿道狭窄、特发性和药理学诱导的腹膜后纤维化、纵隔纤维化、进行性块状纤维化、增生性纤维化、肿瘤纤维化、和由外科植入人工器官引起的纤维化。与纤维化相关的其他疾病、病症和病状包括，例如因肝纤维化引起的肝硬化、弥散性实质性肺病、输精管切除术后疼痛综合征、可以引起肺纤维化的结核病、可以引起脾膨大和最终纤维化的镰状细胞性贫血、类风湿性关节炎和可以引起肠道组织反复炎症和愈合，从而导致肠壁纤维化的节段性回肠炎。纤维化还作为血色素沉着、Wilson病、酒精中毒、血吸虫病、病毒性肝炎、胆管阻塞、毒素暴露和代谢紊乱的并发症出现。

在本发明的一个实施方案中，纤维化是肺纤维化，例如，特发性肺纤维化(IPF)，也称作隐原性纤维化肺泡炎和IPF/UIP(普通型间质性肺炎)。

可以使用本领域技术人员已知的方法诊断受试者中的纤维化。例如，可以使用常规血液化学分析、超声波法、放射线照相术、CT、MRI、活组织检查和组织学检查诊断纤维化。基因检测(例如对CFTR基因)也可以用来诊断受试者中的纤维化。

如本文所用，短语“患有纤维化的受试者中纤维化的进展”指从纤维化的症状开始所测定的存活率。受试者可以划归为“快速进展者”(或为具有“快速病情进展”)或划归为“缓慢进展者”(或为具有“缓慢病情进展”)。

“快速进展者”是症状发作后存活少于约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月或少于约23个月的受试者。

“缓慢进展者”是症状发作后存活多于约23个月、约24个月、约25个月、约26个月、约27个月、约28个月、约29个月、约30个月、约31个月、约32个月、约33个月、约34个月、约35个月、约36个月、约37个月、约38个月、约39个月、约40个月、约41个月、约42个月、约43个月、约44个月、约45个月、约46个月、约47个月、约48个月、约49个月、约50个月、约51个月、约52个月、约52个月、约54个月、约55个月、约56个月、约57个月、约58个月、约59个月、约60个月、约61个月、约62个月、约63个月、约64个月、约65个月、约66个月、约67个月、约68个月、约69个月、约70个月、约71个月、约72个月、约73个月、约74个月、约75个月、约76个月、约77个月、约78个月、约79个月、约80个月、约81个月、约82个月、约83个月、约84个月、约85个月、约86个月、约87个月、约88个月、约89个月、约90个月、约91个月、约92个月、约93个月、约94个月、约95个月、约96个月、约97个月、约98个月、约99个月、约100个月、约101个月、约102个月、约103个月、约104个月、约105个月、约106个月、约107个月、约108个月、约109个月、约110个月、约111个月、约112个月、约113个月、约114个月、约115个月、约116个月、约117个月、约118个月、约119个月、约120个月或更长时间的受试者。

此外，具有快速病情进展的受试者可以具有静息时低于缓慢进展者中位值水平的氧饱和水平(SpO₂)，例如，在纤维化确诊后约6个月。SpO₂水平是测量时氧饱和的血红蛋白的百分数的指标，并且可以通过使用例如脉搏血氧测定法测定。

缓慢进展者和快速进展者可以在症状发作和/或送至医师时具有相似的生理和放射影像学特征。

另外，在“缓慢进展者”当中，存在具有急性临床劣化(“IPF急性恶化”(“AE-IPF”)的患者亚群，所述急性临床劣化是疾患终末期的前奏。AE-IPF的症状包括例如，呼吸困难突然加重、新发展的弥散性射线照相致密影、低血氧症加重和不存在感染性肺炎、心力衰竭或败血症。如本文定义，快速进展者不是患有AE-IPF的受试者。

如本文所用，术语“Toll样受体”或“TLR”指单次跨膜的非催化性受体，其识别源自微生物的结构上保守的分子。TLR连同白细胞介素-1受体例如IL-1受体和IL-18受体形成称作“白细胞介素-1/Toll样受体超家族〔的受体超家族。该家族的成员在结构上以胞外亮氨酸丰富重复序列(LRR)结构域(一种近膜半胱氨酸残基保守模式)和胞浆内信号传导结构域(Toll/IL-1抗性或Toll-IL-1受体(TIR))结构域(其通过召集(经TIR-TIR相互作用)含有TIR结构域的衔接体(包括MyD88)、含有TIR结构域的衔接体(TIRAP)和诱导含有TIR结构域的衔接体的IFNβ(TRIF)，形成下游信号传导的平台)特征(L.A.O′Neill，A.G.Bowie(2007)Nat Rev Immunol7：353)。

TLR9的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以在例如gi：20302169、gi：157057165(分别是人和小鼠TLR9)中找到。

TLR9的“较高表达水平”或“表达水平增加”指试样中这样的表达水平，其大于用来评估表达的测定法的标准误，并且优选地是对照样品中TLR9的表达水平(例如，来自未受纤维化袭扰的健康受试者中的样品和/或来自具有缓慢病情进展的受试者中的样品，和/或TLR9在几种对照样品中的平均表达水平)的至少2倍并且更优选地3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。

TLR9的“较低表达水平”或“表达水平降低”指试样中这样的表达水平，其小于用来评估表达的测定法的标准误，并且优选地比对照样品中TLR9的表达水平(例如，来自具有快速病情进展的受试者中的样品和/或来自施用抗纤维化疗法的一部分之前的受试者中的样品，和/或TLR9在几种对照样品中的平均表达水平)小至少2倍并且更优选地3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。

术语“已知的标准水平”或“对照水平”指已接受的或预定的TLR9表达水平，其用来比较源自受试者的样品中的TLR9表达水平。在一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自具有缓慢病情进展的受试者。在另一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自具有快速病情进展的一位受试者或多位受试者。在另一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自未患病、即无病的受试者，即未患有纤维化的受试者。在又一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自施用针对纤维化的疗法之前的受试者。在另一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自与试验化合物未接触的患有纤维化的受试者。在另一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自与试验化合物接触的未患有纤维化的受试者。在一个实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自纤维化症动物模型、细胞或源自所述纤维化症动物模型的细胞系。

仍在本发明的其他实施方案中，TLR9的对照表达水平基于下述样品中TLR9的表达水平，其中所述样品来自患有纤维化的受试者，所述纤维化似乎是非纤维化性的。例如，当腹腔镜检查术或其他医疗方法揭示某器官的一个部分中存在纤维化时，可以使用该器官的未受影响部分确定TLR9的对照表达水平，并且这种对照表达水平可以与TLR9在该器官的受影响部分(即，纤维化部分)中的表达水平比较。

备选地和特别地，随着进一步的信息因常规进行本文所述的方法而变得可获得时，可以使用TLR9“对照”表达水平的群体水平均值。在其他实施方案中，可以通过确定下述受试样品中TLR9的表达水平来确定TLR9的“对照”表达水平，其中从纤维化在该受试者中疑似发作之前的受试者、从存档的受试样品等中获得所述的受试样品。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”指人和非人动物，例如兽医患者。术语“非人动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、小鼠、兔、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖类和爬行类。在一个实施方案中，受试者是人。

如本文所用的术语“样品”指从受试者分离的相似细胞或组织的集合以及存在于受试者内部的组织、细胞和液体。术语“样品”包括任何体液(例如、血液、淋巴液、妇科液体、囊液、尿、眼内液和通过支气管灌洗和/或腹膜淋洗收集的液体)或来自受试者的细胞。在一个实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一个实施方案中，所述组织或细胞存在于受试者中。其他受试样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案中，生物学样品含有来自试验受试者的蛋白质分子。在另一个实施方案中，生物学样品含有来自试验受试者的mRNA分子或来自试验受试者的基因组DNA分子。

如果预期或实际减轻、终止、减缓、延迟或阻止了纤维化的至少一种症状，则纤维化进展“被减缓”。

试剂盒是任何制造物(例如，包装物或容器)，其包含用于特异性检测TLR9的至少一种试剂，例如，探针或引物，将所述制造物作为实行本发明方法的单元推广、分销或销售。

II.本发明的用途

A.预测方法

本发明提供了用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法。所述方法包括确定Toll样受体9(TLR9)在从所述受试者获得的样品中的表达水平，并且比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平增加是所述纤维化将快速进展的指示。

在一个实施方案中，确定样品中TLR9的表达水平包括使源自该受试者的样品与试剂接触，其中所述试剂以如此方式转化所述样品，从而检测到TLR9的表达水平。

从患有纤维化的受试者获得的任何样品可以用来确定TLR9的表达水平。例如，该样品可以是从该受试者获得的任何液体或其亚组分，例如，通过支气管灌洗收集的液体、血液、血清、血浆、呕吐物、关节内液体、唾液、淋巴液、囊液、尿、通过腹膜淋洗收集的液体、滑液或和妇科液体。该样品也可以从该受试者获得的任何组织或其片段或亚组分，例如支气管、肺、骨、***、软骨、肝脏、肾、肌肉组织、心脏、胰、骨和皮肤。

用于从受试者获得样品的技术或方法是本领域熟知的，并且包括例如通过拭子、洗液、吸取或活组织检查获得样品。可以使用本领域熟知和下文实施例部分中描述的技术，完成分离液体或组织样品的亚组分(例如，细胞或RNA或DNA)。

在本发明的一个方面，该预测方法包括从患有纤维化的受试者获得样品，一式两份培养该样品并且确定所述样品之一对TGF β的反应性和确定复样对CpG的反应性，其中所培养的样品与TGFβ的反应和所培养的复样与CpG的反应是所述纤维化将快速进展的指示。此类方法还可以包括确定TLR9的表达水平，或者在某些实施方案中，可以不包括确定TLR9的表达水平。

本发明的方法还可以包括确定来自所述受试者的样品中存在或不存在未甲基化的CpG。确定存在或不存在未甲基化的CpG可以包括例如使用亚硫酸氢盐处理DNA、甲基化敏感性限制性酶和/或甲基化特异性PCR(如例如美国专利号5,786,146中所述，其完整内容通过引用方式并入本文)。

本发明的方法还可以进一步包括确定来自所述受试者的样品中存在或不存在γ疱疹病毒(例如淋巴隐潜病毒(Lymphocryptovirus)、弱病毒(Rhadinovirus)、Macavirus和Percavirus)。确定存在或不存在γ疱疹病毒可以包括例如血清学分析、免疫荧光染色、PCR分析和/或培养来自受试样品的病毒。

此外，本发明的方法还可以包括确定所述样品中标记物的表达水平，所述的标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9。可以使用本文所述的任何方法和技术确定这些标记物中任意者的表达水平。

膜联蛋白1的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：4502100中找到；α平滑肌肌动蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：47078293中找到；中性粒细胞弹性蛋白酶的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：58530849中找到；KL-6的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：67189006、GI：67189068、GI：113206023、GI：113206025、GI：113206027、GI：113206029和GI：65301116中找到；ST2的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：27894327和GI：27894323中找到；IL-8的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：28610153中找到；α防卫素的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：12621915中找到；β3-内联蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：27597074中找到；Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：195234783中找到；纤溶酶原激活物抑制剂-1的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：169790801中找到；HPS3的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：28416957中找到；Rab38的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：11641236中找到；Smad6的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：236465444和GI：236465646中找到；ADAMTS7的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：133925806中找到；CXCR6的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：5730105中找到；Bcl2-L-10的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：20336328中找到；并且MMP-9的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的并且可以例如在GenBank文献号GI：74272286中找到。

另外，本发明的方法可以与由技术人员用来预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的任何其他方法联合实施。例如，本发明的方法可以与本领域已知的任何临床纤维化测量法(包括其他分子标记物的细胞学测量和/或检测(和根据需要定量)联合实施。

可以通过多种熟知技术和方法中的任一种确定从受试者获得的样品中TLR9的表达水平，其中所述技术和方法将该样品内部的TLR9转化成可以被检测和定量的部分。此类方法的非限制性实例包括分析该样品，使用用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法、免疫印迹法、蛋白质印迹法、RNA印迹法、电子显微镜法、质谱法例如MALD1-TOF和SELDI-TOF、免疫沉淀法、免疫荧光法、免疫组织化学法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)例如放大ELISA、基于血液的定量测定例如血清ELISA、基于尿的定量测定法、流式细胞术、DNA印迹杂交、阵列分析等和它们的组合或次级组合。

例如，可以从源自该受试者的样品(例如，通过标准方法获得的支气管灌洗液、口腔拭子、活组织检查样品或外周血单核细胞)获得mRNA样品，并且可以使用标准分子生物学技术如PCR分析，检测和/或确定样品中编码TLR9的mRNA的表达。优选的PCR分析方法是逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。用于mRNA样品分析的其他合适***包括微阵列分析(例如，使用Affymetrix的微阵列***或Illumina的珠阵列技术)。

普通技术人员将易于理解，可以使用本领域中所建立的用于在核酸或蛋白质水平检测TLR9的表达水平的基本上任何技术手段来确定如本文讨论的TLR9表达水平。

在一个实施方案中，样品中TLR9的表达水平通过检测TLR9基因的转录的多核苷酸或其部分例如mRNA或cDNA来确定。可以使用RNA提取技术，包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取法(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，瑞士)，从细胞提取RNA。使用核糖核酸杂交法的常见分析模式包括核连缀测定法(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNA酶保护测定法(Melton等人，Nuc.Acids Res.12：7035)、RNA印迹法、原位杂交和微阵列分析。

在一个实施方案中，使用核酸探针确定TLR9的表达水平。如本文所用，术语“探针”指能够与特定TLR9选择性结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成或从适宜的生物学制备物衍生。探针可以特别设计以加以标记。可以用做探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

可以在包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列法的杂交或扩增分析中使用分离的mRNA。一种用于确定mRNA水平的方法包括使分离的mRNA与可以同TLR9 mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。该核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，如具有至少约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、250或约500个核苷酸长度并且足以在严格条件下与TLR9基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。

在一个实施方案中，将mRNA固定在固体表面上并且与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上电泳运行分离的mRNA并且将所述mRNA从凝胶转移至一种膜如硝酸纤维素膜。在一个备选实施方案中，将所述探针固定在固体表面上并且使所述mRNA与该探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以轻易地改造已知的mRNA检测方法以用于确定TLR9 mRNA的水平。

