CN106573975A

CN106573975A - 抗il4‑il13双特异性抗体

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Publication number: CN106573975A
Application number: CN201580045437.XA
Authority: CN
Inventors: C·埃斯普利特; A·耶格施密特; C·苏布拉纳; A·苏布拉马尼亚姆
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-04-19
Also published as: CA2952902A1; SG11201610594WA; NZ728020A; EA201692495A1; TW201628647A; BR112016030568A2; WO2015198146A3; US20170145089A1; CL2016003317A1; WO2015198146A2; US20190359703A1; CA2952902C; AU2015278829B2; EA201692495A8; KR20170020519A; MX2017000171A; AU2015278829A1; SG10201811562YA; BR112016030568B8; US11136388B2

Abstract

本文公开了双‑V‑区抗体样结合蛋白(dual‑V‑region antibody‑like binding protein)或其片段的安全剂量，以及评估双‑V‑区抗体样结合蛋白或其片段与其靶标的结合的方法，与通过施用安全剂量的双‑V‑区抗体样结合蛋白或其片段治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法。在一些实施方案中，所述双‑V‑区抗体样结合蛋白或其片段结合IL‑4和IL‑13二者。

Description

抗IL4-IL13双特异性抗体

发明背景

白介素-4(IL-4)是一种对B淋巴细胞和T淋巴细胞、以及许多非淋巴细胞(包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞)具有广谱性生物效应的多效细胞因子。例如，IL-4引发静息B细胞上II类主要组织相容复合分子的表达，及增强人B细胞对IgG4和IgE的分泌。IL-4与Th2-型免疫应答有关，且由Th2细胞产生并促进其分化。IL-4已涉及多种病症，例如过敏和哮喘。

IL-13是一种112个氨基酸的细胞因子，其由活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和肥大细胞在活化后分泌(Minty,A.等,Nature,1993,362,248-250和McKenzie,A.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1993,90,3735-3739)。凭借着其与IL-4共有的许多生物学特性，IL-13已被描述为一种IL-4样细胞因子。其活性事实上与IL-4对B细胞(Defrance,T.等,J.Exp.Med.,1994,179,135-143,Punnonen,J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1993,90,3730-3734,Fior,R.等,Eur.Cytokine Network,1994,5,593-600)、单核细胞(Muzio,M.R.F.等,Blood,1994,83,1738-1743,De Waal Malefyt,R.等,J.Immunol,1993,151,6370-6381,Doyle,A.等,Eur.J.Immunol.1994,24,1441-1445,Montaner,L.J.等,J.Exp.Med.,1993,178,743-747,Sozzani,P.等,J.Biol.Chem.,1995,270,5084-5088)及其他非造血细胞(Herbert,J.M.等,Febs Lett.,1993,328,268-270和Derocq,J.M.等,FebsLett.1994,343,32-36)的活性相类似。另一方面，与IL-4相反，其不会对静息或活化的T细胞发挥特定的效应(Zurawuki,G.等,Immunol.Today,1994,15,19-26)。

A.J.Minty以及IL-13的综述文章中已详细描述了IL-13对单核细胞/巨噬细胞、B淋巴细胞和一些造血性前体的多种生物学活性。此外，一些数据指示，这种细胞因子对于其他细胞类型具有多效性作用。这些直接受IL-13影响的非造血细胞是内皮细胞和小胶质细胞、角质细胞以及肾和结肠肿瘤。

对由细胞内的生物分子传输的信号的分析中的阶段之一在于识别其膜受体。就此对IL-13受体所进行的调查研究已显示，IL-13和IL-4具有共同的受体，或至少为共同受体复合体的某些组分，以及共同信号转导元件(Zurawski S.M.等,EMBO J.,1993,12,2663-2670,Aversa,G.等,J.Exp.Med.,1993,178,2213-2218,Vita,N.等,J.Biol.Chem.,1995,270,3512-3517,Lefort,S.等,Febs Lett.,1995,366,122-126)。该受体存在各种细胞类型的表面，其数目根据所考虑的细胞类型而不同。A.J.Minty已指出了IL-13和IL-4受体的相对分布(Interleukin-13for Cytokines in Health and Disease.D.G.Remick和J.S.Frie编,Marcel Decker,N.Y.1996)。

细胞表面受体和受体复合体以不同的亲和力与IL-4和/或IL-13结合。与IL-4和/或IL-13结合的主要的受体和受体复合体组分是IL-4Rα、IL-13Rαl和IL-13Rα2。这些链作为IL-4Rα/IL-13Rαl(II型IL-4R)或IL-4Rα/γc(I型IL-4R)的单体或异二聚体表达于细胞表面。IL-4Rα单体及IL-4Rα/γc异二聚体与IL-4结合，但不与IL-13结合。IL-13Rα1和IL-13Rα2单体与IL-13结合，但不与IL-4结合。IL-4Rα/IL-13Rα1异二聚体与IL-4和IL-13二者结合(Murata等,Int.J.Hematol.,1999,69,13-20)。

Th2-型免疫应答促进抗体产生和体液免疫，并致力于击退胞外病原。Th2细胞是Ig生产(体液免疫)的介导体并产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13(Tanaka,等,Cytokine Regulation of Humoral Immunity,251-272,Snapper编,John Wiley andSons,New York(1996))。Th2-型免疫应答特征为产生某些细胞因子(例如IL-4、IL-13)及特定类型的抗体(IgE、IgG4)并且是典型的过敏反应，其可导致流眼泪及哮喘症状，例如气道炎症和肺中气道肌肉细胞收缩。

基于IL-4和IL-13的生物功能，它们都是治疗上重要的细胞因子并在许多疾病中起重要作用。已显示IL-4能抑制自身免疫疾病且IL-4和IL-13都显示出增强抗肿瘤免疫应答的潜能。IL-4和IL-13及其受体的升高与特发性肺纤维化(IPF)的发病机理相关联(Jakubzick等,Am J Pathol.(2004)164:1989-2001；Murray等Int J Biochem Cell Biol.(2008)40:2174-82)。文献中的证据证明了TH2细胞因子IL-4和IL-13在IPF的发病机理中作为该肺组织重塑和纤维化的介导物起多种作用。虽然肺中Th2-型CD4+T细胞可能是IL-4和IL-13的主要来源，且被牵涉作为胞外基质重塑的重要调节物(Wynn,Nat.Rev.Immunol,(2004)4:583-594)，其他的细胞类型(包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和上皮细胞)也可为这些细胞因子的潜在来源(Gordon和Martinez,Immunity Rev.(2010)32:593-604)。相较于正常对照，在IPF患者中，支气管肺泡灌洗液中的IL-13和IL-4水平是升高的。此证据表明，能抑制或中和这些细胞因子的疗法具有延缓IPF患者中纤维化进程的潜能。因为两种细胞因子都涉及过敏性疾病(allergic diseases)和纤维性疾病的发病机理，这些细胞因子的抑制剂可提供治疗益处。

因此，对于非免疫原性且用于人安全的，抑制IL-4、抑制IL-13的改进的试剂，和抑制IL-4和IL-13二者的单一试剂存有需求。

发明概述

本发明提供了优于现有技术的一些优点和进步。在一方面，本发明提供与IL-4和IL-13特异性结合的双-V-区抗体样蛋白或其片段在人受试者中的安全剂量，其中该剂量包含多至约200mg的所述抗体样蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。在一些实施方案中，所述安全剂量包含约200mg的抗体样蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述安全剂量包含约100mg的抗体样蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述安全剂量包含约50mg的抗体样蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述安全剂量是每周施用一次。在一些实施方案中，所述安全剂量以皮下施用。

在另一方面，本发明提供确定施用于人受试者的包含双-V-区抗体样结合蛋白或其片段的剂是否在人受试者中与IL-4或IL-13特异性地结合的方法，该方法包括：(a)将该剂施用于人受试者；及(b)测量抽自所述人受试者的血液、血浆或血清样品中的TARC/CCL17蛋白的量，其中，相对于施用该剂之前于受试者中测量的TARC/CCL17的量，血液中TARC/CCL17的量的下降表示双-V-区抗体样蛋白或其片段与IL-4或IL-13结合。在一些实施方案中，该方法进一步包括步骤(c)：依据步骤(b)中测量的TARC/CCL17下降幅度，增加或减少剂量。

在一些实施方案中，步骤(c)进一步包括：若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17下降低于阈值，则增加剂量，或若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17下降高于阈值，则减少剂量。在一些实施方案中，相对于施用该剂前于受试者中测量的TARC/CCL17的量，步骤(c)的阈值是TARC/CCL17的量的约20％至约60％下降。在一些实施方案中，相对于施用该剂前于受试者中测量的TARC/CCL17的量，所述阈值是TARC/CCL17的量的约40％至约50％下降。在一些实施方案中，相对于施用该剂前于受试者中测量的TARC/CCL17的量，所述阈值是TARC/CCL17的量的约43％下降。

在确定方法的一些实施方案中，所述剂量以皮下施用。在一些实施方案中，TARC/CCL17的量在步骤(b)中以酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测。在一些实施方案中，所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。

在另一个方面，本发明提供用于在人受试者中抗体或抗体样结合蛋白或其片段与IL-4或IL-13或二者结合的蛋白生物标志物，其中该生物标志物是TARC/CCL17。在一些实施方案中，所述抗体或抗体样结合蛋白或其片段是双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。

在另一个方面，本发明提供治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法，其包括对患有IPF的人受试者施用多至200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段结合IL-4、IL-13、或IL-4和IL-13二者。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段每周施用一次。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段以皮下施用。

在另一个方面，本发明提供双-V-区抗体样结合蛋白或其片段的安全剂量用于治疗特发性肺纤维化(IPF)的用途。在一些实施方案中，安全剂量是多至200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，安全剂量是约50mg，或约100mg，或约200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，安全剂量以皮下施用。在一些实施方案中，安全剂量每周施用一次。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段结合IL-4、IL-13、或IL-4及IL-13二者。

在另一个方面，本发明提供用于治疗特发性肺纤维化(IPF)的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段的安全剂量。在一些实施方案中，安全剂量是多至200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，安全剂量是约50mg，或约100mg，或约200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，安全剂量以皮下施用。在一些实施方案中，安全剂量每周施用一次。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段结合IL-4、IL-13、或IL-4及IL-13二者。

