JP2008520207A - タンパク質骨格およびその使用 - Google Patents

タンパク質骨格およびその使用 Download PDF

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JP2008520207A JP2007541482A JP2007541482A JP2008520207A JP 2008520207 A JP2008520207 A JP 2008520207A JP 2007541482 A JP2007541482 A JP 2007541482A JP 2007541482 A JP2007541482 A JP 2007541482A JP 2008520207 A JP2008520207 A JP 2008520207A
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ウィレム ピー． シー． ステマー
ジョセフ シルバーマン
ヨースト エイ． コルクマン
マーティン フォークト
キャンディス スイマー
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アヴィディア リサーチ インスティテュート
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Abstract

特異的な単量体ドメインを提供し、ならびにそれらの単量体ドメインを含む多量体が提供される。キットおよび集積システムとともに、1つまたは複数のライブラリーメンバーを発現する方法、組成物、ライブラリーおよび細胞も本発明に含まれる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2004年11月16日付で出願された米国仮特許出願第60/628,632号の恩典を主張するものであり、その開示は、あらゆる目的に関してその全体が参照として組み入れられる。本出願はまた、2004年6月17日付で出願された米国仮特許出願第10/871602号に関連し、この出願は2004年5月5日付で出願された米国仮特許出願第10/840,723号の一部継続出願であり、この出願は2003年10月24日付で出願された米国仮特許出願第10/693,056号の一部継続出願および2003年10月24日付で出願された米国仮特許出願第10/693,057号の一部継続出願であり、これらの出願はともに2002年11月6日付で出願された米国仮特許出願第10/289,660号の一部継続出願であり、この出願は2002年4月26日付で出願された米国仮特許出願第10/133,128号の一部継続出願であり、この出願は2002年4月18日付で出願された米国仮特許出願第60/374,107号、2001年11月26日付で出願された米国仮特許出願第60/333,359号、2001年11月19日付で出願された米国仮特許出願第60/337,209号、および2001年4月26日付で出願された米国仮特許出願第60/286,823号の優先権の恩典を主張するものであり、これらの全出願は全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
タンパク質配列および三次元構造の解析は、多くのタンパク質がいくつかの個別の単量体ドメインから構成されることを明らかにした。そのようなタンパク質は反復性構成単位の直線的なモザイクであるため、それらは「モザイクタンパク質」と呼ばれることが多い。個別の単量体ドメインタンパク質の大部分は細胞外であるか、または膜結合タンパク質の細胞外部分を構成する。
個別の単量体ドメインの重要な特性は、同一タンパク質内のその他のドメインとは独立して折り畳まれるその能力である。これらのドメインの折り畳みには、例えば、シャペロニン(例えば、受容体結合タンパク質(RAP))、金属イオン、または補因子からの限定された補助が必要になりうる。独立して折り畳まれる能力は、新たなタンパク質または新たな環境に挿入された場合に、そのドメインの誤った折り畳みを妨害する。この特性は、個別の単量体ドメインが進化的に移動性であることを可能にしてきた。結果として、個別のドメインは進化の過程で伝播し、かつ現在は関連性のない別のタンパク質に存在している。III型フィブロネクチンドメインおよび免疫グロブリン様ドメインを含むいくつかのドメインは、多数のタンパク質中に存在するが、他のドメインは限られた数のタンパク質においてのみ見出される。
これらのドメインを含むタンパク質は、発生および神経伝達に関与する細胞輸送体、コレステロール輸送、シグナル伝達およびシグナル伝達機能などの、種々の過程に関与している。Herz, (2001) Trends in Neurosciences 24(4)：193-195(非特許文献1)；Goldstein and Brown, (2001) Science 292：1310-1312(非特許文献2)を参照されたい。個別の単量体ドメインの機能は特異的であることが多いが、それはタンパク質またはポリペプチドの全体の活性にも寄与する。例えば、LDL受容体クラスAドメイン(クラスAモジュール、相補型反復、またはAドメインとも呼ばれる)は、ビタミンK依存性血液凝固タンパク質中に見出されるγ-カルボキシグルマチン酸(Gla)ドメインがリン脂質膜への高親和性結合に関与する一方、リガンド結合に関与する。他の個別の単量体ドメインとしては、例えば、肝細胞への結合を媒介し、それによって循環からのこのフィブリン溶解性酵素の除去を調節する組織型プラスミノーゲン活性化因子中の上皮成長因子(EGF)様ドメイン、および受容体媒介エンドサイトーシスに関与するLDL受容体の細胞質尾部が挙げられる。
個々のタンパク質は1つまたは複数の個別の単量体ドメインを有しうる。多数の反復性ドメインを含有するタンパク質は、モザイクタンパク質と呼ばれることが多い。例えば、LDL受容体ファミリーのメンバーは、4つの主要なファミリーに属する多数のドメインを含む：システインリッチAドメインリピート、上皮成長因子前駆体様リピート、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン。LDL受容体ファミリーは、1) 細胞表面受容体であるメンバー；2) 細胞外リガンドを認識するメンバー；および3) リソソームによる分解のためにそれらを内在化するメンバーを含む。Hussain et al., (1999) Annu. Rev. Nutr. 19：141-72(非特許文献3)を参照されたい。例えば、いくつかのメンバーには、超低密度リポタンパク質受容体(VLDL-R)、アポリポタンパク質E受容体2、LDLR関連タンパク質(LRP)、およびメガリンが含まれる。ファミリーのメンバーは以下の特徴を有する：1) 細胞表面での発現；2) Aドメインによって媒介される細胞外リガンド結合；3) 折り畳みおよびリガンド結合に対するカルシウムの要求性；4) 受容体結合タンパク質およびアポリポタンパク質(apo) Eの認識；5) YWTDリピートを含む上皮成長因子(EGF)前駆体相同性ドメイン；6) 単一の膜貫通領域；ならびに7) 種々のリガンドの受容体媒介エンドサイトーシス。Hussain、前記を参照されたい。これらのファミリーは、構造的に異なるいくつかのリガンドを結合する。
これらの個別の単量体ドメインの望ましい特性の作製および最適化の方法を開発することは利点がある。しかし、個別の単量体ドメインは、構造的に保存されていることが多いものの、特定のアミノ酸、例えば、Aドメインのシステイン残基を除いては、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで保存されていない。従って、既存のヌクレオチド組換え法は、これらの個別の単量体ドメインの望ましい特性の作製および最適化を満たしていない。
本発明はこれらのおよびその他の問題に取り組むものである。
Herz, (2001) Trends in Neurosciences 24(4)：193-195 Goldstein and Brown, (2001) Science 292：1310-1312 Hussain et al., (1999) Annu. Rev. Nutr. 19：141-72
発明の概要
本発明は、標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含むタンパク質、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このようなタンパク質を使用する方法、このようなタンパク質で用いるための単量体ドメインを同定する方法、および単量体ドメインを含むライブラリーを提供する。
本発明の1つの態様は、標的分子に特異的に結合する非天然の単量体ドメインを含むタンパク質を提供する。単量体ドメインは長さが30〜100アミノ酸であり、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインから選択される。いくつかの態様において、単量体ドメインは少なくとも1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成し；ならびにDSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成する。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
および「x」は任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
および「x」は任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
αはw、y、f、およびlから選択され；βはv、I、l、a、m、およびfから選択され；χはg、a、s、およびtから選択され；δはk、r、e、q、およびdから選択され；εはv、a、s、およびtから選択され；ならびにφはd、e、およびnから選択される。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
αはw、y、f、およびlから選択され；βはv、I、l、a、m、およびfから選択され；χはg、a、s、およびtから選択され；δはk、r、e、q、およびdから選択され；εはv、a、s、およびtから選択され；ならびにφはd、e、およびnから選択される。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まず：
Figure 2008520207
およびインテグリンβ単量体ドメイン配列は、以下の配列由来のわずか3点の挿入、突然変異、または欠失しか含まない。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
およびインテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含む。
Figure 2008520207
本発明は同様に、標的分子に特異的に結合する非天然の単量体ドメインを含むタンパク質を提供する。標的分子は、非天然の単量体ドメインと少なくとも75%、80%、85%、90%、85%、98%、または99%同一である天然の単量体ドメインによって結合されず、非天然の単量体ドメインは、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインから選択される。いくつかの態様において、単量体ドメインは少なくとも1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、単量体ドメインはイオン(例えば、カルシウム)を結合する。いくつかの態様において、単量体ドメインは長さが約30〜100アミノ酸である。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
および「x」は任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成し；ならびにDSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成する。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
αはw、y、f、およびlから選択され；βはv、I、l、a、m、およびfから選択され；χはg、a、s、およびtから選択され；δはk、r、e、q、およびdから選択され；εはv、a、s、およびtから選択され；ならびにφはd、e、およびnから選択される。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
およびインテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含む。
Figure 2008520207
本発明はさらに、少なくとも2つの単量体ドメインを含む組成物を提供し、ここで、少なくとも1つの単量体ドメインは非天然の単量体ドメインでありかつこの単量体ドメインはイオンを結合し、ならびに少なくとも1つの単量体ドメインはNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインから選択される。いくつかの態様において、2つの単量体ドメインの少なくとも1つは約50kD未満である。いくつかの態様において、2つのドメインはペプチドリンカーによって連結される。いくつかの態様において、リンカーは単量体ドメインの少なくとも1つに非相同性である。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
および「x」は任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
αはw、y、f、およびlから選択され；βはv、I、l、a、m、およびfから選択され；χはg、a、s、およびtから選択され；δはk、r、e、q、およびdから選択され；εはv、a、s、およびtから選択され；ならびにφはd、e、およびnから選択される。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
およびインテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含む。
Figure 2008520207
本発明はさらに、本明細書において記述されるタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
本発明は同様に、(1) 非天然の単量体ドメインのライブラリーを提供する段階により標的分子に結合する単量体ドメインを同定する方法を提供し、ここで、単量体ドメインは、
Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインが、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
Figure 2008520207