用于确定样品中TLR9的表达水平的备选方法包括例如，通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利号4,683,202中所述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我维持式序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA87：1874-1878)、转录性扩增***(Kwoh等人(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶法(Lizardi等人(1988)Bio/Technology6：1197)、滚环复制法(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，对样品中例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以极低的数目存在，这些检测方案尤其用于检测此类分子。在本发明的具体方面，通过定量性荧光生成性RT-PCR(即TaqMan^TM***)确定TLR9的表达水平。此类方法一般利用对TLR9特异的寡核苷酸引物对。用于设计对已知序列特异的寡核苷酸引物的方法是本领域熟知的。

使用膜印迹(如杂交分析如RNA印迹法、DNA印迹法、点杂交等中所用的膜印迹)或微量孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固相支持物)，可以监测TLR9 mRNA的表达水平。见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，所述文献通过引用方式并入本文。TLR9表达水平的确定也可以包括使用溶液中的核酸探针。

在本发明的一个实施方案中，使用微阵列来检测TLR9的表达水平。因为不同实验之间可重复，所以微阵列特别适于此目的。DNA微阵列提供一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。每个阵列由可重复样式的与固相支持物连接的捕获探针组成。标记的RNA或DNA与该阵列上的互补探针杂交并且随后通过激光扫描来检测。测定该阵列上每个探针的杂交强度并且将其换算成代表相对基因表达水平的定量值。见美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，所述文献通过引用方式并入本文。高密度寡核苷酸阵列特别用于确定样品中大量RNA的基因表达谱。

在某些情况下，使用检测由TLR9 mRNA编码的蛋白质产物的检测试剂，可以在蛋白质水平分析TLR9的表达。例如，如果可获得与待检测的TLR9蛋白产物特异性结合且不与其他蛋白质结合的抗体试剂，则使用本领域已知的标准抗体技术如FACS分析等，这种抗体试剂可以用来检测来自受试者的细胞样品或源自该细胞样品的制备物中TLR9的表达。

用于在蛋白质水平检测TLR9的其他已知方法包括方法如电泳法、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、超扩散色谱法等或多种免疫学方法如液相或凝胶沉淀素反应、免疫扩散法(单向或双向)、免疫电泳法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光测定法和蛋白质印迹法。

可以使用本领域技术人员熟知的技术从样品分离蛋白质。所用的蛋白质分离方法可以例如是在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)中描述的那些方法。

在一个实施方案中，在检测表达的蛋白质的方法如蛋白质印迹法或免疫荧光技术中使用抗体或抗体片段。用于确定TLR9表达的抗体是从例如以下公司可商业获得的：Imgenex(San Diego，CA；www.imgenex.com/Toll-likeReceptors.php)，例如，TLR9特异性抗体IMG-431和IMG-305A；lnvivogen(San Diego，CA；www.invivogen.com/family.php？ID＝162&ID_cat＝2&ID_sscat＝102)，例如，TLR9特异性抗体mab-mtlr9；Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA；www.scbt.com/table-tlr.html)，例如，TLR9特异性抗体sc-52966、sc-13218和sc-25468；和Cambridge Bioscience(Cambridge，UK；www.bioscience.co.uk/newsDetail.php？newsID＝107368)，例如，TLR9特异性抗体HM1042、905-730-100、IMG-305A和IMG-431。

通常优选将所述抗体或蛋白质固定在用于蛋白质印迹法和免疫荧光技术的固相支持物上。合适的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。

本领域技术人员会知道许多其他合适的用于结合抗体或抗原的载体并且能够将这种支持物适用于本发明中。例如，从细胞分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行并且被固定到固相支持物如硝酸纤维素膜上。该支持物可以随后用合适的缓冲液洗涤，随后用可检测标记的抗体处理。这种固相支持物可以随后用缓冲液第二次洗涤以除去未结合的抗体。可以通过常规手段检测在该固相支持物上结合的标记物的量。使用电泳技术检测蛋白质的手段是本领域技术人员熟知的(通常见，R.Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)Methods inEnzymology第182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.，N.Y.)。

其他的标准方法包括本领域技术人员熟知的免疫测定技术并且可以在Principles And Practice Of Immunoassay，第2版，Price和Newman编著，MacMillan(1997)和Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow和Lane编著，Cold Spring Harbor Laboratory，第9章(1988)中找到，所述每种文献通过引用方式并入完整地本文。

在免疫测定法中用来确定TLR9表达水平的抗体可以用可检测的标记物标记。就探针或抗体而言，术语“被标记的”意图包括通过偶联(即，物理连接)可检测物质至探针或抗体而直接标记该探针或抗体，以及通过与被直接标记的另一种试剂反应而间接标记该探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体和用生物素末端标记DNA探针，从而可以用荧光标记的链霉亲和素检测到该探针。在一个实施方案中，将抗体标记，例如，放射标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体。在另一个实施方案中，与TLR9特异性结合的抗体衍生物(例如，与底物或与蛋白质或与蛋白质-配体对(例如，生物素-链霉亲和素)的配体缀合的抗体或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体超变结构域等)。

在本发明的一个实施方案中，使用蛋白质组方法，例如，质谱法。质谱法是由电离化学化合物以产生带电荷分子(或其片段)并且测量其质荷比组成的一项分析技术。在常见的质谱方法中，从受试者获得样品，上载于质谱仪上，并且通过不同方法使样品的组分(例如，TLR9)(例如，通过用电子束轰击它们)电离，从而导致带电荷粒子(离子)的形成。随后从离子在其穿越电磁场时的运动，计算所述粒子的质荷比。

例如，涉及施加生物学样品如血清至蛋白质结合芯片的基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)或表面增强的激光解吸附/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF MS)(Wright，G.L.，Jr.等人(2002)Expert Rev Mol Diagn 2：549；Li，J.等人(2002)Clin Chem 48：1296；Laronga，C等人(2003)Dis Markers 19：229；Petricoin，E.F.等人(2002)359：572；Adam，B.L.等人(2002)Cancer Res 62：3609；Tolson，J.等人(2004)Lab Invest 84：845；Xiao，Z.等人(2001)Cancer Res 61：6029)可以用来确定TLR9的表达水平。

另外，确定TLR9表达水平的体内技术包括将针对TLR9的标记抗体导入受试者中，其中所述标记抗体与TLR9结合并且使TLR9转化成可检测的分子。如上文讨论，通过标准成像技术，可以检测确定受试者中可检测性TLR9的存在、水平或甚至位置。

通常，优选在来自患有纤维化的受试者的样品中的TLR9表达水平和对照样品中的TLR9量之间的差异尽可能地大。虽然这种差异可以小到如用于确定表达水平的方法的检测限那样，但是，优选这种差异应当至少大于该评估方法的标准误并且优选地是比该评估方法的标准误大至少2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、100-、500-、1000倍或更多倍的差异。

B.鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物

使用本文所述的方法，可以筛选多种分子、尤其小到足以能够跨越细胞膜的分子，以鉴定调节例如降低TLR9表达和/或活性的分子。可以将如此鉴定的化合物提供给患有纤维化的受试者以抑制或减缓该受试者中纤维化的进展。

用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法(本文中还称作筛选测定法)包括使一等分试样的来自所述受试者的样品与化合物文库的每个成员分别接触；确定所述化合物文库的成员对Toll样受体9(TLR9)(或TLR9的活性)在每个所述等分试样中的表达水平的影响；和选择所述化合物文库的成员，与对照样品中TLR9的表达水平相比，所述成员降低等分试样中TLR9的表达水平和/或活性，从而鉴定出可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物。

如本文中可互换地使用，术语“TLR9活性”和“TLR9的生物学活性”包括由TLR9蛋白对TLR9反应性细胞或组织(例如树枝状细胞(DC))或对TLR9核酸分子或蛋白质靶分子所产生的活性，如根据标准技术在体内和/或体外所测定。TLR9活性可以是直接活性，如与TLR9靶分子接合例如，与衔接体分子例如MyD88接合或相互作用。备选地，TLR9活性是间接活性，如由TLR9蛋白与TLR9靶分子例如EDEM或在涉及TLR9的信号转导途径中的其他分子相互作用介导的下游生物学事件。TLR9的生物学活性是本领域已知的，并且包括例如，淋巴细胞增殖、细胞因子产生、核因子κB(NF-κB)的激活、应答于CpG DNA、DC成熟和/或辅助T细胞1型应答。

用于确定化合物对TLR9表达和/或活性的影响的方法是本领域已知的和/或在本文描述的。

可以使用本文所述的筛选测定法，评估多种试验化合物。术语“试验化合物”包括在本发明测定法中使用并且测定其影响TLR9表达和/或活性的能力的任何试剂或试验物质。可以在筛选测定法中，就其调节TLR9表达和/或活性的能力而言同时测试多于一种化合物例如多种化合物。术语“筛选测定法”优选地指这样的测定法，它们检验多种化合物影响选项的读出数的能力，而不是检验一种化合物影响读出数的能力。优选地，主题测定法鉴定这样的化合物，其中先前不知所述化合物具有正在被筛选的效果。在一个实施方案中，高通量筛选法可以用来测定化合物的活性。

候选/试验化合物包括例如1)肽，如可溶性肽，包括Ig加尾的融合肽和随机肽库成员(见例如Lam,K.S.等人(1991)Nature 354：82-84；Houghten，R.等人(1991)Nature 354：84-86)和由D-和/或L-构型氨基酸构成的组合化学衍生分子文库；2)磷酸肽(phosphopeptide)(例如，随机和部分简并性、定向磷肽文库的成员，见例如Songyang，Z.等人(1993)Cell 72：767-778)；3)抗体(例如，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合和单链抗体以及抗体的Fab、F(ab’)₂、Fab表达文库片段和表位结合片段)；4)有机和无机小分子(例如，从组合及天然产物文库获得的分子)；5)酶(例如，核糖核酸内切酶、水解酶、核酸酶、蛋白酶、合成酶、异构酶、聚合酶、激酶、磷酸酶、氧化还原酶和ATP酶)、6)TLR9分子的突变体形式，例如，该分子的显性失活突变体形式、7)核酸、8)糖和9)天然产物提取化合物。

可以使用本领域已知的组合文库方法中众多方法之任一方法获得试验化合物，所述组合文库方法包括：生物学文库法；空间可寻址平行固相或溶液相文库法；需要反卷积的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库法限于肽文库，而其余四种方法适用于肽、非肽低聚物或小分子化合物文库(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。

可以在本领域找到用于合成分子文库的方法实例，例如在：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等人(1994)J.Med Chem.37：2678；Cho等人(1993)Science 261：1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37：1233中找到。

可以在溶液(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)中或在珠(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364：555-556)、细菌(Ladner USP 5,223,409)、孢子(Ladner USP′409)、质粒(Cull等人(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390；Devlin(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，见上文)上呈现化合物的文库。

所述筛选测定法中鉴定到的化合物可以在调节一种或多种受TLR9调节的生物学应答例如纤维化的方法中使用。应当理解，可能需要将此类化合物在使其与细胞接触之前配制为药物组合物(见上文描述)。

一旦通过本文所述的多种方法之一鉴定到试验化合物，则可以随后进一步评估选出的试验化合物(或“目的化合物”)对细胞的影响，例如与适宜的对照(如未处理的细胞或用不调节所述生物学应答的对照化合物或载体处理的细胞)相比，通过使目的化合物与细胞在体内(例如，通过施用目的化合物至受试者或动物模型)或先体外后体内(ex vivo)(例如，通过从该受试者或动物模型分离细胞并且使分离的细胞与目的化合物接触，或者备选地，通过使目的化合物与细胞系接触)接触并且确定目的化合物对细胞的影响。

基于计算机用已知结构对TLR9的分析也可以用来鉴定将与TLR9结合的分子。此类方法将分子基于其与受体部位互补的形状排序。例如，使用3-D数据库，程序如DOCK可以用来鉴定将与TLR9结合的分子。见DesJarlias等人(1988)J.Med.Chem.31：722；Meng等人(1992)J.Computer Chem.13：505；Meng等人(1993)Proteins 17：266；Shoichet等人(1993)Science 259：1445。此外，可以分析某分子与TLR9的电子互补性以鉴定与TLR9结合的分子。可以例如使用如Meng等人(1992)J.Computer Chem.13：505和Meng等人(1993)Proteins 17：266所述的分子机械力场确定这一点。可以使用的其他程序包括在推定的配体对接中使用GRID力场的CLIX。见Lawrence等人(1992)Proteins 12：31；Goodford等人(1985)J.Med.Chem.28：849；Boobbyer等人(1989)J.Med.Chem.32：1083。

本发明还涉及使用前述筛选测定法所鉴定的化合物。

C.用于监测疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性的方法

还提供了用于监测疗法或治疗方案的有效性(例如，消除潜在病因(例如，毒素或感染物质)、抑制炎症(使用例如皮质类固醇类、IL-I受体拮抗剂或其他物质)、γ干扰素或抗氧化剂治疗)、促进基质降解或用于减低或减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展和/或治疗纤维化的任何其他治疗性方法)的方法。在这些方法中，评估一对样品中TLR9的表达水平(第一样品不经历治疗方案和第二样品经历该治疗方案的至少一部分)。第一样品中TLR9的表达水平相对于第二样品降低是该疗法有效减低患有纤维化的受试者中纤维化进展的指示。

在一个实施方案中，该疗法包括使用抗CCL21抗体(Pirece等人AJP2007和Pierce等人ERJ 2007)、抗PDGFβ抗体、抗IL-13抗体、抗TGFβ抗体、抗整联蛋白抗体、激酶抑制剂、LBA受体抑制剂或BMP调节蛋白。在另一个实施方案中，该疗法包含TLR9抑制剂，如免疫调节性序列(IRS)(见例如美国专利6,225,292)和其他DNA序列(见例如Stunz LL.等人(2002)Eur J.Immunol.32(5)：1212-22)。

D.用于选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法

Noble，P.等人最近已经报道，纤维化进展的变异性已经扰乱了纤维化治疗临床试验中所获得的数据(见例如Noble，P.等人(2009)Am.J.RespirCrit Care Med.179：Al 129)。本发明人的发现是：TLR9的表达水平区分快速进展患者与缓慢进展患者，这起到减少参与纤维化治疗临床试验的受试者中变异性的作用。通过鉴定例如最可能从新疗法或从已知疗法(例如，具有不良副作用高风险谱的已知疗法)中受益的受试者，确定TLR9的表达水平还用于选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者。例如，医师一般基于受试者的预期净收益为受试者选择治疗方案。净收益源自风险/收益比。本方法允许选择借助介入治疗更可能受益的受试者，从而在选择治疗方案方面辅助医师。这可能包括在预期收益的可能性已经增加的情况下，使用具有较高风险谱的药物。类似地，临床研究者可能需要为临床试验选择采用特定方案时获得净收益的可能性高或低的群体。本文所述的方法可以由临床研究者用来选择这种受试者。因而，在一些实施方案中，所述方法通过选择作为快速进展者和/或缓慢进展者的受试者，为临床试验提供准入标准和用于选择受试者的方法。