附图简述

当连同如下附图阅读时，可最好地理解下文对本发明实施方案的详细描述，其中：

图1显示IL-4和IL-13与TARC/CCL17信号传输的关系。

图2显示随着SAR156597剂量增加，人受试者血液中TARC/CCL17表达下降的趋势。

图3显示在第一次施用SAR156597后18周，人受试者血液中TARC/CCL17表达的持续下降。该图显示每周一次施用50mg、100mg或200mg SAR156597SC的患者血液中的TARC/CCL17平均量对时间。

图4显示剂量水平随时间的SAR156597波谷浓度(n＝6，但在100mg为n＝5)。

图5(图5A-5C)显示FRA-2过表达的转基因小鼠肺中随时间的纤维化变化。A.发育期间的肺重量增加；B.第16周时的肺尺寸增加；C.在Tg(FRA2)和Wt对照小鼠的肺中羟基脯氨酸含量增加。

图6显示FRA-2过表达小鼠的肺样品在9、14和17周时的图像。

图7显示相比于野生型对照，如通过羟基脯氨酸所测量的，FRA2小鼠皮肤中于13和16周的胶原含量。

图8显示相比于野生型对照，在8、13和16周时来自FRA2小鼠的样品中增加的皮层厚度。

图9显示发育中和纤维化中的肺和皮肤的细胞因子概貌分析。

图10显示来自FRA2小鼠的肺和皮肤中的基因表达分析，其显示关键的签注(signatory)纤维化标志物的增加。

图11显示IL-13Ab处理的FRA2小鼠肺中羟基脯氨酸水平。

图12显示FRA2和同窝出生对照肺中的组织病理学分析，其结果量化于图13中。

图14显示通过实时PCR对IPF生物标志物FN1、SPDEF和MUC5B的转录分析。

图15显示通过实时PCR对促纤维化标志物CCL2、CCL11和CCL22的转录分析。

图16显示通过实时PCR对IL-6、ARG1和IL13Ra2的转录分析。

图17显示肺均质物中IL-13、IL-4和IL-17蛋白表达水平，如通过ELISA分析。

图18显示肺均质物中MCP-1(CCL2)、CCL17和YKL-40蛋白表达水平，如通过ELISA分析。

图19A显示用于体内Fra-2的异位表达的转基因构建体，如Eferl等,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.105(30):10525-10530中所用的；图19B显示本文所用的Fra-2转基因载体，如实施例5中所述。

技术人员会了解，附图中的组件用于简单及清楚地说明且不一定是按照比例描绘的。例如，图中某些组件的尺度相对于其他组件可能过大以帮助改善对本发明实施方案的理解。

发明详述

除非另有说明，否则所有文中所用的技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同意义。

本文所引述的各出版物、专利申请、专利及其他参考文献在与本公开内容不相抵触的情况下，明确地通过提述以其整体并入本文。

需注意的是，除非上下文中明确地指出，否则如本说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指称。

需注意的是，术语如“优选地”、“通常”和“典型地”在本文并非用来限制要求保护的本发明的范围或暗示某些特征对于要求保护的本发明的结构或功能是重要的。而是，这些术语仅意在突显能或不能用于本发明具体实施方案中的替代性特征或额外特征。

出于描述和定义本发明的目的，需注意的是，术语“基本上”在文中用于表示能归因于任何定量比较、值、测量或其他表述的固有的不确定程度。，术语“基本上”在文中还用于表示定量性表述可由所述参照变化而不导致所述主题的基本功能的变化的程度。

此外，根据本发明，可应用本领域的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术于文献中由完整说明。参见例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本文中“Sambrook等,1989”)；DNA Cloning:A PracticalApproach,Volumes I and II(D.N.Glover编,1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；Animal CellCulture[R.I.Freshney编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。

如下提供一些术语和短语的非限制性定义用以指导技术人员。

如文中所用，术语“多肽”“蛋白”和“肽”可互换使用并意指由肽键连接的氨基酸单体链。通常，多肽链是无支链的。如本文所用的，术语“残基”或“蛋白残基”可互换使用并意指与其他氨基酸通过蛋白内的一个或多个肽键相键合的氨基酸。

“白介素-4(IL-4)”涉及天然存在的或内源性哺乳动物IL-4蛋白及具有与天然存在或内源性对应哺乳动物IL-4蛋白相同氨基酸序列的蛋白{例如重组蛋白、合成蛋白(即使用合成有机化学的方法产生的)}。因此，如本文定义的，此术语包括成熟的IL-4蛋白、多态或等位基因变体，和IL-4的其他同种型及前述的修饰或非修饰形式(例如脂质化，糖基化)。天然存在的或内源性的IL-4包括野生型蛋白如成熟IL-4、多态或等位基因变体，和哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的其他同种型和突变体形式。此类蛋白例如可从天然产生IL-4的来源回收或分离。这些蛋白和具有与天然存在或内源性对应IL-4相同的氨基酸序列的蛋白，以对应的哺乳动物的名字来指称。例如，当对应的哺乳动物是人时，该蛋白称为人IL-4。数种突变的IL-4蛋白是本领域已知的，例如公开于WO 03/038041中的那些。

“白介素-13(IL-13)”是指天然存在或内源性哺乳动物IL-13蛋白及具有与天然存在或内源性对应哺乳动物IL-13蛋白相同的氨基酸序列的蛋白(例如重组蛋白、合成蛋白(即使用合成有机化学的方法产生的))。因此，如本文定义的，此术语包括成熟的IL-13蛋白、多态或等位基因变体，和IL-13的其他同种型(例如通过可替换剪接或其他细胞处理产生的)及前述的修饰或未修饰形式(例如脂质化，糖基化)。天然存在的或内源性IL-13包括野生型蛋白如成熟IL-13、多态或等位基因变体，和哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的其他同种型和突变体形式。例如，本文所用的IL-13涵盖人IL-13变体，其中成熟人IL-13的位置110处的Arg由Gln取代(成熟IL-13的位置110相当于前体蛋白的位置130)，其与哮喘有关(特应性和非特应性哮喘)；以及IL-13的其他变体(Heinzmann等,Hum MoIGenet.(2000)9:549-559)。此类蛋白例如可从天然产生IL-13的来源回收或分离。这些蛋白和具有与天然存在或内源性对应IL-13相同的基酸序列的蛋白，以对应的哺乳动物的名字来指称。例如，当对应的哺乳动物是人时，该蛋白称为人IL-13。数种突变的IL-13蛋白是本领域已知的，例如公开于WO 03/035847中的那些。

在一些方面，本发明涉及治疗特发性肺纤维化(IPF)。基于其生物功能，IL-4和IL-13是治疗上重要的细胞因子，且在许多疾病，包括哮喘中起重要作用(Curr Opin AllergyClin Immunol 2005,Vo.5,161-166)。已显示IL-4能抑制自身免疫疾病，且IL-4和IL-13二者均显示增强抗肿瘤免疫应答的潜能。IL-4和IL-13及其受体的升高已与特发性肺纤维化(IPF)的发病机理相关联(Jakubzick C.等,Am J Pathol.2004:164(6):1989-2001；MurrayLA等Int J Biochem Cell Biol.2008:40(10):2174-82。文献中的证据证明了TH2细胞因子IL-4和IL-13在IPF的病理机制中作为这种肺组织重塑和纤维化的介导物起多种作用(Wynn,TA,Naat.Rev.Immunol,4:583-594,2004)，并且其他细胞类型(包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和表皮细胞)也可为这些细胞因子的潜在来源(GordonS和Martinez FO,Immunity Rev.32:593-604,2010)。在IPF患者中，支气管肺泡灌洗液中的IL-13和IL-4水平相比于正常对照是升高的。该证据表明，能抑制或中和这些细胞因子的疗法具有用于延缓IPF患者中纤维化进程的潜能。因为这二种细胞因子均涉及过敏性疾病或纤维性疾病的病理机理，这些细胞因子的抑制剂能提供治疗益处。

关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同”可解释为抗体链与参考多肽序列显示至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。关于核酸序列的该术语可理解为核苷酸序列与参考核酸序列显示至少约85％、90％、95％、96％、97％，98％、99％或更高的序列同一性。同一性可通过使用本领域技术人员可获得的任何生物信息学工具来测定。例如，基本局部比对搜索工具(BLAST)常用于确定序列同一性(Altschul等,JournaJ.Mol.Biol.(1990)215:403-410)。

术语“同一性”或“同源性”可指在比对序列和导入空位(若需要的话)以实现整个序列的最大同一性百分比后，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与其相比较的对应序列残基相同的百分比。无论N-端或C-端延伸还是***，都不应视为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是可获得的并为本领域已知的。序列同一性可使用序列分析软件来测量。

“取代的”变体是在天然序列中至少一个氨基酸残基被移除并在相同位置用在其位置***的不同氨基酸置换的那些。取代可以是单一的，其中在分子中仅有一个氨基酸被取代，或可以是多个的，其中同一分子中的二个或更多个氨基酸被取代。多数个取代可位于连续的位置。而且，一个氨基酸可被多个残基取代，在该情况下此种变体包含取代和***二者。“***的”变体是具有紧邻天然序列中特定位置处***的一个或多个氨基酸的那些。紧邻氨基酸是指与氨基酸之α-羧基或α-氨基官能团连接。“删除的”变体是在天然氨基酸序列中移除一个或多个氨基酸的那些。一般而言，删除的变体会具有在分子的特定区域删除的一个或两个氨基酸。