および「x」が任意のアミノ酸である、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインから選択される。いくつかの態様において、Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成し；ならびにDSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6はジスルフィド結合を形成する。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
αはw、y、f、およびlから選択され；βはv、I、l、a、m、およびfから選択され；χはg、a、s、およびtから選択され；δはk、r、e、q、およびdから選択され；εはv、a、s、およびtから選択され；ならびにφはd、e、およびnから選択される。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
およびインテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含む。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、この方法はさらに、同定された単量体ドメインを第2の単量体ドメインに連結させて、各々が少なくとも2つの単量体ドメインを含む多量体のライブラリーを形成する段階；第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階を含む。選択された多量体の各単量体ドメインは、同じ標的分子にまたは異なる標的分子に結合する。いくつかの態様において、選択された多量体は2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の単量体ドメインを含む。いくつかの態様において、この方法はさらに、少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異した単量体ドメインを含むライブラリーを提供する段階を含む。いくつかの態様において、突然変異させる段階は、ポリペプチドドメインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの、複数のポリヌクレオチド断片を組換える段階を含む。いくつかの態様において、この方法はさらに、第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；第2の標的分子に結合する単量体ドメインを同定する段階；第1の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを、第2の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結させ、それによって第1および第2の標的分子に対する親和性を有する多量体を形成する段階を含む。いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーはファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは細胞表面ディスプレイとして発現される。いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーはマイクロアレイ上に提示される。
本発明はさらに、非天然の単量体ドメインであって、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインから選択される単量体ドメインを含むタンパク質のライブラリーを含む。いくつかの態様において、Ca-EGF単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Notch/LNR単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Figure 2008520207
DSL単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
Anato単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
インテグリンβ単量体ドメインは以下の配列を含み：
Figure 2008520207
および「x」は任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、多量体の各単量体ドメインは、非天然の単量体ドメインである。いくつかの態様において、ライブラリーは、リンカーによって連結された少なくとも2つの単量体ドメインを含む複数の多量体を含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、異なる単量体ドメインを含む少なくとも100種の異なるタンパク質を含む。
本発明は、標的分子に結合するドメイン単量体および多量体を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、単量体ドメインのライブラリーを提供する段階；第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；および少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する段階を含む。いくつかの態様において、単量体ドメインはそれぞれイオン(例えば、カルシウム)を結合する。
いくつかの態様において、この方法はさらに、同定された単量体ドメインを第2の単量体ドメインに連結させて、各多量体が少なくとも2つの単量体ドメインを含む、多量体のライブラリーを形成させる段階；第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階を含む。
いくつかの態様において、選択された多量体の各単量体ドメインは、同じ標的分子に結合する。いくつかの態様において、選択された多量体は3つの単量体ドメインを含む。いくつかの態様において、選択された多量体は4つの単量体ドメインを含む。
いくつかの態様において、単量体ドメインはNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインからなる群より選択される。
いくつかの態様において、この方法は、少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異した単量体ドメインを含むライブラリーを提供するさらなる段階を含む。いくつかの態様において、突然変異させる段階は、単量体ドメインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの、複数のポリヌクレオチド断片を組換える段階を含む。いくつかの態様において、突然変異させる段階は指向進化；異なるループ配列の組合せ；部位特異的突然変異誘発；またはヒト配列と同一である配列の発生を引き起こす交差を作製する部位特異的組換えを含む。
いくつかの態様において、この方法はさらに、第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；第2の標的分子に結合する単量体ドメインを同定する段階；第1の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを第2の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結させ、それによって第1および第2の標的分子に対する親和性を有する多量体を形成させる段階を含む。
いくつかの態様において、標的分子はウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、酵素、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、酵素阻害剤、レポーター分子、血清タンパク質、および受容体からなる群より選択される。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、ウイルス複製に必要とされるポリペプチドである。
いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーは、ファージディスプレイ、ファージミドディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、または細胞表面ディスプレイ(例えば、大腸菌(E. coli)細胞表面ディスプレイ)、酵母細胞表面ディスプレイあるいはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合するタンパク質との融合を介したディスプレイによるように発現される。いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーは、96ウェル、384ウェルまたはさらに高密度のマイクロタイタープレートを含め、マイクロアレイ上に提示される。
いくつかの態様において、単量体ドメインはポリペプチドリンカーによって連結される。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは単量体ドメインと天然に結合しているリンカーである。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、単量体ドメインのファミリーと天然に結合しているリンカーである。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、単量体ドメインと天然に結合しているリンカーの変異体である。いくつかの態様において、リンカーはgly-serリンカーである。いくつかの態様において、連結させる段階は、単量体ドメインを異なる長さおよび組成の種々のリンカーと連結させることを含む。
いくつかの態様において、これらのドメインはジスルフィド結合の形成により二次および三次構造を形成する。いくつかの態様において、多量体は、ポリペプチドリンカーによって単量体ドメインに連結されているAドメインを含む。いくつかの態様において、リンカーは1〜20アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは5〜7アミノ酸で作製される。いくつかの態様において、リンカーは長さが6アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは、以下の配列A1A2A3A4A5A6を含み、ここで、A1はアミノ酸A、P、T、Q、E、およびKから選択され；A2およびA3はC、F、Y、W、またはM以外の任意のアミノ酸であり；A4はアミノ酸S、G、およびRから選択され；A5はアミノ酸H、P、およびRから選択され；A6はアミノ酸のTである。いくつかの態様において、リンカーは、第1のAドメインのC末端システインと第2のAドメインのN末端システインとの間の天然配列を含む。いくつかの態様において、リンカーはグリシンおよびセリンを含む。
本発明は同様に、少なくとも1つの標的分子に結合する多量体を同定する方法であって、各多量体が少なくとも2つの単量体ドメインを含みかつ各単量体ドメインが標的分子に結合特異性を示す、多量体のライブラリーを提供する段階；および標的分子結合多量体についての多量体のライブラリーをスクリーニングする段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、この方法はさらに、標的分子についての単一の単量体ドメインの結合活性よりも大きい、標的分子についての結合活性を有する標的分子結合多量体を同定する段階を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の多量体は、第2の標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含む。
標的分子に結合する多量体を同定する代替方法には、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインのライブラリーを提供する段階；第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインおよび/または免疫ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを同定する段階；同定された単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを単量体ドメインおよび/または免疫ドメインのライブラリーに連結させて、各多量体が少なくとも2つの単量体ドメイン、免疫ドメインまたはその組合せを含む、多量体のライブラリーを形成させる段階；第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階を含む方法が含まれる。
いくつかの態様において、単量体ドメインはそれぞれイオンを結合する。いくつかの態様において、イオンはカルシウムおよび亜鉛からなる群より選択される。
いくつかの態様において、リンカーは少なくとも3アミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは少なくとも6アミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは少なくとも10アミノ酸残基を含む。
本発明は同様に、異種リンカー配列によって分離された少なくとも2つの単量体ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、各単量体ドメインは標的分子に特異的に結合し；かつ各単量体ドメインは、非天然タンパク質の単量体ドメインである。いくつかの態様において、各単量体ドメインはイオンを結合する。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、第1の標的分子を結合する第1の単量体ドメインおよび第2の標的分子を結合する第2の単量体ドメインを含む。いくつかの態様において、このポリペプチドは2つの単量体ドメインを含み、各単量体ドメインは同じ標的分子上の異なる部位に特異的な結合特異性を有する。いくつかの態様において、このポリペプチドはさらに、第2の標的分子に結合特異性を有する単量体ドメインを含む。
いくつかの態様において、ライブラリー、多量体またはポリペプチドの単量体ドメインは、互いと典型的には約40%同一であり、通常は約50%同一であり、場合によっては約60%同一であり、および少なくとも70%同一であることが多い。