用于选择参与临床试验的受试者的方法包括确定Toll样受体9(TLR9)在来自患有纤维化的受试者的样品中的表达水平，并且比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的较高表达水平是所述受试者应当参与所述临床试验的指示，从而选出参与治疗纤维化的临床试验的受试者。在另一个实施方案中，与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的较低表达水平是所述受试者应当参与所述临床试验的指示。

E.用于使用TLR9拮抗剂抑制纤维化进展的方法

本发明还提供用于抑制细胞中纤维化进展的方法，所述细胞例如是肺细胞、肝细胞、肾细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、皮肤细胞、眼细胞或胰细胞。所述方法包括使细胞与有效量的TLR9拮抗剂接触，因而抑制该细胞中纤维化的进展。

本发明还提供了用于抑制受试者中纤维化进展的方法。所述方法包括施用有效量的TLR9拮抗剂至所述受试者，因而抑制该受试者中纤维化的进展。

“抑制纤维化进展”的方法包括施用TLR9拮抗剂至受试者，目的是治愈受试者或延长其健康或存活超过在这种治疗不存在的情况下所预期的健康或存活。在一个实施方案中，“抑制纤维化的进展”包括减轻纤维化疾病或病状的严重性或减缓其一种或多种症状。例如，“抑制纤维化的进展”包括减轻受试者中纤维化疾病症状(例如，与肺纤维化相关的气短、乏力、咳嗽、体重减轻、食欲减退或厌食、乏力或体重减轻)至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。

如本文所用的术语“患者”或“受试者”意图包括人和兽医患者。在一个特定的实施方案中，受试者是人。术语“非人动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、小鼠、兔、绵羊、犬、奶牛、鸡、两栖类和爬行类。

如本文所用，术语“拮抗剂”指下调TLR9活性的任何部分，包括下调TLR9表达或抑制TLR9功能的部分。在本发明的一个方面，所述拮抗剂可以是直接拮抗TLR9的任何部分。例如，在一个实施方案中，所述拮抗剂是肽或抗体，所述肽或抗体与TLR9结合并且防止TLR9与配体(例如，CpG)结合，因而抑制TLR9信号传导。在另一个实施方案中，所述拮抗剂是与TLR9的配体结合并且防止TLR9与该配体结合的肽或抗体。在本发明的另一个方面，所述部分通过调节TLR9信号传导途径中下游介体的活性，间接地拮抗TLR9。

代表性拮抗剂包括但不限于抗体、核酸(例如，反义分子，如核酶和RNA干扰剂)、免疫缀合物(例如，与治疗剂缀合的抗体)、小分子抑制剂、融合蛋白、adnectin、适体、anticalin、脂笼蛋白和TLR9衍生的肽化合物。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的治疗性和诊断性方法采用例如直接或间接结合至TLR9并且抑制TLR9活性和/或下调TLR9表达的抗体。

如本文中可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可以进一步再划分为超变区，名为互补决定区(CDR)，其间散布有较保守的区域，名为构架区(FR)。每个V_H和V_L由从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的3个CDR和4个FR组成。重链的可变区和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)结合。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简化为“抗体部分”)指保留与抗原(例如，TLR9)特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”中所包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)包括V_H和V_L结构域的dAb；(vi)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等人.(1989)Nature 341，544-546)；(vii)由V_H或V_L结构域组成的dAb；和(viii)分离的互补决定区(CDR)或(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成性接头连接。另外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条蛋白链中V_L区和V_H区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如，Bird等人(1988)Science 242，423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也意图包括这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗体片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段来使用。可以通过重组DNA技术或通过酶切割或化学切割完整免疫球蛋白产生抗原结合部分。

如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体以及天然存在或根据本领域熟知的方法重组产生的那些抗体。

在一个实施方案中，用于本发明方法中的抗体是双特异性抗体。“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤融合法或Fab′片段连接法。见例如Songsivilai和Lachmann，(1990)Clin.Exp.Immunol.79，315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148，1547-1553。

在另一个实施方案中，用于本发明方法中的抗体是例如PCT公开WO94/04678中所述的camelid抗体，所述文献的完整内容通过引用方式并入本文。

可以通过基因工程获得camelid抗体的一个区域(该区域是小的单可变结构域，确定为V_HH)以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质，从而产生称作“camelid纳米体”的低分子量抗体衍生蛋白。见美国专利号5,759,808；还见Stijlemans等人，2004 J.Biol.Chem.279：1256-1261；Dumoulin等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger等人，2003 Bioconjugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo等人，2002 Int.J.Cancer 89：456-62；和Lauwereys.等人，1998 EMBO J.17：3512-3520。Camelid抗体和抗体片段的工程化文库是例如从Ablynx、Ghent、Belgium可商业获得的。因此，本发明的一个特征是对TLR9具有高亲和力的camelid纳米体。

在本发明的其他实施方案中，用于本发明方法中的抗体是双体抗体(diabody)、单链双体抗体或双-双体抗体。

双体抗体是双价的双特异性分子，其中V_H和V_L结构域表达于单一多肽链上，由太短以至于不允许这两个结构域之间在相同链上配对的接头连接。所述V_H和V_L结构域与另一条链的互补结构域配对，因而产生两个抗原结合位点(见例如Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poliak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。双体抗体可以通过在相同细胞内表达两条具有V_HA-V_LB和V_HB-V_LA(V_H-V_L构型)或V_LA-V_HB和V_LB-V_HA(V_L-V_H构型)的多肽链来产生。它们大部分可以在细菌中以可溶性形式表达。

通过用大约15个氨基酸残基的接头连接两条形成双体抗体的多肽链，产生单链双体抗体(scDb)(见Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology，2(1)：21-36)。scDb可以在细菌中以可溶性活性单体形式表达(见Holliger和Winter，1997 Cancer Immunol.Immunother.，45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology，2(l)：21-36；Pluckthun和Pack，1997Immunotechnology，3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.，9(7)：617-21)。

双体抗体可以与Fc融合以产生“双-双体抗体(di-diabody)”(见Lu等人，2004 J.Biol.Chem.，279(4)：2856-65)。

也可以在本发明的方法中使用这样的结合TLR9的分子，所述分子显示出抗体的功能特征，但是从其他多肽(例如，除由抗体基因编码或通过抗体基因体内重组所产生的那些多肽之外的多肽)衍生它们的构架部分和抗原结合部。这些结合分子的抗原结合结构域(例如，TLR9结合结构域)经定向进化过程产生。见美国专利号7,115,396。与抗体可变结构域的总体折叠具有相似总体折叠(“免疫球蛋白样”折叠)的分子是适宜的支架蛋白。适于衍生抗原结合分子的支架蛋白包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、生肌蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生物性色素蛋白、髓鞘质膜黏附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I组结构域、肌球蛋白-结合蛋白C的I组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白-结合蛋白H的I组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白(neuroglian)、生长激素受体、红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、β-葡糖苷酸酶、转谷氨酰胺酶、T细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和奇异果甜蛋白。

为产生非抗体的结合分子，创建克隆文库，在所述克隆文库中将形成抗原结合表面的支架蛋白区域(例如，在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白折叠类似的区域)内的序列随机化。检验文库克隆与目的抗原(例如，TLR9)的特异性结合和其他功能(例如，抑制TLR9的生物学活性)。可以使用选择的克隆作为进一步随机化和选择的基础以产生对抗原亲和力更高的衍生物。

在美国专利号6,818,418和7,115,396；Roberts和Szostak，1997 Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：12297；美国专利号6,261,804；美国专利号6,258,558；和Szostak等人WO98/31700中描述了，例如使用纤连蛋白III的第十模块(¹⁰Fn3)作为支架，产生高亲和力结合分子，所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文。

非抗体的结合分子可以作为二聚体或多聚体产生以增加针对靶抗原的亲合力。例如，将抗原结合结构域表达为形成Fc-Fc二聚体的带有抗体恒定区(Fc)的融合物。见例如美国专利号7,115,396，其完整内容通过引用方式并入本文。

也可以通过使用抗体片段和抗体模拟物，实施本发明的治疗方法。如下文详述，现在已经开发了多种抗体片段和抗体模拟技术并且它们是本领域广泛已知的。尽管众多这些技术如结构域抗体、纳米体和UniBody利用了传统抗体结构的片段或其他修饰形式，但是也存在备选性技术，如采用下述结合结构的Adnectin、亲和体、DARPin、anticalin、avimer和Versabody，其中所述结合结构因不同机理产生并且借助不同机理发挥功能，同时它们模拟传统的抗体结合作用。在Gill和Damle(2006)17：653-658中综述了这些备选性结构中的某些。

结构域抗体(dAb)是抗体的有功能的最小结合单位，对应于人抗体重链(V_H)或轻链(V_L)的可变区。Domantis已经开发了一系列庞大和高度地有功能的完整人V_H和V_L dAb文库(每个文库中超过100亿个不同的序列)并且使用这些文库来选择对治疗靶特异性的dAb。与许多常规抗体相反，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞***中充分表达。结构域抗体和其产生方法的进一步细节可以通过参考美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684及0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609获得，所述文献每一篇的内容通过引用方式并入完整并入本文。

纳米体是抗体衍生的治疗性蛋白质，其含有天然存在的重链抗体的独特结构性和功能性特征。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要地，克隆和分离的VHH结构域是具有原始重链抗体的完整抗原结合能力的非常稳定的多肽。纳米体与人抗体的VH结构域具有高度同源性并且可以进一步人源化，而没有活性的任何丧失。

纳米体由单基因编码并且在几乎全部原核和真核宿主例如大肠杆菌(见例如U.S.6,765,087，其通过引用方式并入完整并入本文)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(见例如美国6,838,254，其通过引用方式并入完整并入本文)中高效地产生。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的纳米体。因为与常规抗体相比，纳米体显示出优越的稳定性，故可以将它们配制为货架期长的即用型溶液剂。

纳米克隆方法(见例如WO 06/079372，其通过引用方式并入完整并入本文)是一种基于自动化高通量选择B细胞，针对想要的靶产生纳米体的专利方法，并且可以在本发明的上下文中使用。

UniBody是另一种抗体片段技术，然而这种技术基于除去IgG4抗体的铰链区。铰链区的缺失产生了大小基本上为传统IgG4的一半并且具有单价结合区而不是IgG4抗体双价结合区的分子。也熟知的是，IgG4抗体具有惰性并且因而不与免疫***相互作用，这可以对于治疗其中不希望有免疫应答的疾病是有利的，并且这个优点传递到UniBody上。UniBody的进一步细节可以通过参考专利申请WO2007/059782获得，该文献通过引用方式并入完整并入本文。

Adnectin分子是从纤连蛋白的一个或多个结构域衍生的工程化的结合蛋白。在一个实施方案中，通过改变由分布于两个β折叠之间的多条β链组成的天然蛋白，从纤连蛋白III型结构域衍生adnectin分子。根据来源组织，纤连蛋白可以含有多个III型结构域，它们可以例如由¹Fn3、²Fn3、³Fn3等代表。Adnectin分子也可以从¹⁰Fn3相关分子的聚合物，而非简单的单体¹⁰Fn3结构衍生。

虽然天然¹⁰Fn3结构域一般与整联蛋白结合，但是如此改变适于变成adnectin分子的1⁰Fn3蛋白，从而结合目的抗原，例如TLR9。在一个实施方案中，对¹⁰Fn3分子的改变包括对β链的至少一个突变。在优选的实施方案中，改变连接¹⁰Fn3分子的β链的环区域以与目的抗原例如TLR9结合。

¹⁰Fn3中的改变可以通过本领域已知的任何方法引起，所述方法包括但不限于易错PCR、位点定向诱变、DNA改组或已经在本文中提到的其他类型的重组性诱变。在一个实例中，编码¹⁰Fn3序列的DNA的变体可以在体外直接合成并且随后在体外或在体内转录和翻译。备选地，天然¹⁰Fn3序列可以使用标准方法(如在例如美国专利申请号20070082365中那样进行)，从基因组分离或克隆并且随后使用本领域已知的诱变方法突变。

适体是可以在本发明的方法中使用的另一种类型的抗体模拟物。适体一般是与特定分子靶结合的小的核苷酸聚合物。适体可以是单链或双链核酸分子(DNA或RNA)，不过基于DNA的适体最常见地是双链的。对于适体核酸，不存在限定的长度；然而，适体分子最常见地长15至40个核苷酸。

可以使用多种技术产生适体，但是它们起初使用体外选择(Ellington和Szostak.(1990)Nature.346(6287)：818-22)和SELEX方法(指数富集的配体***进化)(Schneider等人1992.J Mol Biol.228(3)：862-9)开发，所述文献的内容通过引用方式并入本文。产生和使用适体的其他方法已经发表，包括Klussmann.The Aptamer Handbook：FunctionalOligonucleotides and Their Applications.ISBN：978-3-527-31059-3；Ulrich等人2006.Comb Chem High Throughput Screen 9(8)：619-32；Cerchia和de Franciscis.2007.Methods Mol Biol.361：187-200；Ireson和Kelland.2006.Mol Cancer Ther.20065(12)：2957-62；美国专利号：5582981；5840867；5756291；6261783；6458559；5792613；6111095；和美国专利申请号：11/482671；11/102428；11/291610及10/627543，所述文献均通过引用方式并入本文。

也可以在本发明的方法中使用由肽而不是核苷酸制成的适体分子。肽适体与核苷酸适体共有许多特征(例如，小尺寸和以高亲和力结合靶分子的能力)，并且可以通过与用来产生核苷酸适体的那些原理具有相似原理的选择方法产生这些肽适体，例如Baines和Colas.2006.Drug Discov Today.11(7-8)：334-41；和Bickle等人2006.Nat Protoc.1(3)：1066-91，所述文献通过引用方式并入本文。

亲和体(affibody)分子代表一类基于58个氨基酸残基蛋白质结构域的亲和蛋白，所述58个氨基酸残基蛋白质结构域源自葡萄球菌蛋白A的结合lgG的结构域之一。已经使用这种三螺旋束结构域作为构建组合噬菌体文库的支架，其中使用噬菌体展示技术，可以从所述噬菌体文库中选择针对所需分子的亲和体变体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，Binding proteins selected from combinatoriallibraries of an α-helical bacterial receptor domain(选自α-螺旋细菌受体结构域组合文库的结合蛋白)，Nat Biotechnol 1997；15：772-7.Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A(来自蛋白A组合工程的人免疫球蛋白A(IgA)特异性配体)，Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。亲和体和其产生方法的进一步细节可以通过参考美国专利号5,831,012获得，该文献通过引用方式并入完整并入本文。

DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白)是已经被开发以利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟物DRP(设计的重复序列蛋白)技术的一个实例。重复序列蛋白如锚蛋白或亮氨酸丰富重复序列蛋白是广泛存在的结合分子，不同于抗体，它们在胞内和胞外存在。它们的独特模块式架构以重复结构单元(重复序列)为特征，所述重复结构单元堆叠在一起以形成显示出可变和模块式靶结合表面的延长重复序列结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样化结合特异性的多肽组合文库。这种策略包括显示可变表面残基的自我相容性重复序列的共有设计和它们随机装配成重复序列结构域。

关于DARPin及其他DRP技术的额外信息可以在美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO 02/20565中找到，这两份文献因而均通过引用方式完整地并入。

anticalin是额外的抗体模拟物技术，然而在此情况下，结合特异性源自脂笼蛋白，一个在人组织和体液中天然和大量表达的低分子量蛋白质的家族。脂笼蛋白已经演化成在体内执行一类与生理转运和储存化学敏感或不溶性化合物相关的功能。脂笼蛋白具有健全的固有结构，其包含高度保守的β桶，所述β桶在该蛋白质的一端支撑4个环。这些环形成结合袋的入口，并且在该分子这部分中的构象差异解释了各个脂笼蛋白之间结合特异性的变异。

将脂笼蛋白克隆并且使它们的环经历工程化以产生anticalin，已经产生结构上多样的anticalin的文库，并且anticalin展示术允许选择和筛选结合功能，随后表达和产生可溶性蛋白用于在原核或真核***中进一步分析。研究已经成功显示：可以形成这样的anticalin，其对可以分离的实际上任何人类靶蛋白是特异的，并且可以获得纳摩尔或更高范围的结合亲和力。

也可以将anticalin编制为双重靶向蛋白，所谓Duocalin。Duocalin以使用标准制造工艺容易产生的一种单体蛋白质结合两个独立的治疗靶，同时保留靶特异性和亲和力，无论这两个结合结构的结构性取向是什么。

关于anticalin的额外信息可以在美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO 99/16873中找到，这两份文献因而均通过引用方式完整地并入。

在本发明上下文有用的另一个抗体模拟物技术是avimer。avimer从一个庞大的人胞外受体结构域家族中，通过体外外显子改组和噬菌体展示而演化，从而产生具有结合特性和抑制特性的多结构域蛋白质。连接多个独立的结合结构域已经显示产生亲合力并且与常规的单表位结合蛋白相比，导致改进的亲和性和特异性。其他潜在优点包括在大肠杆菌中简单和高效产生多重靶特异性分子、改进的热稳定性和蛋白酶抗性。已经获得针对多种靶的具有亚纳摩尔亲和力的avimer。

关于avimer的额外信息可以在美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，所述文献因而均通过引用方式完整地并入。

Versabody是可能用于本发明上下文的另一项抗体模拟物技术。Versabody是半胱氨酸＞15％的3-5kDa小蛋白质，其形成替换寻常蛋白质具有的疏水核心的高二硫键密度支架。用少数二硫键替换大量疏水性氨基酸(包含疏水核心)产生更小、更亲水(更少聚集和非特异性结合)、更抵抗蛋白酶和热并且具有更低T细胞表位密度的蛋白质，因为对MHC呈递作出最大贡献的残基是疏水性的。众所周知全部这四种特性影响免疫原性，并且预期它们共同造成免疫原性大幅降低。

关于Versabody的额外信息可以在美国专利申请公开号2007/0191272中找到，所述文献因而通过引用方式完整地并入。

将SMIPs^TM(小型模块化免疫药物-Trubion Pharmaceuticals)工程化以维持并且优化靶结合作用、效应子功能、体内半寿期和表达水平。SMIPS由3种不同的模块结构域组成。首先，它们含有结合结构域，可以由赋予特异性的任何蛋白质(例如，细胞表面受体、单链抗体、可溶性蛋白等)组成。其次，它们含有在结合结构域和效应子结构域之间充当柔性接头并且也帮助控制SMIP药物多聚化的铰链结构域。最后，SMIPS含有可以从包括Fc结构域的多种分子或其他专门设计的蛋白质中衍生的效应子结构域。设计的模块性(这允许用多种不同的结合结构域、铰链结构域和效应子结构域简单地构建SMIPs)提供了快速和可定制的药物设计。

关于SMIPs的信息，包括怎样设计它们的实例，可以在Zhao等人(2007)血液110：2569-77和以下美国专利申请号20050238646；20050202534；20050202028；20050202023；20050202012；20050186216；20050180970；和20050175614中找到。

在另一个方面，本发明的方法采用靶向TLR9并且抑制或下调TLR9的免疫缀合剂，可以靶向TLR9的药剂包括但不限于细胞毒性剂、抗炎药(例如甾体或非甾体抗炎药)或细胞毒素抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷基化剂(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)。

术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于(例如杀死)纤维化组织的任何药剂。实例包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

可以通过缀合(例如，化学地连接或重组表达)抗体至合适治疗剂，形成免疫缀合物。合适的药物包括，例如细胞毒性剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)和/或放射性同位素(即，放射缀合物)。可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。多种放射性核素可用于产生放射缀合的抗体。实例包括²¹²Bi、¹³1I、¹³1In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

可以使用多种双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)产生免疫缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是缀合放射性核苷酸至抗体的示例性螯合剂(见例如WO94/11026)。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用的TLR9拮抗剂是小分子。如本文所用，术语“小分子“是本领域术语，并且包括具有小于约7500、小于约5000、小于约1000分子量或更小于约500分子量并且抑制TLR9活性的分子。示例性小分子包括但不限于有机小分子(例如，Cane等人1998.Science 282：63)和天然产物提取物文库。在另一个实施方案中，该化合物是小的有机非肽化合物。类似于抗体，这些小分子抑制剂间接或直接抑制TLR9的活性。

在另一个实施方案中，在本发明方法中使用的TLR9拮抗剂是与编码TLR9的基因或与该基因的一部分互补的反义核酸分子或编码该反义核酸分子的重组表达载体。如本文所用，“反义”核酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因而，反义核酸可以与有义核酸以氢键结合。

反义核酸下调特定蛋白质在细胞中表达的用途是本领域熟知的(见例如Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis(作为遗传分析用分子工具的反义RNA)综述-Trends in Genetics，第1卷(1)1986；Askari，F.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334：316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 92：1981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2：47-59；Rossi，J.J.(1995)Br.Med.Bull.51：217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature372：333-335)。反义核酸分子包含与另一个核酸分子的编码链(例如，mRNA序列)互补的核苷酸序列并且因此能够与另一个核酸分子的编码链以氢键结合。与mRNA的序列互补的反义序列可以与存在于该mRNA的编码区、该mRNA的5′或3′非翻译区或连接编码区和非翻译区的区域(例如，在5′非翻译区和编码区的交界处)中的序列互补。另外，反义核酸可以在序列上与编码mRNA的基因的调节区，例如转录起始序列或调节元件互补。优选地，设计反义核酸，从而与mRNA的编码链上或3′非翻译区中起始密码子之前或跨越该起始密码子的区域互补。

可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计反义核酸。该反义核酸分子可以与TLR9 mRNA的整个编码区互补，更优选地是与TLR9 mRNA的编码区或非编码区的仅一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与TLR9 mRNA的翻译起点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以例如是约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长度。

可以使用化学合成和酶连接反应，利用本领域已知的方法构建反义核酸。例如，反义核酸分子(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸以提高分子的生物学稳定性或提高反义核酸与有义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。备选地，反义核酸可以使用表达载体以生物学方式产生，其中将一种核酸以反义方向亚克隆(即从所***核酸转录出的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)至所述表达载体。

一般将可以在本发明方法中使用的反义核酸分子施用至受试者或原位(in situ)产生，从而它们与编码TLR9的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，因而通过抑制转录和/或翻译来抑制表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补进行，或例如与DNA双链体结合的反义核酸分子的情形下，借助双螺旋大沟内的特异性相互作用进行。反义核酸分子的施用途径的实例包括在组织部位直接注射。备选地，可以修饰反义核酸分子以靶向所选择的细胞并且随后将其***性施用。例如，对于***性施用，可以修饰反义分子，从而它们特异性地结合至在所选择细胞的表面上表达的受体或抗原，例如通过将所述反义核酸分子连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸分子也可以使用本领域熟知并且例如在其完整内容并入本文的US20070111230中描述的载体递送至细胞。为实现反义分子的足够胞内浓度，优选其中反义核酸分子处于pol II或pol III强启动子控制下的载体构建体。

在又一个实施方案中，由本发明方法使用的反义核酸分子可以包括α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特定双链杂交分子，其中与常见β-单元相反，所述链相互平行分布(Gaultier等人(1987)NucleicAcids.Res.15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，(1987)，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，(1987)，FEBS Lett.215：327-330)。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰剂包括但不限于，包括与TLR9或其片段同源的RNA分子的核酸分子、“短干扰性RNA”(siRNA)、“短发夹”或“小发夹RNA”(shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干预或抑制靶基因表达的小分子。RNA干扰是一种转录后的定向基因沉默技术，其使用双链RNA(dsRNA)来降解含有与所述dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等人Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等人Genes Dev.13，3191-3197(1999))。当内源核糖核酸酶将较长dsRNA切割成较短的21或22个核苷酸长的RNA(称作小干扰性RNA或siRNA)时，该过程发生。较小的RNA区段随后介导靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒是从例如New England Biolabs和Ambion可商业获得的。在一个实施方案中，可以使用上文描述用于反义RNA的一项或多项化学。

在又一个实施方案中，反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸，如mRNA。因而，核酶(例如，在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中描述的锤头核酶)可以用来催化性切割TLR9 mRNA转录物，因而以抑制TLR9 mRNA的翻译。

备选地，可以通过靶向与TLR9的调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止TLR9基因转录的三螺旋结构，抑制基因表达。通常见Helene，C，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等人，1992，Ann.NY.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，L.J.，1992，Bioassays14(12)：807-15。

在另一个实施方案中，在本发明方法中使用的TLR9拮抗剂是源自TLR9氨基酸序列的融合蛋白或肽化合物。具体而言，所述抑制性化合物包含TLR9的融合蛋白或其一部分(或其模拟物)，其介导TLR9与靶分子(例如，CpG)的相互作用，从而TLR9与这种融合蛋白或肽化合物的接触竞争性抑制TLR9与所述靶分子的相互作用。使用本领域已知的标准技术，可以产生此类融合蛋白和肽化合物。例如，肽化合物可以通过使用标准肽合成技术的化学合成产生并且随后通过本领域已知的用于将肽导入细胞中的多种手段(例如，脂质体等)导入细胞中。

本发明的融合蛋白或肽化合物的体内半寿期可以通过进行肽修饰来改进，如添加N-联糖基化位点至TLR9中或将TLR9与聚(乙二醇)(PEG；PEG化)缀合，例如，通过赖氨酸-单一PEG化。已经证明此类技术在延长治疗性蛋白质药物的半寿期方面是有益的。预期本发明TLR9多肽的PEG化可以产生相似的药用优点。

此外，可以通过导入非天然的氨基酸，在本发明多肽的任何部分实现PEG化。某些非天然氨基酸可以由Deiters等人，J Am Chem Soc125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang等人，Science 292：498-500，2001；Zhang等人，Science 303：371-373，2004或在美国专利号7,083,970中描述的技术导入。简而言之，这些表达***中的某些包括位点定向诱变以将无义密码子如琥珀TAG导入编码本发明多肽的可读框中。随后将此类表达载体导入宿主中，其中所述宿主可以利用对所导入的无义密码子特异并且装载所选择非天然氨基酸的tRNA。对缀合多个部分至本发明多肽的目的有益的具体非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些非天然氨基酸。含有这些新氨基酸的TLR9多肽随后可以在该蛋白质中的这些所选位点处PEG化。

本发明的方法还构思了TLR9拮抗剂与其他疗法组合的用途。因而，除使用TLR9拮抗剂之外，本发明的方法也可以包括施用一种或多种用于治疗纤维化病症的“标准”疗法至受试者。例如，所述拮抗剂可以与细胞毒素、免疫抑制剂、放射毒性剂和/或治疗性抗体组合组合(即一起或与其连接(即，免疫缀合物)施用。由本发明构思的具体共用治疗药包括但不限于类固醇(例如，皮质类固醇，如***)、免疫抑制药和/或抗炎药(例如γ-干扰素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、青霉胺、环孢菌素、秋水仙碱、抗胸腺细胞球蛋白、麦考酚酸酯和羟氯喹)、细胞毒性剂、钙通道阻滞剂(例如，硝苯地平)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、对氨基苯甲酸(PABA)、二甲基亚砜、转化生长因子β(TGF-β)抑制剂、白介素-5(IL-5)抑制剂、和泛胱天蛋白酶抑制剂。可以与TLR9拮抗剂组合使用的额外的抗纤维化药包括凝集素(如在例如美国专利号7,026,283中描述，其完整内容通过引用方式并入本文)。吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-(1H)-吡啶酮)也可以与TLR9拮抗剂组合使用(美国专利号3,974,281；3,839,346；4,042,699；4,052,509；5,310,562；5,518,729；5,716,632；和6,090,822(每篇所述文献的完整内容明确地通过引用方式并入本文)描述了用于合成和配制吡非尼酮的方法和适用于本发明方法中的药物组合物中的特定吡非尼酮类似物)。

TLR9拮抗剂和共用治疗剂或共用疗法可以在相同的制剂中施用或独立施用。在单独施用情况下，TLR9拮抗剂可以在所述共用治疗剂或共用疗法之前、之后或同时施用。一种药物可以在其他药物之前或在其之后以数分钟至数周范围的间隔时间施用。在将两种或更多种不同种类的治疗剂分别施加至受试者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间有显著的时间期间不到期，从而这些不同种类的药剂将仍能够对靶组织或细胞发挥有利的联合效应。

在一个实施方案中，可以将TLR9拮抗剂(例如，抗TLR9抗体)连接于例如与TLR9上不同靶或不同表位结合的第二种结合分子如抗体(即，因而形成双特异性分子)或其他结合剂。