术语“抗体”以最广义来使用，且具体而言涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段或带有一个或多个CDR或CDR衍生序列的合成的多肽，只要所述多肽表现出期望的生物活性。抗体(Ab)及免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。一般而言，抗体视为具有定义或已识别的特异性的Ig。因此，当抗体对特定靶标显示结合特异性时，免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶标特异性的其他抗体样分子二者。本发明的抗体可为任何类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)，或亚类(例如IgG₁、IgG₂、IgG_2a、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂等)(“类型”和“类”，“亚型”“亚类”在本文可交换使用)。天然或野生型，其获取自群体的非人工操纵的成员、抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由2条相同的轻链和2条相同的重链(H)组成。每条重链在一端具有可变域(V_H)其后为多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(V_L)且在另一端具有恒定域。“非人工操纵”是指未经处理以含有或表达外来抗原结合分子。与等位基因或多态性相比，或与由操纵形式(例如诱变、重组方法的使用等以改变抗原结合分子的氨基酸)所得到的变体或衍生物相比，野生型可指在群体中所发现的最普遍的等位基因或种，或指获得自非操纵动物的抗体。

如本文所用的，“抗IL-4抗体”是指从其衍生的抗体或多肽(衍生物)，其其与如本文定义的IL-4特异性地结合，包括但不限于抑制或基本上降低IL-4与其受体结合或抑制IL-4活性的分子。

如本文所用的，“抗IL-13抗体”是指从其衍生的抗体或多肽(衍生物)，其与如本文定义的IL-13特异性地结合，包括但不限于抑制或基本上降低IL-13与其受体结合或抑制IL-13活性的分子。

在抗体可变域的上下文中的术语“可变”是指相关分子的特定部分，其在抗体之间和抗体中在序列上广泛不同并用于特定抗体对于其特定靶标的特异性识别和结合。然而，此可变性并非均匀地分布在抗体的可变域。可变性集中在三个称为互补决定区的区段(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)中，其也称为高变区，在轻链和重链可变域二者中均存在。可变域的较高保守性部分称为框架(FR)区或序列。天然重链和轻链的可变域各包括四个FR区，大多采用β-片层构象，通过三个CDR相连接，其形成环状连接，且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各链中的CDR常常通过FR区，与来自其他链的CDR聚在一起，促进抗体的靶(表位或决定簇)结合位点的形成(参见Kabat等Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD(1987))。除非另有说明，否则如本文所用的免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号***来进行。一个CDR可具有与同源表位特异性结合的能力。

如本发明中所用的术语“铰链”或“铰链区”是指包含在抗体的第一和第二恒定域之间的氨基酸的柔性多肽。

短语和术语抗体、抗原或抗原结合蛋白的“片段”“功能片段”“变体”“衍生物”或“类似物”等等以及其形式是具有与感兴趣的全长抗体或抗原共同的定性生物学活性的化合物或分子。例如，抗IL-4抗体的功能片段或类似物是能与IL-4分子结合，或可防止或基本降低配体或激动性或拮抗性抗体与IL-4结合的能力的那些。

此外，术语“片段”和“抗体片段”是指完整或全长链或抗体的一部分，一般而言是靶标结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于F_ab、F_ab'、F_(ab')2和F_v片段。例如，抗IL-4和/或IL-13抗体的片段或类似物是可防止或基本降低受体与配体结合或引发信号传输的能力的那些。如本文所用的，“片段”“功能片段”和“抗体片段”一般为同义的，且就抗体而言，可指能防止或基本降低受体与配体结合或引发信号传输的能力的片段，例如F_v、F_ab、F_(ab')2等等。

“F_v”片段由重链和轻链可变域以非共价结合的二聚体(V_H-V_L二聚体)组成。在此构象中，各可变域的三个CDR相互作用以确定V_H-V_L二聚体表面上的靶标结合位点，如在完整抗体中。总体上，六个CDR赋予完整抗体上的靶标结合特异性。然而，即使单一可变域(或F_v的一半，其仅包含对于靶标特异性的三个CDR)也能具有识别和结合靶标的能力。

“单链F_v”，“sF_v”或“scAb”抗体片段包含抗体的V_H和V_L域，其中这些域存在于单一多肽链中。一般而言，F_v多肽进一步包含V_H和V_L域之间的多肽接头，其通常是柔性分子，使得sFv能形成供靶标结合的所期望的结构。

术语“双抗体”是指具有2个抗原结合位点的抗体片段，其在同一多肽链中可包含重链可变域(V_H)与轻链可变域(V_L)，其互相连接。通过使用短到无法在相同链上在2个可变域间配对的接头，迫使双抗体与另一肽链上的结合域配对，以产生2个抗原结合位点。

“F_ab”片段含有轻链的可变域和恒定域以及重链的可变域和第一恒定域(C_H1)。F_ab’片段与F_ab片段的不同之处在于：在C_H1域的羧基端加入数个残基以包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。F_ab’片段可通过裂解F_(ab')2胃蛋白酶消化产物的绞链半胱氨酸处的二硫键来产生。抗体的其他酶和化学处理可产生其他感兴趣的功能片段。

术语“线性Fab”是指如Miller等(2003),J Immunol.170:4854-4861所述的四价抗体。线性Fab由串联的相同CH1-VH域组成，与相同轻链在各CH1-VH位置配对。已开发出这些分子以便于增加抗体的价数从而通过亲合效应增强其功能性亲和力，但它们是单特异性的。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合的”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于具体的抗体种类或亚类(型或亚型)的抗体中的对应序列是相同或同源的，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一的抗体种类或亚类的抗体中的对应序列是相同或同源的，以及此类抗体的片段，只要其表现出与IL-4和/或IL-13结合或影响IL-4和/或IL-13活性或代谢的期望的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；及Morrison等(1984),Proc Natl Acad Sci USA 81:6851)。因此，来自一类抗体的CDR可移接至不同种类或亚类的抗体的FR中。

单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一靶标位点、表位或决定簇。此外，与通常包括针对抗原的不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对靶标上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体在被宿主细胞合成时是有利的，其未被其他免疫球蛋白污染并提供克隆相关基因和编码其抗体链的mRNA。修饰语“单克隆”指抗体的特征为获取自基本同源的抗体群体，且不应解释为需要任何特别方法来制造此抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可使用熟知的技术从噬菌体抗体库分离或可从多克隆制备物纯化。依照本发明所用的亲本单克隆抗体可通过Kohler等(1975),Nature256:495所述的杂交瘤方法来制造，或可通过本领域已知的重组方法来制造。

如本发明中所用的术语“多价抗体”是指包含2个或更多个抗原结合位点的抗体，因此能结合2个或更多个抗原，其可同时具有相同或不同的结构。术语“二价”是指此抗体包含两个抗原结合位点。术语“四价”是指此抗体包括四个抗原结合位点。

如本发明中所用的术语“抗原结合位点”是指包含特异性地与部分或全部抗原结合或互补的区域的抗体的那部分。当抗原较大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，此部分称为表位。抗原结合域可通过一个或多个抗体可变域来提供。优选地，抗原结合域由抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)结合而构成。

如本发明中所用术语“抗原”是指能与本发明抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或一个以上的表位。被本发明抗体识别的抗原的实例包括但不限于血清蛋白，例如细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13、生物活性多肽、细胞表面分子例如受体、转运蛋白、离子通道、病毒和细菌蛋白。

如本发明中所用的术语“单特异性的”是指本发明的多价抗体仅识别一个抗原，所有的抗原结合位点是相同的。

如本发明中所用的术语“双特异性的”是指本发明的多价抗体在相同或2个不同抗原上识别2个不同的表位。

术语“双特异性抗体(BsAb)”是指在单一分子内组合2个抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能同时与2个不同的抗原结合。除了诊断目的的应用外，BsAb通过将强的效应***重定向于患病区域或通过增加抗体的中和或刺激活性而为新的治疗应用铺路。

生产在单一分子内组合2个抗体的抗原结合位点的双特异性抗体(BsAb)是感兴趣的。因此，此种分子能同时与2个不同的抗原结合。除了诊断目的的应用外，BsAb通过将强的效应***重定向于患病区域(其中癌细胞常形成由单克隆抗体引发的抑制正常免疫应答的机制，像抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC))，或通过增加抗体的中和或刺激活性而为新的治疗应用铺路。将针对不同靶标抗原的两个完整抗体的结合特异性加以偶联用于治疗目的的初始尝试利用了化学融合的异源缀合物分子(Staerz等(1985),Nature 314:628-631)。

双特异性抗体最初通过融合2个各自能产生不同免疫球蛋白的杂交瘤而产生(Milstein和Cuello,1983,1984)，但在细胞培养中产生的物种复杂性(多至10种不同的物种)造成纯化困难及费用昂贵(George和Huston,1997)。尽管如上所引述，使用由细胞融合所产生的异源缀合物或双特异性抗体得到了有前景的结果，但一些因素使其在大量治疗应用上是不切实际的。此类因素包括：体内异源缀合物的快速清除，产生各类型的分子所需要的实验室深度技术，需要从同源缀合物或单特异性抗体中深层纯化出异源缀合物及通常产率低。

遗传工程已越来越多用于设计、修饰及生产具有期望的结合性质组和效应功能的抗体或抗体衍生物。已开发出多种用于有效生产BsAb的重组方法，其作为抗体片段(Carter等(1995),J.Hematotherapy 4:463-470；Pluckthun等(1997)Immunotechology 3:83-105；Todorovska等(2001)J.Immunol.Methods 248:47-66)和全长的IgG形式二者(Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15)。

Abbott在美国专利US7612181中描述了一种鼠双可变域IgG(DVD-IgG)双特异性抗体，其基于Unilever专利(US5989830)中所述的双Fv形式。人源化双特异性形式描述于WO2009/052081(TBTI)中，其通过提述以其整体并入本文。将恒定域添加至双Fv的各条链(CH1-Fc添加至重链，而κ或λ恒定域添加至轻链)产生了功能性双特异性双-V-区抗体样结合蛋白。

具有与IL-4和IL-13特异性结合的四个结合位点的双特异性双可变区(双-V-区)抗体样结合蛋白已报道于国际申请No.PCT/US2008/079787(WO 2009/052081)和PCT/US2012/029147(WO 2012/125775)中，二者均通过提述以其整体并入本文。