本発明は同様に、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明は同様に、標的分子に結合特異性を有する免疫ドメインの多量体、ならびに所望の標的分子との結合に向けてこのような多量体のライブラリーを作製するおよびスクリーニングする方法を提供する。より具体的には、本発明は、標的分子に結合する多量体を同定する方法であって、免疫ドメインのライブラリーを提供する段階；第1の標的分子に対する親和性について免疫ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；少なくとも1つの標的分子に結合する1つまたは複数(例えば、2つまたはそれ以上)の免疫ドメインを同定する段階；同定された単量体ドメインを連結させて、各多量体が少なくとも3つの免疫ドメイン(例えば、4つまたはそれ以上、5つまたはそれ以上、6つまたはそれ以上など)を含む、多量体のライブラリーを形成させる段階；第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階を含む方法を提供する。ミニボディー、単ドメイン抗体、Fab、またはこれらの組合せである少なくとも2つの免疫ドメインの多量体のライブラリーは同様に、本発明の実施に際して利用される。このようなライブラリーは、本明細書において記述される本発明の方法によって、所望の標的分子に結合する多量体を容易にスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、標的分子に結合するヘテロ免疫多量体を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、免疫ドメインのライブラリーを提供する段階；第1の標的分子に対する親和性について免疫ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；単量体ドメインのライブラリーを提供する段階；第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの免疫ドメインを同定する段階；少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する段階；同定された免疫ドメインを同定された単量体ドメインと連結させて、各多量体が少なくとも2つのドメインを含む、多量体のライブラリーを形成させる段階；第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階を含む。
本発明は同様に、標的分子に結合するNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを同定する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーを提供する段階；標的分子に対する親和性についてNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；および標的分子に結合するNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを同定する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法は、同定された単量体ドメインにNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーの各メンバーを連結し、多量体のライブラリーを形成する段階；標的分子に対する親和性について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および標的に結合する多量体を同定する段階を含む。いくつかの態様において、多量体は、単量体よりも高い親和性で標的に結合する。いくつかの態様において、この方法はさらに、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、または細胞表面ディスプレイからなる群より選択されるディスプレイ形式を用いてライブラリーを発現させる段階を含む。
いくつかの態様において、この方法はさらに、少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異したNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを含むライブラリーを提供する段階を含む。いくつかの態様において、突然変異させる段階は指向進化；部位特異的突然変異誘発；異なるループ配列の組合せによるもの、またはヒト配列と同一である配列の発生を引き起こす交差を作製する部位特異的組換えによるものを含む。
本発明は同様に、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーを提供する段階；標的分子に対する親和性についてNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；および標的分子に結合するNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを同定する段階を含む方法で同定された多量体を含むポリペプチドを産生する方法を提供する。いくつかの態様において、多量体は組換え遺伝子発現によって産生される。
本発明は同様に、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインに由来するNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーを作製する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのうちの2つの異なる天然変異体の各々からの少なくとも1つのループに対応するループ配列であって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であるループ配列を提供する段階；ループ配列を共有結合的に結び付けて、各キメラ配列が、少なくとも2つのループを有するキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインをコードする、キメラ単量体ドメイン配列のライブラリーを作製する段階；ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、および細胞表面ディスプレイからなる群より選択されるディスプレイ形式を用いてキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーを発現させる段階；標的分子との結合に向けてキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの発現ライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに標的分子に結合するNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを同定する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法はさらに、同定されたキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインをキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーの各メンバーに連結し、多量体のライブラリーを形成する段階；さらに高い親和性で第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；およびさらに高い親和性で第1の標的分子に結合するキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの多量体を同定する段階を含む。
本発明は同様に、ヒトNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのうちの2つの異なる天然変異体の各々からの少なくとも1つのループに対応するループ配列であって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であるループ配列を提供する段階；ループ配列を共有結合的に結び付けて、各キメラ配列が、少なくとも2つのループを有するキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインをコードする、キメラ単量体ドメイン配列のライブラリーを作製する段階；ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、および細胞表面ディスプレイからなる群より選択されるディスプレイ形式を用いてキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインのライブラリーを発現させる段階；標的分子との結合に向けてキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの発現ライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに標的分子に結合するキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを同定する段階を含む方法で同定されたキメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを作製する方法を提供する。いくつかの態様において、キメラNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインは組換え遺伝子発現によって産生される。
いくつかの態様において、単量体ドメインは標的分子に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは45またはそれ以下の長さのアミノ酸である。いくつかの態様において、異種アミノ酸配列は親和性ペプチド、異種のNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメイン、精製タグ、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)、およびレポータータンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ)から選択される。いくつかの態様において、標的は抗体の可変領域または超可変領域ではない。
本発明は、複数のリガンドに対する結合親和性について単量体ドメインまたは単量体ドメインを含む多量体のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、単量体ドメインまたは単量体ドメインの多量体のライブラリーを複数のリガンドに接触させる段階；およびリガンドの少なくとも1つに結合する単量体ドメインまたは多量体を選択する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法は、(i.) 単量体ドメインのライブラリーを複数のリガンドに接触させる段階；(ii.) リガンドの少なくとも1つに結合する単量体ドメインを選択する段階；(iii.) 選択された単量体ドメインを単量体ドメインのライブラリーに連結させて、選択された単量体ドメインおよび第2の単量体ドメインをそれぞれが含む、多量体のライブラリーを形成させる段階；(iv.) 多量体のライブラリーを複数のリガンドに接触させて、それぞれの複合体が多量体およびリガンドを含む、複数の複合体を形成させる段階；ならびに(v.) 少なくとも1つの複合体を選択する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法はさらに、選択された複合体の多量体を単量体ドメインまたは多量体のライブラリーに連結させて、選択された多量体および少なくとも第3の単量体ドメインをそれぞれが含む、多量体の第2のライブラリーを形成させる段階；多量体の第2のライブラリーを複数のリガンドに接触させて、複数の第2の複合体を形成させる段階；ならびに少なくとも1つの第2の複合体を選択する段階を含む。
いくつかの態様において、リガンドおよび多量体の同一性を判定する。いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーを複数のリガンドに接触させる。いくつかの態様において、多量体のライブラリーを複数のリガンドに接触させる。
いくつかの態様において、複数のリガンドは混合物中に存在する。いくつかの態様において、複数のリガンドはアレイ中に存在する。いくつかの態様において、複数のリガンドは細胞もしくは組織中にまたは細胞もしくは組織上に存在する。いくつかの態様において、複数のリガンドは固体支持体上に固定化される。
いくつかの態様において、リガンドはポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドをファージの表面上で発現させる。いくつかの態様において、単量体ドメインまたは多量体のライブラリーをファージの表面上で発現させる。
いくつかの態様において、多量体のライブラリーをファージの表面で発現させてライブラリー発現ファージを形成させ、リガンドをファージの表面で発現させてリガンド発現ファージを形成させ、かつこの方法では、ライブラリー発現ファージをリガンド発現ファージに接触させてリガンド発現ファージ/ライブラリー発現ファージ対を形成させる段階；ライブラリー発現ファージに結合しないリガンド発現ファージを除去する段階またはリガンド発現ファージに結合しないライブラリー発現ファージを除去する段階；およびリガンド発現ファージ/ライブラリー発現ファージ対を選択する段階を含む。いくつかの態様において、この方法はさらに、ポリヌクレオチドをファージ対から単離する段階ならびにポリヌクレオチドを増幅させて、リガンド発現ファージおよびライブラリー発現ファージ由来のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドハイブリッドを産生する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法は、ポリヌクレオチドハイブリッドを複数のファージ対から単離し、それによってポリヌクレオチドハイブリッドの混合物を形成させる段階を含む。いくつかの態様において、この方法は、ポリヌクレオチドハリブリダイゼーションを可能にする条件の下でcDNAライブラリーにハイブリッドポリヌクレオチドの混合物を接触させ、それによってcDNAライブラリー中のcDNAにハイブリッドポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる段階；およびハイブリダイズしたハイブリッドポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し、それによってcDNAによりコードされるポリペプチドに特異的に結合する単量体ドメインを同定する段階を含む。いくつかの態様において、単量体ドメインのライブラリーをファージの表面で発現させてライブラリー発現ファージを形成させ、リガンドをファージの表面で発現させてリガンド発現ファージを形成させ、選択された複合体は、リガンド発現ファージに結合したライブラリー発現ファージを含み、かつこの方法では、選択された単量体ドメインまたは多量体を第1および第2部分に分ける段階、第1部分の単量体ドメインまたは多量体を固体表面に連結させる段階およびファージディスプレイ・リガンドライブラリーを第1部分の単量体ドメインまたは多量体に接触させて、第1部分の単量体ドメインまたは多量体に結合する標的リガンドファージを同定する段階；第2部分の単量体ドメインまたは多量体をディスプレイするファージを細菌に感染させて、ファージを発現させる段階；ならびに発現したファージに標的リガンドファージを接触させて、標的リガンドファージおよび単量体ドメインまたは多量体をディスプレイするファージからなるファージ対を形成させる段階を含む。