如本文所用的术语“有效量”指TLR9拮抗剂的量，其中所述量在施用至受试者时足以抑制受试者中纤维化的进展。有效量将根据受试者和纤维化病症的严重性、该受试者的重量和年龄、施用方式等变动，这可以由本领域技术人员轻易确定。用于施用的TLR9拮抗剂剂量可以是范围从例如约1ng至约10000mg、约5ng至约9500mg、约10ng至约9000mg、约20ng至约8500mg、约30ng至约7500mg、约40ng至约7000mg、约50ng至约6500mg、约100ng至约6000mg、约200ng至约5500mg、约300ng至约5000mg、约400ng至约4500mg、约500ng至约4000mg、约1μg至约3500mg、约5μg至约3000mg、约10μg至约2600mg、约20μg至约2575mg、约30μg至约2550mg、约40μg至约2500mg、约50μg至约2475mg、约100μg至约2450mg、约200μg至约2425mg、约300μg至约2000mg、约400μg至约1175mg、约500μg至约1150mg、约0.5mg至约1125mg、约1mg至约1100mg、约1.25mg至约1075mg、约1.5mg至约1050mg、约2.0mg至约1025mg、约2.5mg至约1000mg、约3.0mg至约975mg、约3.5mg至约950mg、约4.0mg至约925mg、约4.5mg至约900mg、约5mg至约875mg、约10mg至约850mg、约20mg至约825mg、约30mg至约800mg、约40mg至约775mg、约50mg至约750mg、约100mg至约725mg、约200mg至约700mg、约300mg至约675mg、约400mg至约650mg、约500mg或者约525mg至约625mg的TLR9拮抗剂。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。有效量还是这样一种量，其中TLR9拮抗剂的任何有毒或有害作用(即副作用)最小化和/或被有益作用超过。

可以变动本发明方法中使用的TLR9拮抗剂的实际剂量水平，从而以获得有效成分的量，其中对于具体患者、组合物和施用模式，所述的量有效实现想要的应答，例如，抑制的纤维化进展，而对该患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的特定TLR9拮抗剂或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的拮抗剂的***速率、治疗的持续期、其他药物、与所用特定TLR9拮抗剂组合使用的化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医疗史等医学领域熟知的因素。具有本领域普通技术的医师或兽医师可以轻易地测定并且开具有效量的所需拮抗剂。例如，医师或兽医师可以按照比实现预期治疗效果所要求的水平低的水平开始投予该拮抗剂并且逐渐增加剂量直至实现预期的效果。通常，TLR9拮抗剂的每日合适剂量将史这样的量，其是产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常将取决于上文描述的因素。优选静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，优选地靠近靶部位施用。如果需要，TLR9拮抗剂的每日有效剂量可以作为2、3、4、5、6个或更多个次级剂量，在当日分别以适宜的间隔时间，任选地以单元剂量形式施用。尽管可以单独施用本发明的TLR9拮抗剂，然而优选作为药物制剂(组合物)施用该拮抗剂。

调整剂量方案以提供最佳的想要的应答(治疗应答)。例如，可以施用单次大丸剂，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或该剂量可以如治疗情况的迫切需要所示，按比例减少或增加。例如，在本发明方法中使用的TLR9拮抗剂可以每周一次或二次通过皮下注射或每月一次或二次通过皮下注射施用。

为了通过某些途径施用在本发明方法中所用的TLR9拮抗剂，可能需要以防止其失活的配方包含所述拮抗剂。例如，TLR9拮抗剂可以在适宜的载体例如脂质体或稀释剂中施用至受试者。可药用的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和物质的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或物质与活性TLR9拮抗剂不相容的情况下之外，构思了所述介质或物质在药物组合物中的用途。也可以随TLR9拮抗剂并入补充性活性化合物。

在本发明方法中使用的TLR9拮抗剂一般必须是无菌和在制造和储存条件下稳定的。可以将所述拮抗剂配制为溶液、微乳液、脂质体或适用于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。在许多情况下，将优选在组成上包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶，引起可注射组合物的吸收延长。

可以通过在具有上文所列举的一种成分或成分组合的适宜溶剂中以要求的量掺入活性拮抗剂，根据需要，随后无菌微量过滤，制备无菌可注射溶液剂。通常而言，通过将所述活性化合物掺入含有基础分散介质和来自上文所列举那些成分的其他所要求成分中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥法和冷冻干燥(冻干)法，所述方法产生有效成分的粉末，以及来自先前无菌过滤的溶液中的任何额外的想要的成分。

可以在本发明方法中使用的TLR9拮抗剂包括适于口服、经鼻、局部(包括颊部和舌下)、直肠、***和/或肠胃外施用的那些拮抗剂。制剂可以方便地以单位剂量形式呈现，并且可以由制药领域已知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量将根据正在治疗的受试者和具体施用模式变动。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量通常将是该拮抗剂的产生治疗效果的量。通常，以100％计，这个量将是从约0.001％至约90％，优选地从约0.005％至约70％，最优选地从约0.01％至约30％的有效成分。

如本文所用，短语“肠胃外施用”和“肠胃外方式施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可以随本发明方法中所用TLR9拮抗剂一起使用的合适的水质和非水质载体的实例包括水、乙醇、多元醇(甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。

TLR9拮抗剂也可以随辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂施用。可以通过消毒方法和通过纳入多种抗菌剂和抗真菌剂例如，尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保预防微生物的存在。也可能希望将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外，可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长吸收。

将本发明方法中使用的TLR9拮抗剂施用至人和动物时，这些拮抗剂可以单独或作为含有与可药用载体组合的例如0.001至90％(更优选地，0.005至70％，如0.01至30％)的有效成分的药学拮抗剂给予。

可以用本领域已知的医疗装置施用TLR9拮抗剂。例如，在优选的实施方案中，可以用无针头皮下注射装置如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的仪器施用拮抗剂。在本发明中有用的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续递送药物的可变流量的可植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔区室的渗透药物递送***；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送***。许多其他的此类植入物、递送***和模块是本领域技术人员已知的。

III.本发明的试剂盒

本发明还提供用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的试剂盒。这些试剂盒包括用于确定TLR9表达水平的设备和使用所述试剂盒的说明书。

本发明的试剂盒可以任选地包含用于实施本发明方法的额外组分。例如，所述试剂盒可以包含从受试者获得生物学样品的设备、对照样品，例如，来自患有缓慢进展的纤维化和/或不患纤维化的受试者中的样品，一个或多个样品区室，描述本发明方法实施的说明书材料和组织特异性对照/标准品。

用于确定TLR9表达水平的设备可以包括例如用于(例如，在mRNA或蛋白质水平)评价表达的测定法中的缓冲液或其他试剂。所述说明书可以是例如实施用于评价TLR9表达水平的测定法的印刷说明书。

用于从受试者分离生物学样品的设备可以包括一种或可以用来从受试者获得液体或组织的一种或多种试剂，如用于获得支气管灌洗液或经支气管活组织检查样品的设备。用于从受试者获得生物学样品的设备也可以包含用于从血样分离外周血单核细胞的设备，例如通过正选择单核细胞或通过去除单核细胞之外的全部其他细胞类型的负选择来分离。

本发明的试剂盒还可以包含用于培养从受试者所获得的样品的设备。

本发明的试剂盒也可以包含用于确定存在或不存未甲基化的CpG的设备、用于确定存在或不存在γ疱疹病毒的设备；用于确定额外标记物的表达水平的设备，其中所述的额外标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9；和/或用于确定培养的样品对TGFβ和CpG的反应性的设备，其中所述样品从受试者获得。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于确定对α平滑肌肌动蛋白表达和/或活性的调节作用的设备。在一个实施方案中，用于确定对α平滑肌肌动蛋白表达和/或活性的调节作用的设备包括用于确定从受试者获得的样品对TGFβ和CpG的反应性的设备。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括用于从受试者获得生物学样品(例如，经支气管活组织检查样品)的设备；用于确定对α平滑肌肌动蛋白表达和/或活性的调节作用的设备(例如，通过确定从受试者获得的生物样品对TGFβ和CpG的反应性)和使用该试剂盒的说明书。在一个实施方案中，此类试剂盒还可以包含用于确定TLR9表达水平的设备。在另一个实施方案中，此类试剂盒不包括用于确定TLR9表达水平的设备。

优选地，所述试剂盒设计用于人受试者。

本发明通过不应当解释为进一步起限制作用的以下实施例进一步说明。遍及本申请中引用的全部参考文献、专利和公布的专利申请的内容以及附图明确地通过引用方式完整并入本文。

实施例

I.材料与方法学

在这个部分中，描述实施例中所用的材料和方法学。

小鼠

下文描述的全部方法均在无菌、层流环境下进行并且经动物管理和使用委员会批准。使用成年的年龄匹配的雌性C.B-17-scid-beige(C.B-17SCID/bg)小鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)。在用于免疫受损小鼠的独立SPF(无特定病原体)设施中饲养SCID小鼠。C.B-17SCID/bg小鼠具有两个突变：第一个是scid突变并且第二个是beige突变，其导致细胞毒性T细胞和巨噬细胞功能的重大缺陷和NK细胞功能的选择性损害。

AE-IPF的人SCID模型

在胰蛋白酶消化150-cm²组织培养瓶后获得IPF/UIP(来自临床划分的快速或缓慢进展者)的单细胞制备物和正常成纤维细胞，并且将其用PKH26染料根据制造商的说明(Sigma Co.，St.Louis，MO)标记。将每个标记的成纤维细胞系稀释至2×10⁶个细胞/ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且将0.5ml这种悬液经尾静脉注射5至10只SCID小鼠的组中。35日后，全部组的小鼠均轻微麻醉并且通过鼻内递送法接受单次大丸剂的CpG-ODN(溶解于无菌盐水中)或盐水。将小鼠在经历入肺部成纤维细胞静脉内转移后63日通过颈椎脱臼法安乐死。在这些时间，剖取完整肺组织用于组织学及生物化学分析(见下文)。

IPF患者

分析了利用一项多专业、临床/放射学/病理学机制诊断患有IPF的23位患者(Flaherty，K.R.等人(2004)Am JRespir Crit Care Med170：904-910)。基线数据包括详细的临床评估结果、生理学研究结果、高分辨率计算机断层成像(HRCT)和外科肺活组织检查结果(SLB)。使用经验证的方法，产生HRCT异常的半定量性评分(Kazerooni，E.A.等人(1997)AJR Am J Roentgenol 169：977-983)。患者用多种治疗方案治疗并且密切追踪，同时在急性事件期间进行生理学研究并捕获临床信息。使用已经验证过的方法学，头一年随访期间的病情进展使用了一项生理学劣化复合数(composite)(Flaherty，K.R.，等人(2006)Am J Respir Crit CareMed 174：803-809)。基于基线生理学异常，生理学标准包括FVC降低＞10％和DLCO降低＞15％。使用标准(Collard，H.R.等人(2007)Am JRespir Crit Care Med 176：636-643)或全因死亡率定义IPF的急性恶化。这种复合方法是目前在NHLBI(ACE IPF)和产业赞助的试验(BUILD 3，Artemis)(www.Clinicaltrials.gov)中常用的。

细胞培养和单核细胞分化测定法

从健康成年志愿者采集血液。通过Ficoll-Paque Plus(GE HealthcareBiosciences，Piscataway，NJ，USA)，根据制造商的说明书，将PBMC从EDTA血液分离。使用人单核细胞分离试剂盒II和

LS柱分离器(Miltenyi Biotec)，通过负选择法纯化CD14+单核细胞。简而言之，针对CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a(血型糖蛋白A)的生物素缀合抗体混合物以及抗生物素微珠(anti-Biotin MicroBeads)产生了通过磁标记细胞的耗竭所获得的高纯度的未标记单核细胞。CD14+单核细胞(＞97％纯，如FACS分析所检测)以2.5×10⁶个细胞/孔的密度铺种在6孔平板中，所述平板含有

Hybri-Max^TM无蛋白质培养基(Sigma-Aldrich)，外加0.5％无菌BSA，具有或没有10ng/mL TGFβ。在3日后，对单核细胞不刺激或用50μg/mL无菌CpG-ODN、非CpG或聚IC再刺激。24小时后，将单核细胞培养物在相差显微镜下观察或如所述进行加工用于FACS分析。对于基因表达分析，将

试剂添加至每个孔，并且根据制造商的说明书进行RNA提取。使用RNAeasy RNA清洁试剂盒(Quiagen)纯化RNA，并且进行DNA酶柱上消化(Quiagen)。RNA浓度和纯度由Nanodrop确定并且通过琼脂糖凝胶电泳证实。纯化的RNA随后通过rtPCR逆转录成cDNA，并且汇集相似的处理物用于分析。

A549细胞培养和EMT测定法

A549细胞以40,000个细胞/孔的浓度接种于含有DMEM的12孔培养板中，所述DMEM补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。处理由仅用培养基、用CpG(5、10、50、100或200μg/mL)或TGFβ(0.1、0.5、1、5、10ng/mL)组成。将细胞(如所示)处理72或96小时并且随后经胰蛋白酶消化以如所描述那样分析。

TLR9的siRNA敲低

A549细胞以10,000个细胞/孔的浓度接种于含有DMEM的12孔培养板中，所述DMEM补充有5％胎牛血清。24小时后，细胞仍不作处理或用DharmaFECT转染试剂中的50nM ON-TARGETplus非靶向性siRNA汇集物、50nM ON-TARGETplus亲环蛋白B对照siRNA汇集物、或50nMTLR9 ON-TARGETplus siRNA SMART汇集物(Dharmacon，ThermoScientific)，根据制造商的说明书处理。将细胞孵育48小时用于RNA分析或孵育96小时用于蛋白质分析，以证实TLR9敲低。对于CpG介导的EMT，将所示浓度上的CpG添加至siRNA处理的细胞(如所示)持续72或96小时并且随后进行胰蛋白酶消化以如所描述那样分析。

统计分析

根据需要，全部结果均表示为均数±SEM或中位数。根据需要，通过非成对t-检验或Mann Whitney检验对比患者的基线特征。使用Cox回归分析，与随访头一年期间不经历病情进展的那些患者相比，对比在随访头一年期间经历病情进展的患者之间的总生存特征。通过两因素方差分析比较在不同时间点上各组之间的均数(Ivanova，L.等人(2008)Am JPhysiol Renal Physiol 294：F1238-1248)。使用非成对t-检验，在指出的情况下以Tukey-Kramer多重比较检验，进一步分析各个差异。将P＜0.1(＊)、P＜0.01(＊＊)和P＜0.001(＊＊＊)的值视为显著。