本发明的一个实施方案是双特异性抗体，其经工程化而包含与同一抗原或2个不同抗原上的2个不同表位特异性结合的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。本发明的一个实施方案是与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段，其中该双特异性抗体或其双特异性抗体片段包含轻链可变域和重链可变域，其中该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。本发明的另一实施方案是与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段，其中该双特异性抗体或其双特异性抗体片段包含轻链可变域和重链可变域，其中该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:5。本发明另一实施方案是与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段，其中该双特异性抗体或其双特异性抗体片段包含轻链可变域和重链可变域，其中该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。本发明的一个实施方案是与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段，其中该双特异性抗体或其双特异性抗体片段包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含氨基酸序列SEQID NO:1和SEQ ID NO:3，且所述重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。本发明的另一实施方案是与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段，其中该双特异性抗体或其双特异性抗体片段包含轻链可变域和重链可变域，所述轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，所述重链可变域包含氨基酸序列SEQID NO:2和SEQ ID NO:4，其中一个肽接头连接SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3，以及一个肽接头连接SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4。

本发明的一个实施方案是包含与IL-13和IL-4特异性结合的双特异性抗体或其双特异性抗体片段的huTBTI3_2_1或SAR156597，其包含(a)包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变域；(b)包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4氨基酸序列的重链可变域；(c)连接SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3的肽接头，及连接SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4的肽接头，其中所述肽接头具有由SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列；及(d)恒定区域。

如本发明中所用的术语“多特异性的”是指本发明的多价抗体识别同一抗原或多个不同抗原上的多数个不同表位。

如本发明中所用的术语“接头”是指适于连接本发明抗体构建体的可变域的肽。肽接头可含有任何氨基酸，氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)是优选的。在重链多肽和轻链多肽之间和之内的接头彼此可相同或不同。此外，接头可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。如用于轻链域、用于重链域的优选的肽接头单位是GGGGS。重链和轻链的接头单位的数目可为彼此相同(对称的顺序)或不同(不对称顺序)。

肽接头优选地具足够的长度以提供适当的柔性使抗体基团免于(例如通过位阻)干扰彼此活性，以允许适当的蛋白折叠，且若需要的话，允许抗体分子与一个或多个(可能间隔较宽的)在相同细胞上的受体相互作用：其还优选地足够短以使抗体模块在细胞中保持稳定。

因此，肽接头的长度、组成和/或构象可由本领域技术人员容易地选择，从而优化多价抗体的期望的特性。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的F_v、F_ab、F_ab'、F_(ab')2或其他靶标结合子序列)，相比于人抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的序列。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的一个，及通常为二个可变域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的FR区对应于人免疫球蛋白模板序列的FR区。人源化抗体还可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(F_c)，通常是所选的人免疫球蛋白模板的恒定域。一般而言，目的在于获得在人中具有最低免疫原性的抗体分子。因此，可能能够将一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸变成对人宿主较低免疫原性的氨基酸，而基本不将所述一个或多个CDR对IL-4和/或IL-13的特异性结合功能减至最小。或者，FR可为非人的，但那些最具免疫原性的氨基酸被较低免疫原性的氨基酸置换。然而如上文所论述的，CDR移接并非得到人源化抗体的唯一方法。例如，只修饰CDR区可能是不够的，因为其对于框架残基参与决定CDR环的三维结构和抗体对其配体的整体亲和力不是罕见的。因此，可采用任何方法来将非人亲本抗体分子修饰为对人免疫原性较低，而与人抗体的全局序列同一性并不总是必需的。所以，人源化也可例如仅通过一些残基的取代来实现，尤其是暴露在抗体分子上而非隐藏在分子内而因此不易影响宿主免疫***的那些残基。本文教导了关于在抗体分子上取代“可变动的”或“弹性的”残基的此种方法，其目标在于降低或抑制所得分子的免疫原性，而不包括抗体对其表位或决定簇的特异性。参见例如Studnicka等,Prot Eng 7(6)805-814,1994；Mol Imm 44:1986-1988,2007；Sims等,J Immunol 151:2296(1993)；Chothia等,J Mol Biol 196:901(1987)；Carter等,Proc Natl Acad Sci USA89:4285(1992)；Presta等,J Immunol 151:2623(1993),WO2006/042333以及美国专利No.5,869,619。

如文中所教导的“抗体同源物”或“同源物”是指特异性地结合IL-4和/或IL-13的任何分子。因此，抗体同源物包括天然和重组的抗体，无论是其否经修饰，保留有期望的生物特性(如结合IL-4或IL-13)的抗体部分，如F_ab或F_v分子、单链抗体、带有一个或多个CDR区的多肽等。同源物的氨基酸序列不一定必须与天然存在的抗体序列相同，而是可经改变或修饰而带有取代氨基酸、***氨基酸、删除氨基酸、除一般见于蛋白中的二十个氨基酸以外的氨基酸等等，以得到具有增强的或其他有益特性的多肽。

具有同源序列的抗体是含有与本发明的IL-4、IL-13或双特异性IL-4/IL-13抗体的氨基酸序列具有序列同源性的氨基酸序列的抗体。优选地，同源性是与本发明抗体的可变域的氨基酸序列。如用于本文的氨基酸序列“序列同源性”定义为与另外的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，如例如根据Pearson&Lipman,Proc Natl Acad Sci USA 85,2444-2448(1988)以FASTA检索方法所确定的。

嵌合抗体是具有衍生自不同来源的不同抗体部分的抗体，所述不同来源例如不同的抗体、不同的抗体种类、不同动物物种，例如具有来源于自鼠单克隆抗体的可变区与人免疫球蛋白恒定区配对的抗体等。因此，人源化抗体是一种嵌合抗体。制造嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见例如Morrison,1985,Science 229:1202；Oi等,1986,BioTechniques4:214；Gillies等,1989,J Immunol Methods 125:191 202；和美国专利No.5,807,715，4,816,567，和4,816,397。

人工抗体包括scFv片段、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体和分子识别单元(mrus)(参见Winter&Milstein,1991,Nature 349:293-299；和Hudson,1999,Curr OpinImm 11:548-557的综述)，其各自具有抗原结合或表位结合能力。在单链F_v片段(scF_v)中，抗体的V_H和V_L域通过柔性肽连接。通常，接头是约15个氨基酸的肽。若接头小很多，例如5个氨基酸，则形成双抗体。最小的抗体结合单元是CDR，典通常是具有足够特异性识别和结合能力的重链的CDR2。此片段称为分子识别单元或mru。数个此类mru可用短的接头肽连接在一起，从而形成具有比单一mru更高的亲合性的人工结合蛋白。

期望的抗体的功能性等同物也涵盖在本发明范围内。术语“功能性等同物”包括具有同源序列的抗体、抗体同源物、嵌合抗体、人工抗体和修饰抗体，例如，其中各个功能同等物通过结合IL-4和/或IL-13的能力，抑制IL-4和/或IL-13信号传输能力或功能，或抑制IL-4和/或IL-13与其受体结合来定义。技术人员会了解，称为“抗体片段”的分子组和称为“功能性等同物”的组有重叠。生产保留有IL-4和/或IL-13结合能力的功能性等同物的方法是本领域技术人员已知的并公开于例如WO 93/21319、EPO序列号239,400、WO 89/09622、EPO序列号338,745和EPO序列号332,424中。

本申请的功能性等同物还包括修饰抗体，例如通过将任何类型的分子共价连结至抗体而修饰的抗体。例如，修饰抗体包括通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、去酰胺化、磷酸化、酰胺化、以已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体、连接至毒素或细胞毒性模块或其他蛋白等加以修饰。共价连结不需要生成这样的抗体，所述抗体对于产生抗-个体基因型(idiotypic)响应是免疫的。修饰可通过已知的技术来实现，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、代谢合成等。另外，修饰的抗体可含有一个或多个非经典氨基酸。

用于治疗目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农用动物、非人灵长类及动物园、运动用或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。

本发明中所用的术语“治疗(treatment)”是指作为疗程的治疗性处理及防止性或预防性措施。其是指预防、治愈、逆转、减轻、缓解、最小化、抑制或停止疾病状态、疾病进展、疾病病原物(例如细菌或病毒)或其他异常病况的有害作用。

“分离的”或“纯化的”抗体是基本没有来自衍生此蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白的，或当由化学合成时，其基本没有化学前体或其他化学物质。“基本无细胞物质”一词包括抗体的制备物，其中该抗体从其分离或重组产生的细胞的细胞组分所分离。因此，基本无细胞物质的抗体包括具有低于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重计)的污染蛋白的抗体的制备物。当此抗体系重组产生时，其也优选基本上无培养基，即培养基含低于约20％、10％、5％、2.5％或1％的蛋白制备物体积。当抗体由化学合成产生时，其优选地基本无化学前体或其他化学物和试剂，即目的抗体与涉及此蛋白合成的化学前体或其他化学物是分开的。因此，此类抗体制备物除目的抗体之外具有低于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或化合物。在本发明优选的实施方案中，抗体是分离或纯化的。

如本文所用的，术语“治疗剂”是指可用于治疗、管理或改善与异常的IL-4和/或IL-13代谢和活性有关的疾病、病症、重疾等的任何药剂。

如本文所用的，“剂量”是指可用于治疗、管理或改善与异常的IL-4和/或IL-13代谢和活性有关的疾病、病症、重疾等的任何药剂的量。

如本文所用的，“安全剂量”是指在维持临床上可接受利益/风险概貌情况下，可用于治疗、管理或改善与异常的IL-4和/或IL-13代谢和活性有关的疾病、病症、重疾等的任何药剂或任何药剂的剂量。本文所公开的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段的安全剂量选自下组：10mg、20mg、40mg、50mg、80mg、100mg、150mg、200mg和300mg。安全剂量的一个实施方案是约10mg至约300mg。安全剂量的另一实施方案是200mg，约200mg，多至200mg或不大于约200mg的任何剂量。在其他实施方案中，安全剂量是约50mg，或约100mg，或约200mg。在一些实施方案中安全剂量每周施用一次。在一些实施方案中，安全剂量以皮下施用(SC)。