いくつかの態様において、この方法はさらに、ファージ対の各ファージからポリヌクレオチドを単離し、それによってファージ対中のリガンドに結合する多量体または単量体ドメインを同定する段階を含む。いくつかの態様において、この方法はさらに、ポリヌクレオチドを増幅させて、標的リガンドファージおよびライブラリーファージ由来のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドハイブリッドを産生する段階を含む。
いくつかの態様において、この方法は、複数のファージ対からポリヌクレオチドハイブリッドを単離して増幅し、それによってポリヌクレオチドハイブリッドの混合物を形成させる段階を含む。いくつかの態様において、この方法は、ハリブリダイゼーションを可能にする条件の下でcDNAライブラリーにハイブリッドポリヌクレオチドの混合物を接触させ、それによってcDNAライブラリー中のcDNAにハイブリッドポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる段階；および会合したハイブリッドポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し、それによってcDNA会合cDNAによりコードされるリガンドに特異的に結合する単量体ドメインを同定する段階を含む。
本発明は同様に、
配列中のアミノ酸の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%もしくはそれ以上がシステインである；および
アミノ酸配列が少なくとも10、20、30、45、50、55、60、70、80、90、100もしくはそれ以上のアミノ酸長である；および/または
アミノ酸配列が150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、もしくは40アミノ酸長に満たない；および/または
アミノ酸の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%もしくはそれ以上が非天然アミノ酸である、
アミノ酸配列を含む非天然ポリペプチドを提供する。例えば、いくつかの態様において、アミノ酸配列は少なくとも10%のシステインを含む、およびアミノ酸配列は少なくとも50アミノ酸長である、またはアミノ酸の少なくとも25%が非天然である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は非天然のAドメインである。
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%またはそれ以上の非天然アミノ酸を有する1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の単量体を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の単量体ドメインは、天然のヒトタンパク質ではその位置に現れない少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%またはそれ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、単量体ドメインは天然のヒトタンパク質配列に由来する。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは同様に、少なくとも、例えば、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、400、500またはそれ以上の時間の血清中半減期を有する。
定義
特に明記しない限り、以下の定義が当技術分野における定義に代わって用いられる。
「単量体ドメイン」または「単量体」という用語は、タンパク質またはポリペプチド中に見出される個別の領域をいうよう本明細書において交換可能に用いられる。単量体ドメインは、隣接する天然のアミノ酸配列の非存在下で、溶液中で未変性の三次元構造を形成する。本発明の単量体ドメインは、標的分子に特異的に結合するよう選択することができる。本明細書において用いられる、「単量体ドメイン」という用語は、抗体の相補性決定領域(CDR)を包含しない。
「単量体ドメイン変異体」という用語とは、単量体ドメイン配列の人為的操作から得られたドメインをいう。人為的に操作した変化の例としては、例えば、ランダム突然変異、部位特異的変異誘発、組換え、指向進化、オリゴによる強制的交差事象、直接的遺伝子合成による突然変異の取込みなどが挙げられる。「単量体ドメイン変異体」という用語は、突然変異した抗体の相補性決定領域(CDR)を包含しない。
「ループ」という用語は、単量体ドメインタンパク質の骨格構造のアッセンブリによって環境に通常曝される単量体ドメインのその部分をいい、これは標的結合に関与する。本発明は、ジスルフィド結合、二次タンパク質構造間の架橋、および分子動態(すなわち、柔軟性)の可能性などの、特異的な特徴によって同定された3タイプのループを提供する。この3タイプのループ配列は、システインによって規定されたループ配列、構造によって規定されたループ配列、およびB因子によって規定されたループ配列である。
本明細書において用いられる「システインによって規定されたループ配列」という用語は、天然の単量体ドメインをコードする配列の部分配列であって、同一ファミリーのうちの少なくともその他1つの天然の単量体ドメインに関して保存されているシステイン残基が両端に結合しているその配列をいう。システインによって規定されたループ配列は、天然の単量体ドメインの多重配列アライメント、続いて保存システイン残基を同定するための配列解析によって同定される。保存システイン残基の各連続する対間の配列が、システインによって規定されたループ配列である。システインによって規定されたループ配列は、各末端に隣接するシステイン残基を含まない。システインによって規定されたループ配列を有する単量体ドメインは、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、Ca-EGF単量体ドメインなどを含む。すなわち、例えば、Notch/LNR単量体ドメインは共通配列CX7CX8CX3CX4CX6Cによって表され、式中X7、X8、X3、X4、およびX6は、システインによって規定されたループ配列をそれぞれ表し；DSL単量体ドメインは共通配列CX8CX3CX11CX7CX8Cによって表され、式中X8、X3、X11、X7、およびX8は、システインによって規定されたループ配列をそれぞれ表し；Anato単量体ドメインは共通配列CCX12CX12CX6CCによって表され、式中X12、X12、およびX6は、システインによって規定されたループ配列をそれぞれ表し;インテグリンβ単量体ドメインは共通配列CX2CX6CX2CX15CX10Cによって表され、式中X2、X6、X2、X15、およびX10は、システインによって規定されたループ配列をそれぞれ表し；ならびにCa-EGF単量体ドメインは共通配列CX6CX6CX8CX2CX13Cによって表され、式中X6、X6、X8、X2、およびX13は、システインによって規定されたループ配列をそれぞれ表す。
「多量体」という用語は、少なくとも2つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン(例えば、少なくとも2つの単量体ドメイン、少なくとも2つの免疫ドメイン、または少なくとも1つの単量体ドメインおよび少なくとも1つの免疫ドメイン)を含むポリペプチドを指すよう本明細書において用いられる。多量体中の分離した単量体ドメインおよび/または免疫ドメインはリンカーによって一緒に結合されうる。多量体は、コンビナトリアルモザイクタンパク質またはリコンビナントモザイクタンパク質としても知られている。
「ファミリー」および「ファミリークラス」という用語は、そのアミノ酸配列の類似性に基づいて一緒に分類されるタンパク質を指すよう交換可能に用いられる。これらの類似配列は、それらがタンパク質の機能および/またはタンパク質の三次元構造の維持にとって重要であることから、一般に保存されている。そのようなファミリーの例としては、LDL受容体Aドメインファミリー、EGF様ファミリーなどが挙げられる。
「リガンド」という用語は、本明細書において「標的分子」とも呼ばれ、単純な分子から複雑な標的までの範囲にわたる広範な種々の物質および分子を含む。標的分子は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物またはポリペプチドドメインによる認識が可能なその他任意の分子でありうる。例えば、標的分子は、化学的化合物(すなわち、例えば、有機分子、無機分子、またはポリヌクレオチドおよびタンパク質を除く、有機原子と無機原子の両方を有する分子などの非生物学的化合物)、化学的化合物の混合物、空間的に局在化した化合物のアレイ、生物学的高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、細菌、植物、真菌、または動物(例えば、哺乳動物)の細胞または組織などの生物学的材料から作製された抽出物、タンパク質、毒素、ペプチドホルモン、細胞、ウイルスなどを含みうる。他の標的分子には、例えば、細胞全体、組織全体、関連したタンパク質または関連していないタンパク質の混合物、ウイルス株または細菌株の混合物などが含まれる。標的分子は同様に、本明細書において記述されるスクリーニングアッセイにおける含有物によりまたは特異的なタンパク質相互作用を増強もしくは阻害すること(すなわち、2つの所定のポリペプチド間の結合相互作用を選択的に阻害する因子)により定義されうる。
本明細書において用いられる「免疫ドメイン」という用語は、少なくとも1つの、抗体の相補性決定領域(CDR)を含むタンパク質結合ドメインをいう。免疫ドメインは、天然の(すなわち、自然状態から単離された)免疫学的ドメインでありうるか、または人為的な操作(例えば、ランダム突然変異、部位特異的変異誘発、組換えなどのような変異誘発方法を介して、ならびに例えば、再帰的なエラーの生じやすいPCR、再帰的な組換えなどのような指向進化の方法によって)改変された、非天然の免疫学的ドメインでありうる。本発明の実施に際して用いるのに適した異なるタイプの免疫ドメインには、ミニボディー、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片(ScFv)、およびFab断片が含まれる。
「ミニボディー」という用語は本明細書において、天然のまたは非天然の(例えば、変異誘発を受けた)、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン、またはそれらの組み合わせの、2つのみの相補性決定領域(CDR)をコードするポリペプチドをいう。ミニボディーの例は、Pessi et al., A designed metal-binding protein with a novel fold, (1993) Nature 362：367-369に記述されている。
本明細書において用いられる「単ドメイン抗体」という用語は、抗体の重鎖可変ドメイン(「VH」)、すなわち、軽鎖可変ドメインを有しない重鎖可変ドメインをいう。本発明の実施に際して利用される例示的な単ドメイン抗体としては、例えば、Hamers-Casterman, C. et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains (1993) Nature 363：446-448、およびDumoulin et al., Single-domain antibody fragments with high conformational stability (2002) Protein Science 11：500-515に記述されているような、カメリド(Camelid)重鎖可変ドメイン(約118〜136アミノ酸残基)が挙げられる。
「単鎖可変断片」または「ScFv」という用語は、少なくとも12アミノ酸残基を有するペプチドリンカーによって連結された抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインをいうよう本明細書において交換可能に用いられる。本発明の実施に際して用いるのに企図される単鎖可変断片には、Bird, et al., (1988) Science 242(4877)：423-426およびHuston et al., (1988) PNAS USA 85(16)：5879-83に記述されているものが含まれる。
本明細書において用いられる「Fab断片」という用語は、2本のタンパク質鎖を有する免疫ドメインをいい、その1本は2つの軽鎖ドメイン(VL可変ドメインおよびCL定常ドメイン)からなる軽鎖ならびに2つの重鎖ドメイン(すなわち、VH可変ドメインおよびCH定常ドメイン)からなる重鎖である。本発明の実施に際して利用されるFab断片には、各重鎖および軽鎖成分のC末端に鎖間のジスルフィド結合を有するもの、ならびにそのようなC末端ジスルフィド結合を有しないものが含まれる。各断片は約47kDである。Fab断片は、Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Enzymol 178：497-515により記述されている。
「リンカー」という用語は、2つまたはそれ以上の個別の分離した単量体ドメインを連結または接続する部分または部分の群を指すよう本明細書において用いられる。リンカーは、多量体に一緒に連結された場合、個別の分離した単量体ドメインを分離したままにすることができる。リンカー部分は、典型的には、実質的に線状部分である。適切なリンカーには、ポリペプチド、ポリ核酸、ペプチド核酸などが含まれる。適切なリンカーは同様に、炭素骨格中に組み込まれた1つまたはそれ以上の酸素原子を有する、置換されてもよいアルキレン部分を含む。典型的には、リンカーの分子量は約2000ダルトン未満である。より典型的には、リンカーの分子量は約1500ダルトン未満であり、通常、約1000ダルトン未満である。リンカーは、例えば、多量体中の個別の分離した単量体ドメインの各々が分離した結合部位を介して同じ標的分子に結合する場合、個別の分離した単量体ドメインを協働可能とするのに十分に小さくすることができる。例示的なリンカーとしては、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはアミノ酸のポリペプチドあるいはその他の非天然の部分が挙げられる。リンカーは、天然の配列、その変異体、または合成配列の一部分とすることができる。リンカーは、例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または両方の組合せを含むことができる。