IPF的人-SCID模型的组织学分析

在颈椎脱臼后，从每只小鼠剖取右侧肺叶，用10％***溶液充分灌洗并且置于新鲜的***中24小时。使用标准组织学技术来石蜡包埋每只肺叶，并且将5-μm切片以Masson三色染色用于组织学分析。

原代肺成纤维细胞系的分离和培养

精细切碎UIP(来自临床分类的快速或稳定进展者)和正常SLB，并且将分散的组织片置于含有DMEM的150-cm²细胞培养瓶，所述DMEM补充有15％胎牛血清、1mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将全部原代肺细胞系在5％CO2培养箱中在37℃于DMEM-15中维持，并且连续传代总计5次，以产生肺成纤维细胞的纯群体，如先前详述(Hogaboam等人2005 Methods Mol Med.117：209-21)。来自每个患者组的全部原代成纤维细胞系在第6至第10代用于下文概述的实验中，并且全部实验均在可比较的条件下进行。将六孔组织培养板中的每个孔以2.5×10⁵个成纤维细胞接种，并且在75％汇合度时仅用培养基或用10ng/ml人重组IL-4，伴有或不伴有100mM CpG-ODN(Cell Sciences，CA)(TLR9的合成激动剂)刺激24小时。24小时后，收集无细胞上清液用于分析。

从SLB和原代肺成纤维细胞系制备RNA和cDNA。

在如上所述处理后，将TriZol试剂(lnvitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)添加至每个孔，并且随后根据制造商的说明书制备总RNA。在冰上融化后，将相同的过程应用于至7份(上肺叶和下肺叶)快速IPF/UIP、7份(上肺叶和下肺叶)稳定IPF/UIP和7份正常的SLB。随后使用BRL逆转录试剂盒和寡聚(dT)12-18引物，将源自SLB和所述成纤维细胞的纯化RNA逆转录成cDNA。扩增缓冲液含有50mmol/L KCl，10mmol/L  Tris-HCl，pH8.3和2.5mmol/L MgCl2(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。

实时TaqMan PCR分析

使用ABI PRISM 7500序列检测***(PE Applied Biosystems，FosterCity，CA)，通过实时定量性RT-PCR方法分析人TLR9、胶原蛋白1和αsma基因表达。对来自SLB样品的cDNA分析TLR9，并且对来自培养的单核细胞和A549细胞中的cDNA分析胶原蛋白1和αsma。使用GAPDH作为内对照。从Applied Biosystems购买用于TLR9的引物和探针。用于胶原蛋白1的引物和探针是：

正向TGGCCTCGGAGGAAACTTT(SEQ ID NO：l)和

反向TCCGGTTGATTTCTCATCATAGC(SEQ ID NO：2)，

MGB探针CCCCAGCTGTCTTAT(SEQ ID NO：3)；

对于αsma：正向GCGTGGCTATTCCTTCGTTACT(SEQ ID NO：4)和

反向GCTACATAACACAGTTTCTCCTTGATG(SEQ ID NO：5)，

MGB探针TGAGCGTGAGATTGT(SEQ ID NO：6)。对GAPDH归一化基因表达，并且如对每个试验所示那样，计算靶基因表达的倍数增加。

羟脯氨酸测定法

如先前对羟脯氨酸测定法所描述那样，从每只小鼠剖取左肺叶样品、均化和生物化学加工(ES Chen，BM Greenlee，M Wills-Karp，DR Moller：Attenuation of lung inflammation and fibrosis ininterferon-gamma-deficient mice after intratracheal bleomycin(气管内博来霉素给药后干扰素γ缺陷型小鼠中肺部炎症和纤维化的减弱).Am JRespir Cell Mol Biol 2001，24：545-55)。从羟脯氨酸标准曲线(0至100μg羟脯氨酸/ml)计算出羟脯氨酸浓度。将每份样品中的水平对每份样品中存在的由Bradford蛋白质测定法测量的蛋白质(以mg为单位)归一化。

流式细胞分析

在处理4日后，将单核细胞与Accutase^TM(eBiosciences)孵育15分钟以促进从细胞培养板非贴壁并且经历先前所述的用于流式细胞分析的操作方案(D Pilling，T Fan，D Huang，B Kaul，RH Gomer：Identification ofmarkers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes，macrophages，and fibroblasts(鉴定区分单核细胞源纤维细胞与单核细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的标记物).PLoS ONE 2009，4：e7475)。单核细胞用抗CD14-PE-Cy7、抗CD45RO-太平洋蓝、抗CXCR4-FITC染色。对于TLR9和胶原蛋白染色，将单核细胞用BD Perm/Wash^TM透化并且用TLR9-PE、用标记的胶原蛋白-生物素，随后用链霉抗生物素蛋白-APC染色。使用FACSCalibur和Cell Quest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)分析细胞。

免疫荧光

将单核细胞以350,000个细胞/孔的细胞密度添加至含有

Hybri-Max^TM无蛋白质培养基(Sigma-Aldrich)的8孔玻璃Labtek(NuncInc.，Naperville，1L)组织培养板中，所述培养基含有0.5％无菌BSA和用于特定试验的指定处理。将A549细胞以20,000个细胞/孔的细胞密度添加至含有DMEM的8孔玻璃Labtek平板中，所述DMEM补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素以及用于特定试验的指定处理。细胞用4％多聚甲醛固定并且在4℃用多克隆兔抗人胶原蛋白1(Abcamab292)或兔IgG同种型对照(Abcam)染色过夜。在PBS中反复洗涤后，将单核细胞与FITC缀合的小鼠抗兔IgG在4℃孵育1小时。将细胞在PBS中再次洗涤，封片并且使用荧光显微镜以40X放大率观察。

实施例1.IPF快速及缓慢进展形式的临床特征和外科肺生物活组织检查样品中差异性TLR9表达的鉴定

10位IPF患者在随访头一年期间显示病情进展，而13位则不显示；患者的平均随访时间是1154±03日。在随访头一年期间经历进展性病情的10位患者中，基于生理学进展，8位患者表征为进展者(6位患者中FVC，2位患者中DLCO)，1位患者经历IPF急性恶化并且在长于用来定义急性恶化的时间期限后，1位患者死于呼吸道病因。与随访头一年后显示病情进展的那些患者相比，总生存期在不显示病情进展的患者中更好(p＝0.03)(图1A)。表1列举在基线时的临床特征、生理特征、成像特征和组织学特征。

表1：快速及缓慢进展性IPF患者的临床特征

^＊至随访头一年期间出现首个事件的时间

显而易见，在人口学特征、生理学严重性或HRCT/组织学半定量性异常方面没显示统计显著差异。图1B显示缓慢进展者(小图1和2)和快速进展者(小图3和4)的代表性组织学。在两种类型的患者中，外科肺活组织检查样品展示异质性间质纤维化，伴有作为UIP特征的构造扭曲(小图1和3)和多灶性成纤维细胞灶(小图2和4)。在外科肺活组织检查时，没有病例具有IPF急性恶化的证据(即，弥散性肺泡损伤)。

最近已经报道，TLR9在IPF肺中高度表达并且CpG-ODN驱动体外IPF肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞(Meneghin，A.等人(2008)Histochem Cell Biol 130：979-992)。为了检验TLR9表达是否在快速进展性IPF中存在差异，在来自临床上划归为快速或稳定进展者的IPF患者的外科肺活组织检查样品中量化TLR9表达。图1C显示，与正常和稳定进展者相比，TLR9基因表达在来自快速进展性IPF患者的肺中升高。通过在来自快速进展者和缓慢进展者的外科肺活组织检查样品中TLR9的免疫组织化学分析，这些结果得到证实，其中所述的免疫组织化学分析显示TLR9蛋白的强度和定位(图1D)。图1D显示与其中明显TLR9染色似乎由免疫细胞展示的缓慢进展者相比(图1D小图1)，TLR9蛋白在快速进展者的肺的间质区域中增加(图1D小图3)。

实施例2.在TGFβ存在下，CpG-ODN在体外原代人血液单核细胞中诱导成纤维细胞样表型

基于先前研究结果：CpG诱导IPF成纤维细胞的肌成纤维细胞分化，确定了CpG是否也可以在与IPF发病机理相关的其他细胞类型中推动成纤维细胞样表型。检验了CpG对人血液单核细胞(它们是针对侵入性病原体的免疫应答的核心促进者)的影响。先前已经报道了独立的研究，成纤维细胞样细胞(“纤维细胞”)可以在无血清条件下在4日内从纯化的人CD14+单核细胞产生(Pilling，D.等人(2003)J.Immunol 171：5537-5546；Shao，D.D.等人(2008)J Leukoc Biol 83：1323-1333；Hong，K.M.等人(2007)JBiol Chem 282：22910-22920)。这与显示在血清存在下7日后在人PBMC培养物中存在缺少CD14的纤维细胞群体的其他报道矛盾(Hong，K.M.等人(2007)J Biol Chem 282：22910-22920；Yang，L.等人(2002)Lab Invest82：1183-1192)。在这些研究中，添加TGFβ至PBMC培养物促进纤维细胞分化，这最少由纺锤状形态和胶原蛋白I表达定义。因而，确定了CpG是否可以在纯化的CD14+单核细胞中推动纤维细胞样表型。

通过耗竭T细胞和B细胞、树枝状细胞、NK细胞、红细胞和干细胞的负选择法，针对表达CD14的细胞，纯化来自健康人供体的外周血单核细胞。图2A表示，将纯化的CD14+细胞在10ng/mL TGFβ存在或不存在情况下，铺种于无血清培养基中3日，此后它们不受刺激、用非刺激性对照CpG-ODN(non CpG)、CpG ODN或TLR3激动剂(聚I-C)刺激额外1日。借助相差显微镜观察的形态学评估揭示，在仅用培养基或与TGFβ组合时培养的单核细胞维持典型单核细胞表型的圆形形状(图2B小图1和2)。用non-CpG(图2B小图3和4)和聚I-C(图2B小图7和8)刺激的巨噬细胞中观察到相同表型，其中两种刺激均在TGFβ不存在和存在下进行。相反，单用CpG刺激(图2B小图5)和/或在TGFβ存在下用CpG刺激(图2B小图6)的单核细胞显示与纤维细胞相似的修长纺锤状细胞的不同群体。

为确定在培养物中观察到的差异是否与纤维细胞标记物的诱导对应，将RNA从粘附细胞分离和纯化并且通过定量性TaqMan实时PCR进行基因表达分析。α平滑肌肌动蛋白(αSMA)是主要在间充质细胞如平滑肌和成纤维细胞上表达的特定蛋白标记物并且一般不存在于非结构性细胞中。上调已经与肌成纤维细胞分化关联并且最近与纤维细胞分化关联。仅在用CpG刺激的单核细胞中观察到αSMA基因转录物的诱导(图2C小图1)。TGFβ不改变在用CpG刺激的细胞中的αSMA基因表达，这表明所述培养***中的αSMA基因表达上调是CpG特异性的。

与先前研究一致，观察到在TGFβ存在下培养时，单核细胞显示胶原蛋白1上调(图2C小图2)。然而，以下观察结果是有趣的，未刺激的单核细胞也表达胶原蛋白，这与已经报道巨噬细胞的确表达完整胶原蛋白类别的先前报道(Schnoor，M.等人(2008).J.Immunol 180：5707-5719)一致。虽然没有观察到与观察到的先前形态学差异(即CpG诱导的修长纺锤状细胞)相关的胶原蛋白表达差异，然而这些数据证实，TGFβ增加CD14+单核细胞中的胶原蛋白表达，但是这种作用可能仅限于TGFβ。

其次，通过免疫组织化学确定CpG是否影响培养的CD14+单核细胞中的胶原蛋白表达。图2D显示在仅用TGFβ培养(小图2)和仅用培养基中CpG刺激(小图3)的CD14+单核细胞中胶原蛋白染色的特异性上调。用CpG和TGFβ两者处理增强胶原蛋白1染色(小图4)，这与图2B小图6中展示的形态变化一致。另外，对胶原蛋白阳性CD14+CD45+单核细胞的流式细胞术定量表明，CpG增强TGFβ培养的细胞中的胶原蛋白1蛋白质表达(小图6)。

使用流式细胞分析法表征纤维细胞样单核细胞。初步观察在TGFβ存在或不存下培养的CD14+单核细胞的前向散射和侧向散射特征，证实CpG诱导与成纤维细胞样细胞形状一致的形态学变化。图2E(小图1)显示，大部分在仅有TGFβ时培养的单核细胞似乎在尺寸上较小(小图1)。相反，在TGFβ存在下用CpG刺激的单核细胞具有由前向散射和侧向散射增加(表示细胞尺寸和复杂性增加)的细胞组成的优势群体(全部细胞的72.3％)(小图2)。

源自单核细胞的纤维细胞被广泛表征为CD14阴性，并且其他研究组已经说明一旦分化成纤维细胞，PBMC丧失CD14表达(Abe，R.等人(2001)J.Immunol 166：7556-7562；Gomperts，B.N.和Strieter，R.M.(2007)J Leukoc Biol 82：449-456)。另外，连同TLR4和MD-2一起，CD14是巨噬细胞上LPS的细胞表面共同受体，该受体可以在细菌性感染期间脱落(Moreno，C等人(2004)Microbes Infect 6：990-995：Sandanger，O.等人(2009)J.Immunol 182：588-595)。确定了在本文所述的这种培养***中TGFβ的存在或不存在是否在纤维细胞分化期间影响CD14+单核细胞群体。图2E中的小图3显示，仅在培养基中培养时，4日后，＞95％的全体细胞是CD14-，并且CpG不影响该群体。在小图4中显示相反的结果，其中在含有TGFβ或TGFβ和CpG的培养基中培养时，CD14+单核细胞构成几乎100％的细胞群体。这些结果表明，单核细胞上的CD14表达是动态的并且CD14表达的丧失或维持并不必然地与其纤维细胞分化相关。

通过流式细胞术确定CpG对CD14+和CD14-单核细胞群体上调确定的纤维细胞标记物的作用。发现在CD14-细胞中，单独或与TGFβ组合的CpG诱导CD45(一种广泛用来表征纤维细胞的造血性标记物)的表达(图2E小图5和6)。也在与TGFβ培养的CD14+单核细胞中观察到CD45因CpG而上调(图2E小图6)。在仅用培养基中培养的CD14+细胞中没有观察到对CD45表达的影响(图2E小图5)。总体上，这些数据表明CpG在CD14+单核细胞中诱导了由诱导修长纺锤状形态和上调αSMA、胶原蛋白1和CD45蛋白定义的纤维细胞样表型。