在IL-4和IL-13与其细胞表面受体连接后，胞内的信号传输部分通过信号传输分子信号转导和转录激活因子6(Stat6)的磷酸化所介导。

趋化因子(C-C基序)配体17(CCL17)是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL17也称为胸腺和活化调节趋化因子(TARC)。TARC由IL-4和/或IL-13经由Stat6磷酸化诱导(Wirnsberger等,(2006)Eur J Immunol.36:1882-91；Liddiard等,(2006)BMC MolBiol.29:7:45；Monick等,(2007)J Immunol.179:1648-58)。因此，通过例如IL-4/IL-13结合抗体样蛋白抑制IL-4和/或IL-13-介导的信号传输，与抑制TARC诱导是相互关联的。在一些实施方案中，本文所述的方法包括检测已施用于受试者的抗体或抗体样结合蛋白或其片段与IL-4和/或IL-13的结合的方法，该方法包括(a)将抗体或抗体样结合蛋白或其片段施用于受试者；及(b)确定抽取自受试者的血液、血清或血浆样品中的CCL17/TARC的量，其中相对于在施用抗体或抗体样结合蛋白或其片段之前由受试者抽出的样品，该样品中CCL17/TARC的量的下降表示抗体或抗体样结合蛋白或其片段与IL-4和/或IL-13结合。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，抗体或抗体样结合蛋白或其片段是双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，双-V-区抗体样结合蛋白或其片段对于IL-4或IL-13是特异的，或对于IL-4和IL-13是双特异的。在一些实施方案中，若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17下降低于阈值(即若TARC/CCL17水平下降不足)，则步骤(c)进一步包括增加剂量，或若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17下降高于阈值(即若TARC/CCL17下降过多)，则降低剂量。在一些实施方案中，相比于施用该剂前在受试者中测量的TARC/CCL17的量，步骤(c)中的阈值是TARC/CCL17的量约10％的下降，或约15％的下降，或约20％的下降，或约25％的下降，或约30％的下降，或约35％的下降，或约40％的下降，或约45％的下降，或约50％的下降，或约55％的下降，或约60％的下降，或约65％的下降。在一些实施方案中，相比于施用该剂前在受试者中测量的TARC/CCL17的量，阈值为TARC/CCL17的量约20％至约60％的下降，或约40％至约50％的下降。在一些实施方案中，相比于施用该剂前在受试者中测量的TARC/CCL17的量，阈值为TARC/CCL17的量约43％的下降。例如，对于200mg剂量的43％下降表示200mg剂量的双特具性抗IL-4/IL-13双-V-区抗体样结合蛋白与IL-4/IL-13的结合。

术语“约”在与数值联用时，意在涵盖在具有比所指数值低5％、10％或15％的下限且具有比所指数值大5％、10％、15％的上限的范围内的数值。

实施例

下列实施例是本发明具体实施方案及其各种用途的说明。其列出仅供说明描述的目的，而不视作限制本发明。

术语“huTBTI3_2_1”和“SAR156597”可互换使用并意指相同的双-V-区抗体样蛋白，其包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，所述可变重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

实施例1：临床研究形式

进行了一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的临床研究以评估在3个连续、剂量递增的特发性肺纤维化(IPF)受试者群体中，在6周期间每周一次皮下(SC)施用重复剂量的SAR156597的安全性和耐受性。IPF是一种原因不明的进行性、弥漫性且独特的慢性纤维化间质性肺炎，其是致命性的，中位存活期约为2至3年。

在各剂量群体中，8位患者(6位接受SAR156597而2位接受安慰剂)接受了重复的SC、每周一次的SAR156597或相匹配的安慰剂对照物的剂量。第2群体在以DMC检查第一群体的安全性之后开始。200mg的剂量的第3群体在检查2个在前群体的安全性之后开始。

对于各患者的研究期为22周，如下：4周的筛选；6周的治疗期(7次施用)；12周的随访。

若在第12周，存在与免疫原性相关的抗药物抗体(ADA)，则在第1次给药后最少6个月进行额外的追踪随访，以检验升高的参数。临床试验的结束定义为最后一位患者完成其本方案中计划的最后一次随访。

研究群体的选择。根据如下标准将患者纳入本研究。

纳入标准

-成人(年龄>18岁)男性或女性患者。

-根据目前美国胸腔学会(AMERICAN THORACIC SOCIETY,ATS)/欧洲呼吸学会(THEEUROPEAN RESPIRATORY SOCIETY,ERS)/日本呼吸学会(THE JAPANESE RESPIRATORYSOCIETY,JRS)/拉丁美洲胸腔协会(THE LATIN AMERICAN THORACIC ASSOCIATION,ALAT)指南而记录的IPF诊断，即排除其他已知原因的间质性肺疾病(例如家庭或职业环境暴露、***疾病和药物毒性)；以及或是(1)在未进行外科肺活检的患者的高分辨率计算机断层扫描(HRCT)中存在常见间质性肺炎模式；或是(2)进行外科肺活检的患者中HRCT和外科活检模式的特定组合。

-在与研究相关的任何步骤之前，得到书面的、签署的且注明日期的知情同意书。

排除标准

-用力肺活量<预测值的50％。

-一氧化碳扩散量肺活量(根据血红素校准)<35％预测值。

-在休息(坐姿10分钟)呼吸周围空气时通过脉搏血氧定量法测得氧饱和度<90％。

-IPF之外显著的呼吸病症的已知诊断(例如过度反应性气道疾病、肺结核、类肉瘤病、曲霉病、肺气肿或慢性阻塞性肺疾病[COPD]、或囊肿性纤维化)。

-活动性血管病变或使用血管活性药物(例如磷酸二酯酶4抑制剂、钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂、他克莫司(tacrolimus)、环孢霉素(cyclosporine)。

-已知的HIV或慢性病毒性肝炎。

-患者患有活动性肺结核或潜伏性结核感染(有关肺结核的排除：活动性肺结核或治疗不完全的肺结核病史；筛选时阳性的QuantiFERON-TB测试(无论先前的治疗状态如何)；基于至少前-后视图的胸腔射线片，符合之前/活动性肺结核感染的临床上显著异常(射线片必须在筛选拜访前12周内或筛选期间拍摄)。还推荐额外的侧视图，但并非必需。在先前的肿瘤坏死因子-α(TNF-a)-拮抗剂或其他非抗TNF-αbioDMARD治疗期间重新激活的潜伏性肺结核感染的患者，无论是否有后续适当的抗肺结核治疗。疑似肺外结核病感染；处于接触肺结核的高风险的患者，如与患有活动性或潜伏性肺结核的个体密切接触)。

-临床上明显、严重或不稳定、急性或慢性进行性医学(IPF以外)或外科病症，或在研究者的判断下任何可能影响患者安全性的病况的证据。

-筛选时，临床上明显的心电图(ECG)异常(包括QTc≥500ms)。

-筛选时临床上显著的实验室测试：丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)>正常范围的上限(ULN)的2倍；血红素，男性<12g/100mL，及女性<11g/100mL；嗜中性粒细胞<1500/mm³(但对于非洲裔为<1000/mm³)；血小板<150 000/mm³；肌酸酐>150μmol/L。

-物质和/或酒精滥用的当前历史。

-哺乳或怀孕的妇女。

-可能怀孕的妇女(停经少于2年或未手术结扎)，在筛选时具有阳性的尿液β-人绒毛膜***(β-HGC)怀孕测验及未使用可接受的避孕法(例如避孕药、子宫内装置、植入物、注射Depo-Provera^TM、双屏障法(double-barrier method)、禁欲、配偶结扎——除非其不被当地卫生主管单位所接受)。

-在筛选前4周内使用任何以治疗IPF为目的注册疗法。

-在筛选前4周内使用任何的细胞毒性/免疫抑制剂，包括但不限于咪唑硫嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、甲氨蝶呤及环孢霉素。

-在筛选12周或5个半衰期内(就利妥昔单抗而言为24周而阿法西普(alefacept)为24个月)使用任何细胞因子调节剂(依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、利妥昔单抗(rituximab))。

-1个月的筛选内，或5个半衰期(若知道的话)(二者中较长的那个)内使用任何研究性药物。

以冻干形式作为SAR156597提供研究性医药产品(IMP)用于制备SC剂量溶液。各小瓶含有185mg的SAR156597及赋形剂，储存在2℃-8℃(36°F-46°F)。在给药的早上以1.7mL无菌、无热原蒸馏水在室温重构IMP(SC注射前不超过1小时)。重构后用于注射的溶液中的成分的浓度为：100mg/mL的SAR156597溶于6.3mmol/L磷酸二氢钠中、3.7mmol/L氨基丁三醇、5％(重量/体积)蔗糖、3％(w/V)脯氨酸及0.2％(w/V)聚山梨醇酯80，最终pH为7.0。

对于安慰剂，提供的各个小瓶含有2mL含有与用于重建的SAR156597配置物相同浓度的相同赋形剂的液体。

使用1-mL注射器递送1.0mL或更少的体积；使用累进递送2至3mL的注射器来递送多于1mL的量。各种计划的剂量水平所需的体积的汇总如表1中所示。

表1-计划的SAR156597皮下施用

IMP(SAR156597或安慰剂)以脐周SC注射来施用。在重构的1小时内，将剂量施用在腰线以上左侧或右侧象限距离肚脐4至10cm的区域中。

研究中的剂量选择

SAR156597是结合并中和IL-4和IL-13二者的工程化、人源化的双特异性免疫球蛋白G(IgG)-4抗体。SAR156597对来自人和食蟹猴二者的IL-4和IL-13都显示出高亲和性。

对于每个患者，将每周一次的SC剂量施用6周(总计7次施用)，并且群体1至3中的剂量递增按如下进行：群体1为50mg(0.5mL)的SAR156597，群体2组为100mg(1mL)的SAR156597，群体3为200mg(2.0mL)的SAR156597，全部伴有相匹配的安慰剂。

实施例2：药效学(PD)评估

评估重复渐增剂量的SAR156597对肺功能测试(PFT)、呼吸症状及选择的生物标志物的效应。更具体而言，评估下列PD变量：

1.肺功能测试(PFT)：对于血红素校准的一氧化碳扩散量(DLCO)；用力(呼气)肺活量(FVC)；1秒用力呼气量(FEV1)：总肺容量(身体体积描记法)(TIC)；余气量(身体体积描记法)(RV)。在给药前3周内进行2次PFT。进行第一次PFT以筛选患者并将来自第二次PFT(随机拜访时)的数据与第一次的数据取平均值，从而确立基线值；这些测试在不同天进行。在第8次拜访(第6周)/治疗结束(EOT)和第14次拜访(研究治疗的最后一剂后第18/12周)还进行PFT。