「分離した」という用語は、例えば、他の単量体ドメインを含め、他の部分と複合体化した場合でさえ、独立しかつ独立した状態で残っている部分の特性を指すよう本明細書において用いられる。単量体ドメインは、タンパク質中で分離したドメインである。なぜなら、単量体ドメインは、認識されかつタンパク質から分離されうる独立した特性を有するからである。例えば、LDLR中のAドメインのリガンド結合能力は、独立した特性である。他の分離の例としては、リンカーによって多量体中に複合体化または一緒に結合された場合でさえ、分離した独立したドメインを残している、多量体中の分離した単量体ドメインが挙げられる。分離した特性の別の例はリガンドに対する、多量体中の分離した結合部位である。
本明細書において用いられる「指向進化」とは、ポリヌクレオチド変異体が再帰性の過程において作製される、発現される、および活性(例えば、結合活性を有するポリペプチド)についてスクリーニングされる過程をいう。スクリーニングにおいて1つまたは複数の候補が選択され、次いで、選択された候補をコードするポリヌクレオチドを利用し、この過程を繰り返して、新たな変異体を作製する。指向進化は少なくとも2ラウンドの変異作製を含み、3、4、5、10、20またはそれ以上のラウンドの変異作製および選択を含むことができる。変異は、例えば、エラーの生じやすいPCR、遺伝子組換え、化学的変異誘発などによるものを含め、当業者に公知の任意の方法によって作製することができる。
「シャッフリング」という用語は、同一でない配列間の組換えを指すよう本明細書において用いられる。いくつかの態様において、シャッフリングは、相同組換えを介したまたは非相同組換えを介した、例えば、cre/lox系および/またはflp/frt系を介した交差を含むことができる。シャッフリングは、インビトロおよびインビボシャッフリング形式、インシリコシャッフリング形式、二本鎖または一本鎖鋳型のいずれかを用いるシャッフリング形式、プライマーに基づくシャッフリング形式、核酸断片化に基づくシャッフリング形式、ならびにオリゴヌクレオチド媒介シャッフリング形式を含め、これらの全てが同一でない配列間の組換え事象に基づいており、本明細書において以下でより詳細に記述されるまたは引用される種々の異なった形式に加えて、その他の同様な組換えに基づく形式を利用することで行うことができる。本明細書において用いられる、「ランダム」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸から構成され、かつ確率的なまたはランダムな過程によって構築されたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。ランダムなポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、枠組みまたは骨格モチーフを含むことができ、これらは不変異体配列を含むことができる。
本明細書において用いられる「擬似ランダム」という用語は、可変性が限定されているため、ある位置での残基可変性の程度が限定されるものの、任意の擬似ランダム位置は少なくともある程度の残基可変性が可能とされる一連の配列、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドをいう。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸配列をいうよう本明細書において交換可能に用いられる。
「同類アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい同類アミノ酸置換群はバリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。
「核酸配列」という語句は、5'から3'末端方向に読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖重合体をいう。これは染色体DNA、自己複製プラスミドおよび一次的な構造的役割を果たすDNAまたはRNAを含む。
「コードする」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列をいう。この用語は開始または終止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列によって供与される6つの異なる読み枠のいずれか1つでコードされうる。
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼおよび転写を開始するその他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写の開始点から上流におよび/または下流に位置する領域または配列をいう。
「ベクター」とは、これが宿主染色体とは独立している場合、宿主生物中で複製が可能なポリヌクレオチドをいう。ベクターの例には、プラスミドが含まれる。ベクターは、典型的には、複製起点を有する。ベクターは、例えば、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の核酸発現の調節に有用なプロモーターを含むことができる。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、もしくは核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていることを示すか、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、天然の(組換えでない)細胞の形態において見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現しているか、発現が減少しているか、または全く発現していない、天然の遺伝子を発現する。
ポリペプチドに「特異的に(または選択的に)結合する」という語句は、単量体または多量体に対していう場合、タンパク質およびその他の生物製剤の不均質集団中にポリペプチドが存在することの決定要因でありうる結合反応をいう。従って、抗体結合アッセイで用いられる標準的な条件またはアッセイの下で、特定の単量体または多量体は、バックグラウンドを超えて(例えば、バックグラウンドを2倍、5倍、10倍またはそれ以上超えて)特定の標的分子に結合し、かつサンプル中に存在するその他の分子に有意な量で結合しない。
2つまたはその以上の核酸またはポリペプチド配列という文脈において、「同一な」または「同一性」の割合という用語は、同一である2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。「実質的に同一な」とは、比較ウィンドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを利用してもしくは手動的アライメントおよび目視検査によって判定されるような指定領域に対して最大の一致を求めて比較され整列される場合に、特定の割合の同一なアミノ酸残基またはヌクレオチド(すなわち、特定の領域にわたって、または特定されていない場合、配列全体にわたって60%の同一性、任意で65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性)を有する2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列をいう。任意で、同一性または実質的な同一性は、長さが少なくとも約50ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは、長さが100〜500または1000もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸である領域にわたって存在する。
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、2つの配列が天然配列中に見出されるのと同じように連結されていなければ、第2の配列に対して「異種」である。例えば、異種コード配列に機能的に連結されたプロモーターとは、任意の天然の対立遺伝子変異体とは異なるコード配列をいう。「異種リンカー」という用語は、多量体に関連して用いられる場合、自然状態では互いに同じ関連性で見出されないリンカーと単量体とを多量体が含む(例えば、それらが融合タンパク質を形成する)ことを示す。
タンパク質配列中の「非天然アミノ酸」とは、比較ウィンドウが問合せ単量体ドメインの長さでありかつ本明細書において記述されるBLAST 2.0を用いてGenbankの非冗長性(「nr」)データベースと比較された場合に最低最小の合計確率を有する、天然ポリペプチドとのアライメントにおいて対応位置に現れるアミノ酸以外の任意のアミノ酸をいう。
「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された2つの配列を比較することで決定され、この場合に比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのために参照配列(これは付加または欠失を含んでいない)と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。この割合は、適合した位置の数を得るよう同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に現れる位置の数を決定し、適合した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、この結果に100を乗じて配列同一性の割合を得ることで計算される。
2つまたはその以上の核酸またはポリペプチド配列という文脈において、「同一な」または「同一性」の割合という用語は、比較ウィンドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを利用してもしくは手動的アライメントおよび目視検査によって判定されるような指定領域に対して最大の一致を求めて比較され整列される場合に、同一である、または特定の割合の同一なアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する2つまたはそれ以上の核酸または部分配列をいう。そのような配列はひいては「実質的に同一」であると言われる。この定義は同様に、試験配列の相補体をいう。任意で、同一性は、長さが少なくとも約50アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは、長さが75〜100アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
配列比較の場合、典型的には1つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を指定し、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが使われてもよく、または代替的なパラメータを指定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する。
本明細書において用いられる「比較ウィンドウ」は、20〜600個、通常は約50〜約200個、さらに通常は約100〜約150個からなる群より選択される連続的位置の数のいずれか1つのセグメントであって、2つの配列が最適に整列された後で同数の連続的位置の参照配列に対し配列を比較できるセグメントへの言及を含む。比較のための配列アライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のために最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2：482cの局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48：443の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85：2444の類似性の検索法により、コンピュータによるこれらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)の実施により、または手動的アライメントおよび目視検査により(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995増刊)を参照のこと)行うことができる。
有用なアルゴリズムの1例はBLAST 2.0アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215：403-410に記述されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に問合せ配列における長さWの短いワード(これは、データベース配列における同じ長さのワードと整列される場合、ある正の値の閾値スコアTに適合するか、それらを満たすかのいずれかである)を同定することによって、高スコア配列(HSP)ペアを同定する工程を包含する。Tは、隣接ワードスコア閾値という(Altschul et al,, 前記)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始するための元として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM (適合残基の対に対する報酬(reward)スコア；常に＞0)およびパラメータN (ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコア付けマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xで減少する場合；1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが0もしくはそれ以下になる場合；または配列のいずれかの末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXは、アライメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)では、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムでは、デフォルトとして3のワード長、および10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915を参照のこと)、50のアライメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムでは同様に、2つの配列間の類似性の統計的解析を行う(例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5787を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの基準は、最小の合計確率であり（P(N))、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸との比較における最小の合計確率が約0.2より小さい、より好ましくは約0.01より小さい、そして最も好ましくは約0.001より小さい場合、参照配列に類似であると考えられる。