实施例3.CpG-ODN在A549细胞中诱导上皮-间充质转换

基于单核细胞中观察到的CpG作用(图2)，推测CpG可以在上皮细胞中诱导经典EMT应答。人腺癌II型肺泡上皮细胞系A549已经广泛地用来研究TGFβ驱动的EMT(Rho，J.K.等人(2009).Lung Cancer63：219-226；Illman，S.A.等人(2006)J Cell Sci 119，3856-3865；Kasai，H.等人(2005)Respir Res 6：56)。用TGFβ处理A549导致细胞伸展和拉长，丧失上皮细胞标记物如E-钙黏着蛋白和表达间充质蛋白质，包括αSMA、胶原蛋白1和波形纤维蛋白。未处理的A549细胞在培养基中96小时后维持圆石状上皮形态和生长模式(图3A小图1)。作为阳性对照，A549细胞用增加浓度的TGFβ处理，并且在低至0.1ng/mL时，观察到明显的形态学变化。图3A的小图b是以5ng/mL培养96小时的A549细胞的代表性图像并且显示TGFβ诱导的细胞伸展和成纤维细胞样形态。为了检验CpG是否也可以诱导这些变化，A549细胞用增加浓度的CpG处理24、48、72和96小时，并且评估形态学变化和EMT标记物的表达。图3A小图3-7显示在96小时处理期间，CpG处理以浓度依赖性方式诱导了细胞伸展和修长纺锤状的细胞。

采用最低浓度的CpG时，早在24小时就观察到在相差光学显微镜下所评估的细胞形态变化，然而在72小时和96小时后出现最明显的作用。为证实用CpG观察到的形态学变化是否与EMT对应，从培养的A549细胞分离RNA，并且测量EMT标记物的基因表达。图3B显示CpG刺激αSMA的表达，在200μg/mL CpG上效果最佳(小图1)并表达。CpG处理A549细胞还导致波形纤维蛋白的浓度依赖性诱导，在200μg/mL CpG上效果最佳(图3B小图2)，这还伴随E-钙黏着蛋白表达的丧失(图3B小图3)。此外，荧光免疫细胞组织化学揭示了在96小时后由CpG在A549细胞中引起的胶原蛋白1的剂量依赖性诱导(图3D小图1-4)。这些数据显示CpG诱导在肺上皮细胞中EMT。为确定CpG是否也可以诱导来自A549细胞的先天免疫应答(Ronni，T.等人(1997)J.Immunol 158：2363-2374)，在增加CpG的浓度后测量IFNα基因表达。在用200μg/mL处理的细胞中检测到最佳的IFNα基因转录(图3D)，这表明在该浓度上观察到的EMT作用也与先天免疫应答相关。

为确定A549细胞中CpG-DNA诱导EMT是否为TLR9依赖性的，在检验这些细胞中CpG介导的EMT之前，通过RNA干扰对TLR9蛋白表达打靶并且评估敲低作用。用siRNA汇集物处理的A549细胞在96小时处理后96小时裂解，其中所述siRNA汇集物由针对空的(非靶)、参考蛋白亲环蛋白B或TLR9的4不同的特定序列组成。图3E小图1-4证实，TLR9蛋白表达在用TLR9 siRNA处理的细胞中消减，但是在用非靶或亲环蛋白B siRNA处理的细胞中不消减。另外，在这个时间点上的A549细胞外观如同处理培养基+仅转染试剂中所培养的那些A549细胞(图3E小图5)，并且没有在用非靶siRNA(图3E小图6)、亲环蛋白B siRNA或TLR9siRNA(图3E小图7)培养的细胞中显微观察到应激反应或形态变化的迹象。在来自相同实验的三复孔之一中通过蛋白质印迹法证实TLR9蛋白沉默后(图3E小图1-4)，剩余复孔中siRNA处理的A549细胞用CpGDNA刺激额外72小时并且自始至终监测形态的变化。在处理培养基+转染试剂中培养的A549细胞的形态似乎未改变(图3E小图8)。图3E小图9表明，非靶siRNA对抑制CpG介导的EMT没有影响，如细胞伸展和修长纺锤状细胞所示。也在用亲环蛋白B siRNA处理的细胞中观察到这种效应。相反，用TLR9 siRNA处理的A549细胞未能显示相似的形态学变化(图3E小图10)。这些细胞显示应激和凋亡状，这可能表明TLR9的完全消减可以在CpG-DNA存在下驱动肺泡上皮细胞中的旁路天然免疫应答。为进一步显示CpG以TLR9依赖性方式诱导EMT，从siRNA处理和CpG处理的培养A549细胞中分离RNA并且测量EMT标记物的基因表达。图3E的小图11和12显示，siRNA引起的TLR9沉默分别抑制CpG介导的波形纤维蛋白表达诱导和E-钙黏着蛋白表达下调。

实施例4 TLR9表达和对CpG-ODN应答在快速进展性IPF中增加

仅用培养基或在促纤维化刺激物IL-4存在下体外培养来自外科肺活组织检查样品的代表性肺成纤维细胞以检验TLR9基因转录物的诱导，其中所述外科肺活组织检查样品从显示快速病情进展的患者获得。与采用细胞系100A(缓慢进展者(图4b))时观察到的应答相比，用未甲基化的CpG-ODN(TLR9激动剂)刺激成纤维细胞细胞系204A(快速进展者)导致增加的TLR9表达(图4a)。

在培养细胞上清液中测量快速和缓慢进展性成纤维细胞的体外细胞因子产生，和比较它们在IL-4存在或不存在情况下对CpG-ODN的反应性。由于I型干扰素由细胞在有效TLR9信号传导时分泌，在来自培养的成纤维细胞细胞系的上清液中测量出IFNα蛋白质水平(Osawa，Y.等人(2006)J.Immunol 177：4841-4852)。在IL-4存在下用CpG刺激时，与缓慢进展性细胞系100A(图4d)相比，快速进展性细胞系204A(图4c)显示增强的IFNα产生。这个观察结果与204A在CpG-ODN和IL-4均存在下高度表达TLR9(图4a)一致。用CpG-ODN和IL-4同时刺激，快速进展性细胞系204A还显示促纤维化细胞因子PDGF(图4e)、MCP-1/CCL2(图4g)和MCP-3/CCL3(图2h)的分泌增加。这与采用缓慢进展性细胞系100A所观察到的反应相反，其中在IL-4存在下采用CpG时，所述100A对促纤维化细胞因子产生不显示可比较的作用(图2f、2h和2j)。综上所述，这些数据显示了来自快速和缓慢进展性IPF肺的肺成纤维细胞之间TLR9的差异表达模式和对CpG的应答。

实施例5.快速进展性人IPF成纤维细胞在IPF的人源化SCID模型中显示增加的纤维发生性(Fibrogenicity)

一种先前描述的人源化SCID小鼠模型用来在体内检验来自快速进展者及缓慢进展者的人肺成纤维细胞的纤维发生潜力(Pierce，E.M.等人(2007)Am J Pathol 170，1152-1164)。将从快速或缓慢进展者中培养的代表性肺成纤维细胞事先在体外分析(图4)并且静脉内转移至C.B.17SCID/bg小鼠中。在转移后第35日，小鼠以50μg CpG-ODN或盐水作鼻内攻击，并且在转移后第63日，评估纤维化(图5A)。在接收正常肺成纤维细胞的C.B.17SCID/bg小鼠中没有观察到肺部组织病理学(图5B小图1)。另外，在第35日用CpG攻击时，没有在这些小鼠中观察到效果(图5B小图2)。在转移后第63日组织学通过三色染色法对小鼠肺的评估揭示，快速进展性人UIP/IPF成纤维细胞的转移显示与严重间质增厚和重建相关的胶原蛋白沉积和肺泡腔明显破坏(图5B小图3)。另外，纤维化在第35日接受CpG攻击的那些肺中明显增强(图5B小图4)。这与接受稳定性人UIP/IPF成纤维细胞和CpG攻击的小鼠肺中观察到的纤维化程度形成鲜明对比。图5B显示，稳定性UIP/IPF人肺成纤维细胞引起在小鼠肺中适中的纤维化反应，如在转移后第63日所评估(小图5)，该反应不因CpG刺激物而增强(小图6)。羟脯氨酸是纤维化实验模型中常用的从头胶原蛋白合成标记物。在本研究中，在第35日测量来自C.B.17SCID/bg小鼠的一半肺样品中的羟脯氨酸水平，其中所述小鼠已经接受来自快速进展者的UIP/IPF人成纤维细胞并且在第35日用盐水或CpG攻击。如图5C小图a中所示，CpG攻击仅显著增加移植有来自快速进展性UIP/IPF患者中成纤维细胞的小鼠肺内的羟脯氨酸含量，这与在来自小鼠的肺中胶原蛋白沉积增加的组织学评估结果相关，其中所述小鼠已用快速进展性UIP/IPF成纤维细胞过继转移。另外，图5C小图2证实了图5B(小图5和6)中的组织学：CpG攻击不导致移植有来自缓慢进展性UIP/IPF患者中成纤维细胞的小鼠肺内羟脯氨酸含量增加。

讨论

特发性肺纤维化(IPF)是死亡率高和临床需要未满足的一种慢性、通常为进展性肺病。存在日益增加的证据，即除定居成纤维细胞增殖之外，这些细胞还从其他细胞来源产生，如源自骨髓的纤维细胞和上皮细胞(Laurent，G.J.等人(2005)Proc Am Thorac Soc 5：311-315)。几个研究小组已经展示，纤维细胞经趋化因子依赖性机制进入受损的组织并且成熟为产生胶原蛋白的肌成纤维细胞(Mehrad，B.等人(2007)Biochem Biophys ResCommun 353：104-108；Ishida，V.等人Am J Pathol 170：843-854；Moore，B.B.等人(2006)Am J Respir Cell Mol Biol 35：175-181；Kisseleva，T.等人(2006)J Hepatol 45：429-438)。另外，其他小组已经显示，上皮结构经上皮-间充质转换(EMT)分化成肌成纤维细胞(Iwano，M.等人(2002)J ClinInvest 110：341-350；Kim，K.K.等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：13180-13185；Rygiel，K.A.等人(2008)Lab Invest 88：112-123；Zeisberg，M.等人(2007)J Biol Chem 282：23337-23347)。针对纤维化疾病发病机理提出的这些机制是在全部组织如肾、肝脏、皮肤和肺中常见的。进一步研究所涉及的途径可以改善对患有变异形式的纤维化疾病(如IPF)的患者的治疗。

已经对IPF病情进展的病因学提出几种假设，但是仍未达成共识。虽然治疗药，如抗炎药，经常用来治疗纤维化，但是此类治疗可能具有不受欢迎的副作用。另外，目前针对纤维化病症，没有完全有效的疗法或治愈措施。

已经日益明确，IPF患者中的病程变化极大，一些患者在延长的时间段上显示病情稳定性，而其他患者显示病情快速进展(Martinez，F.J.等人(2005)Ann Intern Med 142：963-967)。虽然一些IPF患者显示生理衰退，但是其他IPF患者遭遇IPF的急剧劣化、急剧恶化(AE-IPF)(Hyzy，R.等人(2007)Chest 132，1652-1658)。因而，已经使用包括生理学进展、AE-IPF和/或全因死亡率的复合方法，定义IPF患者中的病情进展。对于IPF的精确治疗、预后和指示物，需要旨在理解病因学、风险因素和病情进展发病机理的严谨研究。病情进展的这种变异性的实践意义因最近报道的两项吡非尼酮试验的不一致结果而突显(Noble，P.等人(2009)Am.J.Respir CritCare Med.179：A1129)。在这两项研究中，吡非尼酮治疗组在随访期间预测的用力肺活量百分数方面显示相似的下降(-6.49％)，而安慰剂组的用力肺活量百分数在一项研究中下降9.55％，并且在另一项研究中下降7.23％。这种差异导致来自初步分析的极不同结果(在第一项研究中p＝0.001，并且在第二项研究中p＝0.501)。由于许多当前疗法研究强调大约一年期结果，因此在初始评价期间界定病程将具有巨大的实践价值。

对AE-IPF仍然缺乏了解，并且存在该疾病的这种加速期的患者在数周至几个月时间后面临死亡。没有***研究来自具有IPF的AE的患者的血清和BAL，并且因此，目前不存在对AE-IPF发病机理的分子研究。虽然AE-IPF的病因是未知的，但是一种可能解释来自在IPF患者的肺中检测到EBV(Tsukamoto，K.等人(2000)Thorax；Stewart，J.P.等人(1999)Am J Respir Crit Care Med 159：1336-1341；Tang，Y.W.等人(2003)J ClinMicrobiol 41：633-2640)：针对病毒性或细菌性感染的先天免疫应答可能增强潜在的纤维化反应。目前研究强烈地暗示TLR9(一种病原体识别受体)过量表达在IPF中推动快速进展。在本研究中，目的是鉴定作用机制，其中通过所述机制，TLR9因其识别CpG DNA而加快纤维化过程。

如本文所述，与来自稳定IPF患者的那些外科肺活组织检查样品相比，来自快速进展性IPF患者的外科肺活组织检查样品在临床上显示升高的TLR9基因转录物表达水平。本文中描述了来自这些患者的临床数据，它们使TLR9表达与IPF快速或缓慢进展性表型关联。在人口统计学特征、生理学异常、半定量性放射学异常和病理学异常方面，经历快速临床进展的那些患者与随访头一年范围内显示相对稳定性的那些患者相似。并不令人惊讶地，与具有相对稳定性的那些患者相比，显示快速进展的患者表现了总体上更差的存活期。因而，数据显示TLR9是IPF病情进展的指示物。最近，将膜联蛋白I鉴定为一种存在于AE-IPF患者中的新自体抗原，然而没有说明这些患者是否也拥有快速进展性疾病的更有力措施(Kurosu，K.等人(2008)J.Immunol 181：756-767)。有趣地，这项研究报道，与来自稳定性IPF患者的炎性浸润相比，炎性浸润(主要是淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)在AE-IPF的支气管肺泡灌洗液中升高，其中所述的稳定性IPF患者具有检测不到的这些急性炎症细胞量。先前也已经报道中性粒细胞弹性蛋白酶、黏蛋白KL-6、ST2蛋白、IL-8和α防卫素在具有AE的一些患者中升高，从而提示活化的T细胞和中性粒细胞的作用(Mukae，H.等人(2002)Thorax 57：623-62；Tajima，S.等人(2003)Chest124：1206-1214；Ziegenhagen，M.W.等人(1998)Am J Respir Crit Care Med157：762-768；Akira，M.等人(1999)J Comput Assist Tomogr 23：941-948；Yokoyama，A.等人(1998)Am J Respir Crit Care Med 158：1680-1684)。然而，这些标记物的血清水平没有证明是预后的一致预测物(Shinoda，H.等人(2009)Respiration)。