2.在筛选、基线、第6周/EOT及第18周(研究治疗的最后一剂后12周)时使用SpO2评估氧饱和度。在筛选时进行第一次SpO2测量并将第二次的数据与第一次的数据取平均值，从而确立基线值；这些测试在不同天进行。

3.在基线、第6周/EOT及第18周(研究治疗的最后一剂后12周)时使用St.George's呼吸问卷(SGRQ)评估IPF对生活质量(QoL)的影响。

4.在筛选、基线、第6周/EOT及随访期结束(第18周)时从全血中评估所选的生物标志物。在筛选、基线(第一次给药前)、第6周/EOT及随访期结束(第18周)时收集血清和血浆样品。样品制备和分析的方法如下：对于各血清样品，将3mL的血液收集至无促凝剂的干燥试管中。于室温l小时后将试管在+4℃于3000g离心15分钟并将血清分成等份并储存于-70℃直至使用。对于各血浆样品，将4.5mL的血液收集于柠檬酸钠试管中并立即轻柔地倒转试管10次进行混合。将试管以2000g离心15分钟并将血浆分成等份并储存于-70℃直至使用。使用来自R&D Systems的人CCL17/TARC Quantikine ELISA试剂盒，依照试剂盒手册的说明书对TARC进行定量。对于此测定法，定量下限为31.2pg/mL，而定量上限为2000pg/mL。制备了一些存档的样品并储存以供未来用于获得关于生物标志物的更多知识，其通过使用可在本研究完成后出现的分析来进行。蛋白生物标志物包括趋化因子[C-C基序]配体18[CCL-18]、Krebs von den Lundgen-6[KL-6]、表面活性蛋白A[SP-A]、表面活性蛋白D[SP-D]、哺乳动物几丁质酶样蛋白[YKL-40]、IL-4、IL-13、IL-8、免疫球蛋白E[IgE]、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、胞间黏附分子1[ICAM1]、骨膜蛋白(periostin)、胸腺和活化调节趋化因子[TARC]CCL-17、基质金属蛋白酶-7[MMP7])、及RNA(mRNA，微小RNA)表达。

药效学结果

PD终点：分析了5项PFT(FVC、FEV1、TLC、DLCO和RV)自基线的变化。在治疗结束时(EOT，第8次拜访，第6周)，患者的肺功能整体并未改变，如主要参数与基线相比的平均变化所证明的(预测的FVC百分比和预测的DLCO百分比)，其在治疗组间是相当的。EOT后12周，预测的FVC百分比和预测的DLCO百分比自基线的均值变化显示，所有的治疗组中的肺功能保持不变。

次要PD终点：在6周的治疗结束及治疗后的随访期，测量次要PD变量(SpO2、蛋白/RNA生物标志物及SGRQ)。由于研究样本小及研究期短，这些PD结果并非结论性的。

随着SAR156597的剂量增加，TARC(CCL-17)在血液中有降低表达的趋势(图2)。在EOT后，TARC表达持续下降(图3)。

实施例3：安全性数据的分析

安全性评估基于检查个体数值(临床上显著异常)、描述性统计(总表，图)。所有的安全性分析使用安全性人群来进行。

对于所有的安全性数据，将观察期分成3个阶段：

-治疗前阶段，定义为介于患者交付知情同意书和第一剂的IMP施用之间的时间。

-治疗进行阶段，定义为从第一剂的IMP施用至第18周拜访(含本数)的时间。

-治疗后阶段，定义为第18周拜访(不含本数)之后的时间。

不良事件根据Medical Dictionary for Regulatory Activities(MedDRA)使用第16.1版来进行编码。

对于临床实验室，使用表2所示的PCSA列表来分析生命体征和ECG参数，以及潜在临床上显著的异常(PCSA)。

表2.潜在临床上显著的异常(PCSA)的标准

不良事件

不良事件(AE)根据时间顺序标准分类为预先定义的标准类别：

治疗前不良事件：在治疗前期间发生或恶化的AE；

治疗-突发不良事件(TEAE)：在治疗进行期间发生或恶化的AE；

治疗后不良事件：在治疗后阶段期间发生或恶化的AE。

将TEAE分配至在AE发生时接受的IMP。

具有至少1件TEAE、严重TEAE、危急TEAE、致死TEAE及导致永久性治疗中断的TEAE，通过治疗组进行汇总。

汇总所有的TEAE经并以主要***器官分类(SOC)及优选术语(PT)列出。此外，列出所有的AE，并根据患者和发生日期和时间排序。

临床实验室评估

生物化学及血液学

本研究的基线值是在第1天给药前评估所收集的值。

对于试验室范围和/或异常性标准的参数(PCSA)，使用在治疗进行阶段所作的所有基线后评估(包括再核对值)来进行“治疗中”分析。

血管炎、血清学和尿分析的补充测试

所有的个体数据通过以治疗组、患者和拜访列出。

体重和体质指数：分析体重作为原始参数值和与基线相比的百分比变化。分析个别的身体重量指数作为原始数值。基线值是在第1天收集的给药前数值。对于所有的参数，使用在治疗中期间所收集的基线后值，包括全部再核实的值，进行“治疗中”分析。

生命体征：

心律和血压

分析心率和血压(收缩压和舒张压)作为原始参数值(仰卧和站姿)、与基线相比之变化(仅仰卧)及直立参数(站立-仰卧参数值)。基线值为在第1天收集的给药前数值。就所有的参数，系使用在治疗中期间所收集的基线后值，包括全部非预定和再核实的值，进行“治疗中”分析。

体温：分析体温作为原始参数值、与基线相比的变化。基线值为在第1天收集的给药前数值。

心电图：分析心率、PR-、QRS-、QT-及校准的QT-间隔(QTc)作为原始参数值和与基线相比的变化。基线值为在第1天收集的给药前数值。就所有的参数，系使用在治疗中期间所收集的基线后值，包括全部再核实的值，进行“治疗中”分析。

其他安全性相关参数(IMP注射位置的局部耐受性)：红斑大小和水肿大小以描述性统计通过参数、治疗组和时间点来汇总。整个研究期间，现时疼痛强度、红斑、水肿、痒、丘疹、囊泡化和脓泡级别的最极端定性评估的患者数目(％)按照治疗组进行汇总。

暴露程度

在各治疗组中大部分的患者接受7个IMP注射。各SAR156597剂量组中有一位患者未接受全部7个剂量的研究药物。在各SAR156597 50mg和200mg剂量组中有一位患者具有与增加的hsCRP评估有关的剂量中断及SAR156597100mg剂量组中有1位患者由于肺结核SAE而中断研究治疗。

不良事件

整体而言，治疗突发不良事件(TEAE)在整体治疗组中是均衡的。大多数的TEAE是轻度或中度且仅报告3件严重事件：在安慰剂组中有1个耳感染事件，在SAR156597 50mg剂量组中有1个股骨骨折事件，在SAR156597 200mg剂量组中有1个IPF事件。三位患者经历至少1件严重不良事件(SAE)：各SAR156597治疗组1位患者(表3)。

表3：不良事件概貌总览；治疗-紧急不良事件-安全性人群

TEAE：治疗紧急不良事件，SAE：危急不良事件

N＝各治疗组内的患者数目，n(％)＝具有至少一件各个范畴的TEAE的患者的数目和百分比

注：如果不良事件从第一次研究的医药产品(IMP)施用之时开始直至第18周的随访(含本次)，则将其视为治疗紧急事件。

最常报告的AE是感染，其频率在各治疗组间是相当的(在各安慰剂组、SAR15659750mg和SAR156597 100mg剂量组的6位患者中有3位；SAR156597 200mg剂量组的6位患者中有2位)(表4)。四件意外摔倒报告为TEAE。在SAR156597 50mg剂量组中一件报告为严重的摔倒事件后来造成股骨骨折的SAE，而在SAR156597 200mg剂量组中报告的其他3件是轻度的。

表4：通过主要SOC和PT的具有至少1件TEAE的患者的数目(％)-安全性人群

TEAE：治疗紧急不良事件，SOC：***器官类别，PT：优选术语

MedDRA 16.1

N＝各组内治疗的患者数目，n(％)＝具有至少一件各个范畴的TEAE的患者的数目和百分比

注：表格通过SOC来分栏，其根据国际公认的SOC规则和SAR156597 200mg组中降低的PT频率来进行。

三位患者历经至少1件SAE(在SAR156597治疗组中各1件)：SAR156597 50mg剂量组中有1位摔倒及股骨骨折的SAE患者，SAR156597 100mg剂量组中有1位结核病的SAE患者，及SAR156597 200mg剂量组中有1位细菌性肺炎及IPF恶化的SAE患者。SAR156597 100mg剂量组有1位患者由于结核病的治疗突发SAE而中断研究治疗。

特殊不良事件(AESI)：疑似血管炎是本研究的一种AESI，无论基于>10mg/L及>2X的基线值的hsCRP持续升高(至少持续72小时)，或其他临床发现。在本研究中报告了3件C-反应性蛋白增加的案例。这些升高的hsCRP的案例报告为有潜在血管炎的起初嫌疑，但皆未证实为血管炎且大多数的这些hsCRP增加在同样发生感染的时间框架中(1件由hsCRP触发的AESI与附睾感染有关，1件与细菌性肺炎有关及1件与感染性结膜炎有关)或研究人员并不认为是临床上显著的。

在SAR156597 200mg剂量组中，1患者最初报告具有裂纹状出血，研究人员怀疑可能与血管炎有关。在进一步分析后，此事件后续经诊断为甲营养不良并最终忽略了血管炎嫌疑。

血液学参数：并未检测到明显的血液学参数变化，除了在SAR156597治疗组中有一些患者，相比于安慰剂组，具有大于0.1Giga/L嗜碱性粒细胞计数。

生物化学参数：在3组SAR156597治疗组中各有1位患者在研究期间具有暂时hsCRP升高。

生命体征：相比于安慰剂组，在SAR156597治疗组中具有较高的直立SBP和直立DBP患者数。

心电图：相比于安慰剂组，在治疗组中具有较高的QTcB延长的患者数。有4位患者(SAR156597 50mg组1位患者，SAR156597 100mg组2位患者，而SAR156597 200mg组1位患者)在研究期间具有QTcB延长。

注射部位耐受性：有极少局部注射部位反应报告且大多数的事件是轻度的。

个体临床上相关异常：无任何符合PCSA的生命体征与任何临床上有关表现相关联，包括4件直立SBP病例和5件直立DBP病例，其全部具有其他可识别、潜在的成因。无任何符合PCSA标准的ECG与任何需要矫正性治疗的临床上有关表现相关联。

安全性结论

除了在SAR156597 100mg SC每周给药组中1位患者在施用3剂的研究药物后由于结核病的SAE而必须中断研究治疗之外，全部的患者均完成6周治疗期。

具有至少1件TEAE的患者数在各组间是相当的(安慰剂和200mg组6位患者中有5位，50mg和100mg组6位患者中有6位)，大多数的TEAE是轻度至中度的。最常见报告的TEAE是感染，其在治疗间是均衡的(安慰剂、50mg和200mg组6位患者中有3位，100mg组6位患者中有2位)。

有3位患者报告严重不良事件(SAE)，3个SAR156597剂量组每组各1位(50mg剂量组中有1位摔倒及股骨骨折的SAE患者，100mg剂量组中有1位结核病的SAE患者，及200mg剂量组中有1位细菌性肺炎的SAE患者)。

在研究期的任何时间均无死亡报告。

无任何来自生化实验室结果、生命体征和ECG的PCSA与临床表现有关。所有具有短暂hsCRP升高的患者与临床事件，例如感染有关，或由研究人员判断并非临床上相关的。在本研究中没有确认的血管炎病例。

总体而言，以3种不同的剂量(50、100和200mg SC)每周SC施用SAR156597共计6周，一般是安全的及完全耐受的。

实例4：药代动力学(PK)评估

于第2至8次拜访期间，在给药前收集PK分析的样本(在每次给药前2小时内)。于早晨收集在第9次/提前终止(ET)、11和14次拜访期间的药物动力学样本。在第2、9/ET、11和14次拜访时，与PK样本大约相同的时间收集抗-SAR156597抗体(ADA)样本。若在第12周，与免疫原性有关的ADA存在，则在第一次给药后至少6个月进行另一追踪随访，以检验升高的参数。

使用具有0.05μg/mL定量下限(LLOQ)的验证的酶联免疫吸附测定(ELISA)法(DOH0850)，在Bertin Pharma(L.E.M.M.[Laboratoire d'Etude du Métabolisme des Médicaments],DSV/iBiTec-S/SPI,CEA-Saclay,Gif sur Yvette Cedex,France)负责下确定SAR156597血浆浓度。所有来自生物分析研究的原始数据根据测试部位所用的程序，储存在Bertin Pharma。

使用验证的ELISA法(DOH0851)，在Disposition,Safety&Animal ResearchOperational Center of Montpellier(Biomarker和Biological Assays组),Sanofi的负责下，分析血浆的ADA。将所有的样本先使用筛选分析进行评估。然后以确认分析检测筛选分析中阳性的样本。仅就确认为阳性的样本报告滴度报告。所有来自生物分析研究的原始数据根据测试部位所用的程序，储存在sanofi-aventis,Montpellier,France。

使用群体PK(Bayesian)法估算药代动力学参数并如表5中所示。

表5：血浆SAR156597的药代动力学参数列表及定义

以于多处理器计算机的LINUX簇上运行的计算机程序(7.1.2版)，进行贝叶斯分析(Bayesian analysis)。

使用3个群体的数据(剂量50、100和200mg)建构贝叶斯数据组。使用NONMEM软件(7.1.2版)分析此数据。将得自POH0338研究(使用来自早期研究的PK数据所建构)的最终的群体PK模型应用于贝叶斯数据组，其中其参数估算如先前对个体参数评估和浓度预测的估算。忽略估算步骤，使用MAXEVAL＝0的选择，以最终群体PK模型中所得到的θ(模型的固定效应，即PK参数)、ω(个体间变异性)及σ(个体内变异性)的最终群体估算为基础，计算个体估算值。

药代动力学数据分析

所有的PK分析使用群体PK法来进行。于此研究中测定下列PK参数：实测的SAR156597血浆波谷浓度(C_波谷)；

在第一次和最后一次给药之后，个体预测的C_max，及预测的AUC_0-168h；

最后一次给药之后，个体预测的t_1/2z。

统计分析

于Disposition,Safety&Animal Research,Sanofi负责下，各治疗组分析的SAR156597C_波谷浓度和预测的C_max、AUC_0-168h及t_1/2z以描述性统计汇总(算术和几何平均、中值、SD、变异系数[CV％]、最小、最大、中值及可获得观测的数目)。在Biostatistics,Sanofi负责下，进行其他的统计分析，例如稳态评估、对t_1/2z的剂量效应及剂量比例性。

在所有的统计分析之前，将C_max、AUC_0-168h及t_1/2z进行对数转换。

通过使用SAS NLMIXED程序以非线性混合效应模型拟合C波谷值来评估稳态的发生。

以线性固定效应模型评估t_1/2z的剂量效应。

使用幂模型(power model)评估C_max和AUC_0-168h的剂量比例性。

药代动力学数据处理及数据质量保证：对于SAR156597，在计算平均值时将低于0.05μg/mL的LLOQ的血浆药物浓度作为0处理。从未舍入的数字产生平均及其相关的统计且可能与使用舍入的整数所测定的值有稍微不同。一但进行最终PK分析，将PK参数电子化转移到生物统计部分进行进一步统计分析。浓度和PK参数值取3位有效数字。

药代动力学评估

血浆浓度：全部18位随机化患者都暴露于SAR156597。在6位安慰剂患者血浆中未检测到SAR156597。由于接受的剂量不足，将1位100mg的患者从PK分析排除。SAR156597波谷浓度图形如图4所示。

对于一周给予一次100mg和200mg剂量的SAR156597，达到90％稳态的中值时间是约第34天。对于一周给予一次50mg剂量的SAR156597，统计分析提供了意外的达到稳态中值时间约101天。在50mg剂量组中，上述达到稳态时间可能不可靠，因为血浆波谷浓度低。因此，非线性混合效应模型似乎无法适当评估50mg剂量组之起初的斜率参数，导致高估了此剂量达到稳态的时间。

此外，贝叶斯PK分析预测，在第6周SAR156597第7次给药后，50mg剂量组达到89％，100mg剂量达到94.8％，200mg剂量组达到93.7％AUC_0-168ss的稳态。

药代动力学参数：在第1周单一SC施用SAR156597后所得到的SAR156597的PK参数的描述性统计汇总于表6中。

表6：单一给药(第一剂)后的SAR156597血浆PK参数

a中值(min-max)

在第6周每周重复SC施用SAR156597后所得到的SAR156597的PK参数的描述性统计汇总于表7中。

表7：7次每周给药后(第6周)的SAR156597血浆PK参数

a中值(min-max)

具有90％CI的SAR156597t_1/2z估算如表8所示。t_1/2z范围是260小时(大约11天)至348小时(大约15天)，对t_1/2z具有预料不到的显著的剂量效应(p＝0.049)。

表8：具有90％置信区间的t1/2z点估算值

在第1周及第6周进行剂量比例性评估且分别如表9和10所示。

表9：在第1周r-倍数增加的具有90％置信区间的点估算值

C_max＝0.02x剂量^1.28

AUC_0-168＝2.86x剂量^1.27

表10：在第6周r-倍数增加的具有90％置信区间的点估算值

C_max＝0.09x剂量^1.19

AUC_0-168＝14.95x剂量^1.18

在第1周和第6周，SAR156597暴露增加稍高于剂量比例。SAR156597剂量增加4倍显示C_max增加5.21至5.92倍及AUC_0-168增加5.17至5.83倍。

免疫原性：血浆的ADA测定。ADA结果的汇总描述于表11中。

表11：ADA结果汇总

二位患者具有ADA阳性样品。1位SAR156597 200mg治疗组的患者(患者编号152003002)在第1天治疗前样品中表现出ADA反应性，但直到第18周在所有的样品ADA反应性均为阴性。第二位是安慰剂治疗的患者(患者编号484002003)且在第12周和第18周ADA为阳性。因此认为ADA不影响SAR156597PK参数估算。

1位(患者编号124003001)200mg治疗组的患者，由于未取得样品，所以未进行治疗后ADA分析(未收集样品)。

药代动力学结论

全部17位随机分配到SAR156597的患者均暴露于SAR156597。从6位安慰剂患者血浆中未检测到SAR156597。

贝叶斯PK分析预测，在第6周7个SAR156597剂量后达到89％至94.7％的稳态。

t_1/2z范围是260小时(大约11天)至348小时(大约15天)，对t_1/2z具有预料不到的显著的剂量效应(p＝0.049)。

在第1周和第6周，SAR156597暴露的增加在比例上稍高于剂量。SAR156597剂量增加4倍表现出C_max增加5.21至5.92倍和AUC_0-168增加5.17至5.83倍。

作为SAR156597治疗的结果，无显著的治疗紧急的ADA反应性发生。

实施例5：在FRA-2转基因小鼠模型中IL-13是肺纤维化的驱动者

间质性肺病(ILD)是指一大组超过200种影响间质组织的肺疾病。一个重要的硬皮病患者亚群表现出带有实质肺涉入(parenchymal lung involvement)的肺表现，造成间质性肺异常及肺功能受损。此致命的末期病况的特征为间质性肺炎及瘢痕形成。

AP-1家族的转录因子调节控制多种细胞功能的多个目标基因的表达。AP-1复合体由Jun和Fos蛋白组成。Fos样抗原2(FRA-2)是Fos蛋白家族的成员，参与具有调节功能的AP-1复合体形成。

Eferl等之前验证了在转基因小鼠中FRA-2过表达造成数种器官纤维化，但主要是影响肺组织和皮肤(Eferl等，2008,Proc.Natl.Acad.Sci.105(30):10525-10530)。