为了剖析TLR9可以籍此作为病原传感器和作为IPF中促纤维化介质而发挥作用的机制，使用来自健康供体的外周血单核细胞实施研究。一个最近报道证实，循环型纤维细胞(定义为CD45+-ColI+)在AE-IPF发作期间受评估的IPF患者中增加到15％外周血白细胞的平均数(Moeller，A.等人(2009)Am J Respir Crit Care Med)。现有研究扩展了纤维细胞检查以将它们鉴定为CpG DNA病原传感器。由于不能从处于急性恶化中期的IPF患者获得血液单核细胞，因此使用血液稚单核细胞来研究CpG在纤维化症背景下的激动潜能。先前的研究已经显示，通过移行至受伤部位并且在纤维化疾病中充当肌成纤维细胞的贡献源，骨髓源细胞(纤维细胞)促进伤口修复。纤维细胞是否从单核细胞产生仍在争论中，尽管已经显示TGF诱导CD14+单核细胞体外分化成CD14-/胶原蛋白-1纤维细胞。先前具有已经显示，CpG在培养的肺成纤维细胞中诱导肌成纤维细胞分化(Meneghin，A.等人(2008)Histochem Cell Biol 130：979-992)。另外，初步研究已经表明，CD14+单核细胞表达明显水平的TLR9基因转录物，这与Balmelli等人的先前报道相反，所述报道显示纤维细胞中表达TLR7，而不是TLR9(Balmelli，C等人(2007)Immunobiology 212：693-699)。在本研究中，检验了CpG也可以诱导CD14+单核细胞分化成纤维细胞的假设。本文中呈献的数据显示，CpG处理导致杂合单核细胞表型，其拥有纤维细胞标记物(纺锤状形态、CD45、胶原蛋白1和α-sma表达)和CD14。本文中还显示，CpG增强TGF分化，如细胞大小增加和胶原蛋白的免疫染色增加所示。这些数据证实，单核细胞可以以促纤维化方式应答于CpG并且可以代表对肺中肌成纤维细胞群体有贡献的独立细胞来源。

与这些结果一致，本文中说明，CpG-介导的A549人肺泡上皮细胞系分化与肌成纤维细胞表型相关。先前已经展示，A549细胞表达在功能上有活性的TLR9并且CpG诱导可能促进肿瘤进展的抗凋亡作用(Droemann，D.等人(2005)Respir Res 6∶1)。虽然本文没有在A549细胞中测量细胞因子分泌，但是应答于CpG的MCP-1/CCL2产生也可以导致吸引免疫细胞(Droemann，D.，等人(2005)Respir Res 6∶1)。虽然本文报道的CpG的作用来自转化的癌细胞系并且并非来自IPF患者的原代肺泡上皮细胞，但是数据显示，来自IPF肺的肺泡上皮细胞与正常肺泡上皮细胞更不可比，如已显示推动IPF肺中上皮细胞损伤、增生和EMT的Wnt/联蛋白信号传导作用增加所证实(Konigshoff，M，等人(2008)PLoS ONE 3：e2142；Kim，K.K.，等人(2009)J Clin Invest 119：213-224)。实际上，可以从这些数据得出结论：CpG-DNA由肺泡上皮细胞上表达的TLR9识别、促进EMT并且是AE-IPF发病机理的候选机制。

培养来自IPF患者外科肺活组织检查样品的肺成纤维细胞已经对建立IPF的人源化小鼠模型起到推动作用(Pierce，E.M.等人(2007)Am J Pathol170，1152-1164)。在这项研究中，扩展该模型以研究TLR9激活在进展性IPF中的作用。确定在SCID模型中，来自遭遇快速进展性过程的患者中的肺成纤维细胞对CpG DNA攻击显示过度反应性。与移植有正常或稳定性IPF成纤维细胞的那些小鼠相比，对移植有快速进展性IPF成纤维细胞小鼠鼻内给予CpG DNA单次大丸剂在这些小鼠肺中提高肺部纤维化反应。用相同IPF成纤维细胞细胞系实施的体外研究表明，CpG刺激导致促纤维化细胞因子从快速进展性成纤维细胞中的产生增强。因此，在这个SCID模型中，CpG诱导人促纤维化细胞因子在小鼠肺内产生并且促进来自人成纤维细胞的自分泌反应，所述自分泌反应导致增加的纤维化。这些数据显示，CpG由成纤维细胞内的TLR9识别是细菌性或病毒性组分在进展性IPF期间提高纤维生成的机制的另一种组分。

TLR9最近已经涉及其他纤维化疾病的实验模型。调查TLR9在实验性肝纤维化中作用的研究已经显示，TLR9缺陷型小鼠在肝纤维化的胆管粘连(BDL)模型中显示保护性纤维化效果，从而显示细菌DNA和TLR9在肝纤维化形成中的病理生理作用(Gabele，E.等人(2008)BiochemBiophys Res Commun 376：271-276)。在使用狼疮肾炎的鼠模型的独立研究中，还显示CpG-ODN增加肾纤维化，如MR^lpr/lpr小鼠中间质成纤维细胞增殖的量所度量(Anders，H.J.等人(2004)FASEB J 18：534-536)。另外，因异常细胞活化和增殖产生的其他疾病(如癌症)易感于感染性恶化。CpG以TLR9介导的机制促进乳腺癌上皮细胞以及***细胞的细胞性侵入(Ilvesaro，J.M，等人(2008)Mol Cancer Res 6：1534-1543；Ilvesaro，J.M.等人(2007)Prostate 67：774-781；Merrell，M.A.，等人(2006)Mol Cancer Res4：437-447)。已经显示与肝细胞癌相关的慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染在感染的肝细胞中诱导EMT并且促进细胞性侵入和转移(Battaglia，S.等人(2009)PLoS ONE 4：e4355)。在本研究中，检验了肺泡上皮细胞是否以相似方式应答于细菌组分或病毒组分。

在本文所述实验中使用的临床评估结果与从IPF肺成纤维细胞获得的体外和体内数据组合，提示肺泡室内的TLR9表达是快速进展性IPF的指示物。本文中显示，TLR9在免疫细胞上的表达对暴露于病原性刺激物的IPF患者中出现的过度伤口愈合反应有贡献。因此，度量来自常规诊断试验的外科肺活组织检查样品中的TLR9表达可以是用于确定IPF患者是否易遭遇急性恶化和快速进展性表型形成的预测工具。作为肝硬化患者中不良预后指示物，细菌DNA在血清和腹水中的存在目前受到积极研究(Zapater，P.等人(2008)Hepatolog 48：1924-1931；El-Naggar，M.M.等人(2008)J Med Microbiol 57：1533-1538)。虽然在这些研究中没有评估TLR9，但是它们提供了测量来自IPF患者的血清和BAL中未甲基化的CpG以及IPF患者肺活组织检查样品中TLR9表达的逻辑依据。另外，本研究提供了研究特定TLR9拮抗剂的治疗性设计方案的原动力。加入这种诊断参数可以鉴定风险、改善IPF患者的治疗方案并且充当使急性恶化的易感性最小化的预防性措施。

实施例6.从患有IPF的受试者获得的原代成纤维细胞培养物可以用来预测快速进展性IPF

从诊断为患有IPF的受试者分离和培养经支气管活组织检查样品(大约20mg组织)。用TGF□或CpG处理来自每个原代成纤维细胞系的双份培养物。结果显示，无论临床病情进展如何，全部成纤维细胞培养物均应答于TGF□，但是仅来自快速进展者的那些成纤维细胞应答于CpG。

等同物

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明具体实施方案的众多等同物。此类等同物将由以下权利要求书包括。认为从属权利要求中公开的实施方案的任意组合处于本发明的范围内。

Claims (43)

1.一种用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的方法，所述方法包括

确定Toll样受体9(TLR9)在来自所述受试者的样品中的表达水平；和

比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平增加是所述纤维化将快速进展的指示，从而预测纤维化在患有纤维化的所述受试者中的进展。

2.一种用于鉴定可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物的方法，所述方法包括：

使一等分试样的来自所述受试者的样品与化合物文库的每个成员分别接触；

确定所述化合物文库的成员对Toll样受体9(TLR9)在每个所述等分试样中的表达水平的影响；和

选择所述化合物文库的成员，与对照样品中TLR9的表达水平相比，所述成员降低等分试样中TLR9的表达水平，从而鉴定出可以减缓患有纤维化的受试者中纤维化进展的化合物。

3.一种监测疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性的方法，所述方法包括

确定Toll样受体9(TL9R)在样品中的表达水平，所述样品来自施用所述疗法的至少一部分至所述受试者之前和之后的受试者；和

比较TLR9在来自施用所述疗法之前的受试者的样品中的表达水平与TLR9在来自施用所述疗法至少一部分之后的受试者的样品中的表达水平，其中与TLR9在来自施用所述疗法之前的受试者的样品中的表达水平相比，TLR9在来自施用所述疗法至少一部分之后的受试者的样品中的表达水平降低是所述受试者应答于所述疗法的指示，从而监测到所述疗法在减低患有纤维化的受试者中纤维化进展方面的有效性。

4.一种选择参与治疗纤维化的临床试验的受试者的方法，所述方法包括

确定Toll样受体9(TLR9)在来自患有纤维化的受试者的样品中的表达水平；和

比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的较高表达水平是所述受试者应当参与所述临床试验的指示，从而选择出参与治疗纤维化的临床试验的受试者。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述纤维化选自特发性肺纤维化、肝移植后的肝纤维化、慢性丙型肝炎病毒感染后的肝纤维化、和局灶性节段性肾小球硬化中的间质纤维化。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述纤维化选自胰和肺的囊性纤维化、注射纤维化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性块状纤维化、肾源性***性纤维化。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述纤维化由外科植入人工器官引起。

8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，还包括确定来自所述受试者的样品中存在或不存在未甲基化的CpG。

9.根据权利要求1-4任一项所述的方法，还包括确定来自所述受试者的样品中存在或不存在γ疱疹病毒。

10.根据权利要求1-4任一项所述的方法，还包括确定所述样品中额外标记物的表达水平，所述的额外标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9。

11.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中TLR9在所述样品中的表达水平通过检测所述样品中存在TLR9基因的转录的多核苷酸或其部分来确定。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测步骤包括检测cDNA的步骤。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测步骤包括扩增所述转录的多核苷酸。

14.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中TLR9在所述样品中的表达水平通过检测所述样品中TLR9蛋白的存在来确定。

15.根据权利要求14所述的方法，其中使用与所述蛋白质特异性结合的抗体或其抗原结合片段，检测所述蛋白质的存在。

16.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中TLR9在所述样品中的表达水平通过使用选自聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量性逆转录酶PCR分析、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、免疫组织化学、ELISA测定法、阵列分析和它们的组合或次级组合的技术来确定。

17.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述样品包含从所述受试者获得的液体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述液体选自通过支气管灌洗收集的液体、血液、呕吐物、关节内液体、唾液、淋巴液、囊液、尿、通过腹膜淋洗收集的液体和妇科液体。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品是通过支气管灌洗收集的液体。

20.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述样品包含从所述受试者获得的组织或其组分。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组织选自肺、***、软骨、肺、肝脏、肾、肌肉组织、心脏、胰、骨和皮肤。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述组织是肺或其组分。

23.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

24.一种用于预测患有纤维化的受试者中纤维化进展的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定Toll样受体9(TLR9)表达水平的设备和使用所述试剂盒来预测患有纤维化的所述受试者中纤维化进展的说明书。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，还包含用于从受试者获得生物学样品的设备。

26.根据权利要求24所述的试剂盒，还包含对照样品。

27.根据权利要求24所述的试剂盒，还包含用于确定存在或不存在未甲基化的CpG的设备。

28.根据权利要求24所述的试剂盒，还包含用于确定存在或不存在γ疱疹病毒的设备。

29.根据权利要求24所述的试剂盒，还包含用于确定额外标记物的表达水平的设备，所述的额外标记物选自膜联蛋白1、α平滑肌肌动蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、KL-6、ST2、IL-8、α防卫素、β3-内联蛋白、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、HPS3、Rab38、Smad6、ADAMTS7、CXCR6、Bcl2-L-10和MMP-9。

30.一种抑制细胞中纤维化进展的方法，包括使所述细胞与有效量的Toll样受体9(TLR9)拮抗剂接触，因而抑制所述细胞中纤维化的进展。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞选自肺细胞、肝细胞、肾细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、皮肤细胞、眼细胞和胰细胞。

32.一种用于抑制受试者中纤维化进展的方法，包括施用有效量的Toll样受体9(TLR9)拮抗剂至所述受试者，从而抑制所述受试者中纤维化的进展。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述纤维化选自特发性肺纤维化、肝移植后的肝纤维化、慢性丙型肝炎病毒感染后的肝纤维化、和局灶性节段性肾小球硬化中的间质纤维化。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述纤维化选自胰和肺的囊性纤维化、注射纤维化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性块状纤维化、肾源性***性纤维化。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述纤维化由外科植入人工器官引起。

36.根据权利要求32所述的方法，还包括施用额外的治疗剂至所述受试者。

37.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者是人。

38.根据权利要求32所述的方法，其中将所述拮抗剂静脉内、肌内或皮下施用至所述受试者。

39.根据权利要求30或32所述的方法，其中所述TLR9拮抗剂选自抗体、小分子、核酸、融合蛋白、adnectin、适体、anticalin、脂笼蛋白和TLR9衍生的肽化合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体选自鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体和嵌合抗体。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体选自Fab、Fab’2、ScFv、SMIP、亲和体、avimer、versabody、纳米体、和结构域抗体。

42.根据权利要求39所述的方法，其中所述核酸是选自RNA干扰剂和核酶的反义分子。

43.一种监测Toll样受体9(TLR9)拮抗剂抑制受试者中纤维化进展的功效的方法，所述方法包括

确定Toll样受体9(TLR9)在来自已经施用过TLR9拮抗剂的受试者的样品中的表达水平；和

比较TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平与TLR9在对照样品中的表达水平，其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平增加是所述TLR9拮抗剂在抑制所述受试者中纤维化进展方面无效的指示，并且其中与TLR9在所述对照样品中的表达水平相比，TLR9在来自所述受试者的样品中的表达水平降低是所述TLR9拮抗剂在抑制所述受试者中纤维化进展方面有效的指示。

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