此实施例描述了过表达Fra-2基因的新品系的转基因小鼠。这些小鼠在发育期间在13周开始表现出肺纤维化。纤维化的发生与升高量的循环和肺Th2细胞因子吻合。

由Eferl等所产生的转基因中，将EGFP基因工程化至构建体中使转基因表达可视化。全长的FRA2基因由H2kb启动子所驱动，导致转基因的遍在的表达。Eferl转基因构建体示于图19A中，且由H2Kb启动子、基因组Fra-2基因座、报告基因IRES-EGFP序列及带有多聚腺苷酸化信号(pA)的LTR序列组成。E1-E4是Fra-2的外显子1-4；指示了用于Southern印迹分析的HindIII(H)限制位点和探针位置(P)。

相比之下，图19B显示用于此处的转基因载体的示意图，其含驱动小鼠Fra-2基因的小鼠H2Kb启动子和T2A-EGFP-polyA-loxP-hUBp-EM7-Neo-loxP盒(4,898bp)。将四至八个拷贝的转基因随机整合至宿主染色体中。产生了五种过表达FRA2的初始转基因品系；三种品系基于转基因表达进行定性分类用于进一步表征。这些片段的基因体坐标系如下：H2Kb(H2-K1)启动子：Chr17:34,137,222-34,139,244(-)在Morello等,1986,EMBO J.5(8):1877-83；Fra-2(FosI2)基因(无终止):Chr5:32,438,859-32,455,559之后。

在初步观察研究中，于第8、14和16周对发育期间转基因的影响进行研究。在此期间，野生型对照组和FRA2小鼠之间在体重或死亡率上并无差异。此观察与Eferl等在第16周观察到50％死亡率相反。

FRA-2过表达的转基因小鼠表现出随着年龄增加，伴随通过羟基脯氨酸含量测量的胶原沉积增加，而肺重量增加(图5)。

在该模型中，有具有炎性细胞流进入肺中的早期炎症阶段(图6)。组织学分析也显示在肺样品中随着时间增加胶原沉积增加并如下进行。在无痛致死后，将肺于固定的压力下注入固定剂。然后移除肺并置入固定剂中。固定完成后，将肺放入1％琼脂溶液及以跨越前后向(transsagitally)切成3mm厚的逐层切片。处理后，将所有的切片嵌入石蜡块中。所有的石蜡块以4μm显微切片并使用梅森三色染剂(Masson’s Trichrome)染色以展现胶原沉积(蓝色)，及H&E染色以显示总体形态(图6)。

同样地，相比于野生型对照组，在皮肤中FRA2小鼠的皮层系随时间增加，与皮肤中胶原沉积相平行(图7和8)。

在该模型中，有具有炎性细胞流进入肺中并上调Th2细胞因子如IL-4和IL-13的早期炎症阶段。当肺和皮肤中具有上调的纤维化基因(ECM蛋白和介导物)时，则随后是晚期纤维化阶段。

发育和纤维化肺的细胞因子性质分析显示了Th2细胞因子概貌(IL-4、IL-5和IL-13)的增加(图9)。在第13周的发育观察到IL-4和IL-13显著增加，保持升高至第17周，其在这些动物中肺纤维化的发展是平行的。

在发育基因调节研究中，来自FRA2小鼠的肺和皮肤的基因表达分析显示了关键的信号纤维化标志物，包括TGF-b途径转录物、IL-4、IL-13、STAT6、促纤维化趋化因子及LOX的增加(图10)。

该发育肺纤维化小鼠模型用于研究IL-4和IL-13在纤维化中的作用。首先，IL-13在促进纤维化中的作用使用在FRA2小鼠模型中具有中和活性的验证的替代小鼠IL-13抗体(因为在啮齿类中没有SAR156597的交叉反应性)来评估。将13周龄的FRA2小鼠以10mpk、通过ip路径每周二次施用替代型小鼠IL-13抗体共计29天。将大鼠IgG1同种型以10mpk与FRA2小鼠平行给药作为对照。同样地，第三组FRA2小鼠接受盐水作为第二对照组。下表显示了用于此研究的不同治疗组。

表12：IL-13抗体小鼠研究中使用的治疗组

组	基因型	治疗	n
				1	WT	盐水	15
2	WT	同种型	15
				3	FRA-2Het	盐水	16
4	FRA-2Het	同种型	16
				5	FRA-2Het	抗IL-13	16

在研究结束时，将小鼠无痛处死并移出其肺并处理以提供(1)用于蛋白分析的肺均质物，(2)RNA制备物和(3)将一个肺叶绑扎并吹气、切下并固定以供组织学分析。使用肺均质物以对胶原的量进行定量。如图11所示，相比于wt同窝对照，FRA2小鼠肺的羟基脯氨酸含量增加。在经IL-13Ab处理的FRA2小鼠肺中羟基脯氨酸量显著下降。

通过FRA2和同窝对照肺部的组织学分析在细胞水平上确认了此观察(图12)。三色蓝染色的肺切片显示，相比于对应的野生型小鼠，FRA2小鼠对照组(盐水和同种型对照处理)的胶原沉积增加。在抗IL-13Ab处理的小鼠肺中观察到三色蓝染色下降，反映了降低的胶原含量(在图13中定量)。这些结果明确地证明了IL-13通过胶原沉积而促进肺纤维化的作用以及替代型抗IL-13Ab抑制胶原的能力。

使用通过实时PCR的转录分析来追踪多种由IL-13调节的基因、纤维化标志物和促纤维化介导物的表达。IPF生物标志物FN1、SPDEF和MUC5B的结果如图14所示。促纤维化标志物CCL2和CCL11的结果如图15所示。IL-6、ARG1和IL13Ra2的结果如图16所示。

IL-13-调节的蛋白表达在肺均质物中通过ELISA进一步研究。相比于野生型肺，在FRA2肺均质物中IL-13、IL-4和IL-17水平增加，并且这些细胞因子水平在抗IL-13Ab治疗后减弱(图17)。在4周治疗后，下降的IL-13水平确认了肺中抗体负载(图17)。

MCP-1(CCL2)是一种充分表征的与肺纤维化有关的趋化因子且由IL-13调节。同样地，CCL17/TARC和YKL-40是IL-13调节的蛋白。在替代型Ab治疗后，CCL2、CCL17和YKL-40受到了显著抑制(图18)。

整体而言，这些结果证明了IL-13在FRA2小鼠模型中促进肺纤维化的作用。IL-13表达的抑制与肺胶原含量及肺纤维化相关生物标志物的降低有关。

已详细并通过提述其具体实施方案描述了本发明，显然，在不背离所附的权利要求书中限定的本发明的范围的情况下，修饰和变化是可能的。更具体而言，虽然本发明的一些方面在本文定义为特别有利的，但预期本发明并不一定局限于本发明的这些具体方面。

序列表

<110> 赛诺菲(Sanofi)

C•埃斯普利特(Esperet, Corinne)

A•耶格施密特(Jagerschmidt, Alexandre)

C•苏布拉纳(Soubrane, Christina)

A•苏布拉马尼亚姆(Subramaniam, Arun)

<120> 抗IL4-IL13双特异性抗体

<130> 14-1111-WO

<150> US 62/018,253

<151> 2014-06-27

<150> EP 14306477.2

<151> 2014-09-24

<150> US 62/102,097

<151> 2015-01-11

<150> US 62/102,555

<151> 2015-01-12

<160> 7

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠/小鼠VL3区

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala

85 90 95

Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠/小鼠VH2区

<400> 2

Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser

20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠/小鼠VL1区

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠/小鼠VH1区

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠/小鼠VH2区

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Ala Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ggaggcggag ggtccggagg cggaggatcc 30

Claims

1.与IL-4和IL-13特异性结合的双-V-区抗体样蛋白或其片段在人受试者中的安全剂量，其中所述剂量包含多至约200mg的所述抗体样蛋白或其片段。

2.权利要求1的安全剂量，其中所述剂量包含约200mg的抗体样蛋白或其片段。

3.权利要求1的安全剂量，其中所述剂量包含约100mg的抗体样蛋白或其片段。

4.权利要求1的安全剂量，其中所述剂量包含约50mg的抗体样蛋白或其片段。

5.权利要求1-4中任一项的安全剂量，其中所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。

6.一种确定施用于人受试者的包含双-V-区抗体样蛋白或其片段的剂是否在人受试者中与IL-4或IL-13特异性结合的方法，该方法包括：

(a)将该剂施用人受试者；

(b)测量抽自所述人受试者的血液、血浆或血清样品中TARC/CCL17蛋白的量，其中相对于施用该剂之前于所述受试者中测量的TARC/CCL17的量，所述血液样品中TARC/CCL17的量下降表示双-V-区抗体样蛋白或其片段与IL-4或IL-13结合；及

(c)依照步骤(b)中测量的TARC/CCL17的下降，增加或减少剂量。

7.权利要求6的方法，其中步骤(c)进一步包括：若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17的下降低于阈值，则增加剂量，若在步骤(b)中测量的TARC/CCL17的下降高于阈值，则减少剂量。

8.权利要求7的方法，其中相对于施用该剂前于受试者中测量的TARC/CCL17的量，所述阈值是TARC/CCL17的量约43％的下降。

9.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述剂以皮下施用。

10.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述TARC/CCL17的量以酶联免疫吸附测定法(ELISA)来检测。

11.权利要求6-10中任一项的方法，其中所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。

12.一种用于人受试者中抗体或抗体样结合蛋白与IL-4或IL-13或二者结合的蛋白生物标志物，其中所述生物标志物为TARC/CCL17。

13.权利要求12的蛋白生物标志物，其中所述抗体或抗体样结合蛋白是双-V-区抗体样结合蛋白。

14.权利要求12或13的蛋白生物标志物，其中所述人受试者患有特发性肺纤维化(IPF)。

15.一种治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法，包括对患有IPF的人受试者施用多至200mg的双-V-区抗体样结合蛋白或其片段。

16.权利要求15的方法，其中所述双-V-区抗体样结合蛋白或其片段与IL-4、IL-13或二者结合。

17.权利要求15或16的方法，其中所述双-V-区抗体样结合蛋白或其片段每周施用一次。