発明の詳細な説明
本発明は、単量体ドメイン、および単量体ドメインの多量体を含む親和剤を提供する。親和剤は、所望のリガンドまたはリガンド混合物に結合する能力について選択することができる。単量体ドメインおよび多量体は、別個の単量体ドメインと比べて、リガンドまたはリガンド混合物に対する結合活性もしくは親和性の改良または特異性の変化などの改良特性を有するものを同定するようスクリーニングすることができる。本発明の単量体ドメインは、単量体ドメインはNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、およびCa-EGF単量体ドメインの特異的変異体を含む。
I. 単量体ドメイン
多くの適当な単量体ドメインを本発明のポリペプチドで使用することができる。典型的には、適当な単量体ドメインは、3つのジスルフィド結合、30〜100アミノ酸を含み、例えば、カルシウムなどの、二価金属イオンに対する結合部位を有する。いくつかの態様において、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインが本発明の骨格で使用される。
単量体ドメインは任意の数の特性を有しうる。例えば、いくつかの態様において、単量体ドメインは動物(例えば、ヒト)での免疫原性が低い、またはない。単量体ドメインは小さなサイズを有しうる。いくつかの態様において、単量体ドメインは皮膚またはその他の組織に浸透するほど十分に小さい。単量体ドメインは一連のインビボ半減期または安定性を有しうる。単量体ドメインの特性には、独立して折り畳まれる能力および安定な構造を形成する能力が含まれる。
単量体ドメインは、任意のサイズのポリペプチド鎖とすることができる。いくつかの態様において、単量体ドメインは、約25〜約500、約30〜約200、約30〜約100、約35〜約50、約35〜約100、約90〜約200、約30〜約250、約30〜約60、約9〜約150、約100〜約150、約25〜約50、または約30〜約150アミノ酸を有する。同様に、本発明の単量体ドメインは、例えば、約30〜約200アミノ酸；約25〜約180アミノ酸；約40〜約150アミノ酸；約50〜約130アミノ酸；または約75〜約125アミノ酸を含むことができる。単量体ドメインおよび免疫ドメインは、典型的には、溶液中で安定な高次構造を維持することができ、多くの場合、熱に安定である、例えば、結合親和性を失うことなく少なくとも10分間95℃で安定である。単量体ドメインは、典型的には、約10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、約0.01μM、約0.1μM、または約1μM未満のKdで結合する。単量体ドメインおよび免疫ドメインは、安定な高次構造に独立して折り畳まれることがある。1つの態様において、安定な高次構造は金属イオンによって安定化される。安定な高次構造は、任意でジスルフィド結合(例えば、少なくとも1個、2個、もしくは3個またはそれ以上のジスルフィド結合)を含んでもよい。ジスルフィド結合は、2つのシステイン残基間で形成されてもよい。いくつかの態様において、単量体ドメイン、または単量体ドメイン変異体は、例示されている配列(例えば、Notch/LNR、DSL、Anato、インテグリンβン、またはCa-EGF)または本明細書において他に引用されている配列と実質的に同一である。
本発明の実施に際して用いるのに特に適した例示的な単量体ドメインは、ジスルフィド結合を含むシステインリッチなドメインである。典型的には、ジスルフィド結合は三次元構造へのドメインの折り畳みを促進する。通常、システインリッチなドメインは、少なくとも2つのジスルフィド結合、より典型的には少なくとも3つのジスルフィド結合を有する。適当なシステインリッチ単量体ドメインは、例えば、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGFを含む。
単量体ドメインは同様に、負に荷電した残基のクラスターを有することができる。単量体ドメインはイオンを結合して、その二次構造を維持することができる。そのような単量体ドメインは、例えば、Aドメイン、EGFドメイン、EFハンド(例えば、カルモジュリンおよびトロポニンCに存在するもの)、カドヘリンドメイン、C型レクチン、C2ドメイン、アネキシン、Glaドメイン、3型トロンボスポンジンドメインを含み、これらの全てがカルシウム、および亜鉛を結合するジンクフィンガー(例えば、C2H2型 C3HC4型(RINGフィンガー)、インテグラーゼ亜鉛結合ドメイン、PHDフィンガー、GATAジンクフィンガー、FYVEジンクフィンガー、Bボックスジンクフィンガー)を結合する。本発明を限定することを意図するわけではないが、イオン結合は、一次配列にもよるが、多数の結合高次構造を可能とするのに十分な柔軟性を供与しながら二次構造を安定化させると考えられる。
単量体ドメインの構造は、多くの場合、保存されているが、単量体をコードするポリヌクレオチド配列は保存される必要はない。例えば、ドメイン構造はドメインファミリーのメンバー間で保存されうるが、ドメインの核酸配列は保存されていない。従って、例えば、単量体ドメインは、そのシステイン残基および金属イオン(例えば、カルシウム)に対するその親和性によってNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインとして分類されるが、その核酸配列によっては必ずしも分類されない。
いくつかの態様において、適当な単量体ドメイン(例えば、独立してまたはある程度の限られた補助で折り畳まれる能力を有するドメイン)は、Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) (Shultz et al., SMART：a web-based tool for the study of genetically mobile domains, (2000) Nucleic Acids Research 28(1)：231-234を参照のこと)またはCATH (Pearl et. al., Assigning genomic sequences to CATH, (2000) Nucleic Acids Research 28(1)：277-282を参照のこと)などのコンピュータ配列解析ツールによって規定されるようなβサンドイッチまたはβバレル三次元構造を含むタンパク質ドメインのファミリーから選択することができる。
いくつかの態様において、単量体ドメインを基質に結合するよう改変させて、例えば、酵素活性および/または基質変換を含む、タンパク質機能を増強させる。
本明細書において記述されるように、単量体ドメインは、天然の相同ドメインが結合できる標的以外の標的に結合する能力について選択することができる。すなわち、いくつかの態様において、本発明は、天然の相同ドメインが結合できる標的または標的タンパク質のクラスもしくはファミリーに結合しない単量体ドメイン(およびこのような単量体を含む多量体)を提供する。
本明細書において記述される各ドメインでは、例示的なモチーフ(すなわち、骨格)を利用する。ある種の位置はxと印がつけられており、任意のアミノ酸がその位置を占有できることを示す。これらの位置はいくつかの異なるアミノ酸の可能性を含んでおり、それによって配列多様性、すなわち、異なる標的分子に対する親和性を可能にすることができる。モチーフ中の角括弧の使用により、位置内で可能な代替アミノ酸が示される(例えば、「[ekq]」はE、KまたはQのいずれかがその位置に存在してよいことを示す)。モチーフ中の丸括弧の使用により、丸括弧内の位置が存在してもまたは存在しなくてもよいことを示す(例えば、「([ekq])」はその位置が存在しないかまたはE、K、もしくはQのいずれかがその位置に存在してよいことを示す)。複数の「x」が丸括弧中で使われる場合(例えば、「(xx)」)、それぞれのxが可能な位置を表す。すなわち、「(xx)」は0個、1個または2個のアミノ酸がその位置に存在しうることを示し、ここで各アミノ酸は任意のアミノ酸から独立して選択される。αは、例えば、W、Y、F、またはLなどの芳香族/疎水性アミノ酸を表し；βは、例えば、V、I、L、A、M、またはFなどの疎水性アミノ酸を表し；χは、例えば、G、A、S、またはTなどのより小さな極性アミノ酸を表し；δは、例えば、K、R、E、Q、またはDなどの荷電アミノ酸を表し；εは、例えば、V、A、S、またはTなどの小さなアミノ酸を表し；およびφは、例えば、D、E、またはNなどの負に荷電したアミノ酸を表す。
適当なドメインは、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、Ca-EGF単量体ドメイン、SHKT単量体ドメイン、コノトキシン単量体ドメイン、デフェンシンβ単量体ドメイン、デフェンシン2(節足動物)単量体ドメイン、デフェンシン1(哺乳動物)単量体ドメイン、トキシン2(サソリ短鎖(scorpion short))単量体ドメイン、トキシン3(サソリ)単量体ドメイン、トキシン4(アネモネ)単量体ドメイン、トキシン12(クモ)単量体ドメイン、μコノトキシン単量体ドメイン、コノトキシン11単量体ドメイン、ωアトラコトキシン単量体ドメイン、ミオトキシン単量体ドメイン、CART単量体ドメイン、Fn1単量体ドメイン、Fn2単量体ドメイン、δアトラコトキシン単量体ドメイン、トキシン1(ヘビ)単量体ドメイン、トキシン5(サソリ短鎖)単量体ドメイン、トキシン6(サソリ)単量体ドメイン、トキシン7(クモ)単量体ドメイン、トキシン9(クモ)単量体ドメイン、およびγチオニン単量体ドメイン、TSP2単量体ドメイン、ソマトメジンB様単量体ドメイン、ホリスタチンN末端ドメイン様単量体ドメイン、シスチンノット様単量体ドメイン、ノット1単量体ドメイン、トキシン8単量体ドメイン、ならびにジスインテグリン単量体ドメインを含む。
Notch/LNRドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC5、C2とC4、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なNotch/LNRドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、Notch/LNRドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも153個の天然のNotch/LNRドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のNotch/LNRドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、膜貫通受容体が挙げられる。Notch/LNRドメインは、例えば、Sands and Podolsky Annu. Rev. Physiol. 58：253-273 (1996)；Carr et al., PNAS 91：2206-2210 (1994)；およびDeA et al., PNAS 91：1084-1088 (1994))にさらに記述されている。
DSLドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC5、C2とC4、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なDSLドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、DSLドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも100個の天然のDSLドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のDSLドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、lag-2およびapx-1が挙げられる。DSLドメインは、例えば、Vardar et al., Biochemistry 42：7061 ((2003))；Aster et al., Biochemistry 38：4736 (1999)；Kimble et al., Annu Rev Cell Dev Biol 13：333-361 (1997)；Artavanis-Tsokanas et al., Science 268：225-232 (1995)；Fitzgerald et al., Development 121：4275-82 (1995)；Tax et al., Nature 368：150-154 (1994)；およびRebayl et al., Cell 67：687-699 (1991)にさらに記述されている。
Anatoドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約35または約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なanatoドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、anatoドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも188個の天然のanatoドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のanatoドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、C3a、C4aおよびC5aアナフィラトキシンが挙げられる。Anatoドメインは、例えば、Pan et al., J. Cell. Biol. 123： 1269-1277 (1993)；Hugli, Curr Topics Microbiol Immunol. 153：181-208 (1990)；およびZuiderweg et al., Biochemistry 28：172-85 (1989))にさらに記述されている。
インテグリンβドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。ドメインのシステイン残基がジスルフィド連結されて、歪んだβ鎖を含む小型の、安定な、機能的に独立した部分を形成する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なインテグリンβドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、インテグリンβドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも126個の天然のインテグリンβドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。インテグリンβドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着のための受容体が挙げられる。インテグリンβドメインは、例えば、Jannuzi et al., Mol Biol Cell. 15(8)：3829-40 (2004)；Zhao et al., Arch Immunol Ther Exp. 52(5)：348-55 (2004)；およびCalderwood et al., PNAS USA 100(5)：2272-7 (2003)にさらに記述されている。
Ca-EGFドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜60アミノ酸および場合によっては約55アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC5、C2とC4、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なCa-EGFドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、Ca-EGFドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも2559個の天然のCa-EGFドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のCa-EGFドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、膜結合および細胞外タンパク質が挙げられる。Ca-EGFドメインは、例えば、Selander-Sunnerhagen et al., J Biol Chem. 267(27)：19642-9 (1992)にさらに記述されている。
SHKTドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC6、C2とC5、C3とC4。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なSHKTドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、SHKTドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも319個の天然のSHKTドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のSHKTドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼが挙げられる。SHKTドメインは、例えば、Pan, Dev. Genes Evol. 208： 259-266 (1998))にさらに記述されている。
コノトキシンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なコノトキシンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、コノトキシンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも351個の天然のコノトキシンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のコノトキシンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、カルシウムチャンネルを遮断するω-コノトキシンおよびカタツムリトキシンが挙げられ、コノトキシンドメインは、例えば、Gray et al., Annu Rev Biochem 57：665-700 (1988)およびPallaghy et al., J Mol Biol 234：405-420 (1993)にさらに記述されている。
デフェンシンβドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なデフェンシンβドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、デフェンシンβドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも68個の天然のデフェンシンβドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のデフェンシンβドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、膜孔形成トキシンが挙げられる。デフェンシンβドメインは、例えば、Liu et al., Genomics 43：316-320 (1997)およびBensch et al., FEBS Lett 368：331-335 (1995)にさらに記述されている。
デフェンシン2(節足動物)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なデフェンシン2(節足動物)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、デフェンシン2(節足動物)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも58個の天然のデフェンシン2(節足動物)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のデフェンシン2(節足動物)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、抗菌性ペプチドが挙げられる。デフェンシン2(節足動物)ドメインは、例えば、Cornet et al., Structure 3：435-448 (1995)にさらに記述されている。
デフェンシン1(哺乳動物)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC5、C2とC4、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なデフェンシン1(哺乳動物)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、デフェンシン1(哺乳動物)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも53個の天然のデフェンシン1(哺乳動物)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のデフェンシン1(哺乳動物)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、陽イオン性の殺菌ペプチドが挙げられる。デフェンシン1(哺乳動物)ドメインは、例えば、White et al., Curr Opin Struct Biol 5(4)：521-7 (1995)にさらに記述されている。
トキシン2(サソリ短鎖)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC6、C3とC5。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン2(サソリ短鎖)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン2(サソリ短鎖)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも64個の天然のトキシン2(サソリ短鎖)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン2(サソリ短鎖)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、カリブドトキシン、カリオトキシン、ノキシウストキシン、およびイベリオトキシンが挙げられる。トキシン2(サソリ短鎖)ドメインは、例えば、Martin et al., Biochem J. 304 (Pt 1)：51-6 (1994)およびLippens et al., Biochemistry 34(1)：13-21 (1995)にさらに記述されている。
トキシン3(サソリ)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン3(サソリ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン3(サソリ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも214個の天然のトキシン3(サソリ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン3(サソリ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、神経毒およびマスタードトリプシン阻害物質MTI-2が挙げられる。トキシン3(サソリ)ドメインは、例えば、Kopeyan et al., FEBS Lett. 261(2)：423-6 (1990)；Zhou et al., Biochem J. 1257(2)：509-17 (1989)；およびGregoire and Rochat, Toxicon. 21(1)：153-62 (1983)にさらに記述されている。
トキシン4(アネモネ)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン4(アネモネ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン4(アネモネ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも23個の天然のトキシン4(アネモネ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン4(アネモネ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、カリトキシンおよびアントプレウリンが挙げられる。トキシン4(アネモネ)ドメインは、例えば、Liu et al., Toxicon 41(7)：793-801 (2003)にさらに記述されている。
トキシン12(クモ)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン12(クモ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン12(クモ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも38個の天然のトキシン12(クモ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン12(クモ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、クモカリウムチャンネル阻害物質が挙げられる。
μコノトキシンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なμコノトキシンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、μコノトキシンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも4個の天然のμコノトキシンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のμコノトキシンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、ナトリウムチャンネル阻害物質が挙げられる。μコノトキシンドメインは、例えば、Nielsen et al., 277：27247-27255 (2002))にさらに記述されている。
コノトキシン11ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なコノトキシン11ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、コノトキシン11ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも3個の天然のコノトキシン11ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のコノトキシン11ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、けいれん性ペプチドtx9aが挙げられる。コノトキシン11ドメインは、例えば、Miles et al., J Biol Chem. 277(45)：43033-40 (2002)にさらに記述されている。
ωアトラコトキシンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なωアトラコトキシンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、ωアトラコトキシンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも7個の天然のωアトラコトキシンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のωアトラコトキシンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、昆虫特異的な神経毒が挙げられる。ωアトラコトキシンドメインは、例えば、Tedford et al., J Biol Chem. 276(28)：26568-76 (2001)にさらに記述されている。
ミオトキシンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なミオトキシンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、ミオトキシンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも14個の天然のミオトキシンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のミオトキシンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、ガラガラヘビ蛇毒が挙げられる。ミオトキシンドメインは、例えば、Griffin and Aird, FEBS Lett. 274(1-2)：43-7 (1990)およびSamejima et al., Toxicon 29(4-5)：461-8 (1991)にさらに記述されている。
CARTドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。6個のシステインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC3、C2とC5、C4とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なCARTドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、CARTドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも9個の天然のCARTドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のCARTドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、コカインおよびアンフェタミン制御転写物I型タンパク質(CART)配列が挙げられる。CARTドメインは、例えば、Kristensen et al., Nature 393(6680)：72-6 (1998)にさらに記述されている。
Fn1ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なFn1ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、Fn1ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも243個の天然のFn1ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のFn1ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。Fn1ドメインは、例えば、Bennett et al., J Biol Chem. 266(8)：5191-201 (1991)；Baron et al., Nature. 345(6276)：642-6 (1990)；およびSmith et al., Structure 3(8)：823-33 (1995)にさらに記述されている。
Fn2ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なFn2ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、Fn2ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも248個の天然のFn2ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のFn2ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、血液凝固第XII因子、ウシ精漿タンパク質PDC-109 (BSP-A1/A2)およびBSP-A3；陽イオン非依存性のマンノース-6-リン酸受容体；マクロファージのマンノース受容体；180 Kdの分泌ホスホリパーゼA2受容体；DEC-205受容体；72 Kdおよび92 KdのIV型コラゲナーゼ(EC：3.4.24.24)；ならびに肝細胞増殖因子活性化因子が挙げられる。Fn2ドメインは、例えば、Dean et al., PNAS USA 84(7)： 1876-80 (1987)にさらに記述されている。
δアトラコトキシンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。システインのうちで、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見出される： C1とC4、C2とC5、C3とC6。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なδアトラコトキシンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、δアトラコトキシンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも6個の天然のδアトラコトキシンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のδアトラコトキシンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、ナトリウムチャンネル阻害物質が挙げられる。δアトラコトキシンドメインは、例えば、Gunning et al., FEBS Lett. 554(1-2)：211-8 (2003)；Alewood et al., Biochemistry 42(44)： 12933-40 (2003)；Corzo et al., FEBS Lett. 547(1-3)：43-50 (2003)；およびMaggio and King, Toxicon 40(9)：1355-61 (2002)にさらに記述されている。
トキシン1(ヘビ)ドメインは、約30〜80または30〜75アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン1(ヘビ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン1(ヘビ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも334個の天然のトキシン1(ヘビ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン1(ヘビ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するヘビ毒が挙げられる。トキシン1(ヘビ)ドメインは、例えば、Jonassen et al., Protein Sci 4：1587-1595 (1995)およびDufton, J. Mol. Evol. 20：128-134 (1984)にさらに記述されている。
トキシン5(サソリ短鎖)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約35アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン5(サソリ短鎖)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン5(サソリ短鎖)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも15個の天然のトキシン5(サソリ短鎖)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン5(サソリ短鎖)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、分泌サソリ短鎖トキシンが挙げられる。
トキシン6(サソリ)ドメインは、約15〜50または20〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約15〜35アミノ酸および場合によっては約25アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約6システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン6(サソリ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン6(サソリ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも7個の天然のトキシン6(サソリ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン6(サソリ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、カルシウム活性化カリウムチャンネルを遮断するサソリ毒およびタンパク質が挙げられる。トキシン6(サソリ)ドメインは、例えば、Zhu et al., FEBS Lett 457：509-514 (1999)およびXu et al., Biochemistry 39：13669-13675 (2000)にさらに記述されている。
トキシン7(クモ)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン7(クモ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン7(クモ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも14個の天然のトキシン7(クモ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン7(クモ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、短いクモ神経毒(short spider neurotoxins)が挙げられる。トキシン7(クモ)ドメインは、例えば、Skinner et al., J. Biol. Chem. (1989) 264：2150-2155 (1989)にさらに記述されている。
トキシン9(クモ)ドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約40アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なトキシン9(クモ)ドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、トキシン9(クモ)ドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも13個の天然のトキシン9(クモ)ドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のトキシン9(クモ)ドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、クモ神経毒およびカルシウムイオンチャンネル遮断物質が挙げられる。
γチオニンドメインは、約30〜50または30〜65アミノ酸を含む。いくつかの態様において、このドメインは約35〜55アミノ酸および場合によっては約50アミノ酸を含む。35〜55アミノ酸の中に、典型的には約4〜約8システイン残基が存在する。これらのリピートのクラスターはリガンド結合ドメインを構成し、差次的なクラスター形成はリガンド結合に関して特異性を与えることができる。
例示的なγチオニンドメイン配列および共通配列は以下の通りである。
Figure 2008520207
いくつかの態様において、γチオニンドメイン変異体は、上記の配列のいずれかに実質的に同一な配列を含む。
今日まで、少なくとも133個の天然のγチオニンドメインが、cDNA配列に基づいて同定されている。天然のγチオニンドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、多様な作物由来の動物性、細菌性、真菌性毒素が挙げられる。γチオニンドメインは、例えば、Bloch et al., Proteins 32(3)：334-49 (1998)にさらに記述されている。
上記のように、単量体ドメインは天然の変異体、または非天然の変異体とすることができる。「天然(の)」という用語は、対象を天然に見出すことができることを指すよう本明細書において用いられる。例えば、天然の単量体ドメインは、ヒト単量体ドメインまたは任意で、異なる種もしくは供給源、例えば、哺乳類、霊長類、齧歯類、魚類、鳥類、爬虫類、植物などに由来するドメインを含むことができる。天然の単量体ドメインはいくつかの方法により、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAのPCR増幅により得ることができる。本発明の実施に際して利用される単量体ドメインのライブラリーは、天然の単量体ドメイン、非天然の単量体ドメイン変異体、またはその組合せを含むことができる。
単量体ドメイン変異体は、先祖ドメイン、ランダムドメイン、キメラドメイン、突然変異ドメインなどを含むことができる。例えば、先祖ドメインは系統発生的解析に基づくことができる。ランダムドメインは、1つまたは複数の領域がランダム化されているドメインである。ランダム化は全体的なランダム化、または任意で、配列多様性の自然分布に基づく部分的なランダム化に基づくことができる。キメラドメインは、1つまたは複数の領域が、同一ファミリーのその他のドメイン由来の対応領域によって置換されているドメインである。例えば、キメラドメインは、同一ファミリーの複数の関連ドメイン由来のループ配列を組み合わせて、免疫原性が低下している可能性のある新たなドメインを形成させることによって構築することができる。ランダムなアミノ酸配列を作製することよりもむしろ、同一ファミリーの各種関連ドメイン由来のループ領域を組み合わせることによって改変された結合ドメイン単量体を構築することの免疫学的な利点を当業者は認識するであろう。例えば、ヒトNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインにおいて天然のループ配列または場合により複数のループ配列を組み合わせて変異体ドメインを構築することにより、得られたドメインは新たな結合特性を含みうるが、曝露されるループは全てヒト由来のものであるため、免疫原性のタンパク質配列を含まないはずである。内因性の関連においてループアミノ酸配列を組み合わせることは、本発明の単量体構築体の全てに適用することができる。
非天然単量体ドメインまたは改変単量体ドメインは、いくつかの方法により産生することができる。部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発(例えば、化学的突然変異誘発)などの、突然変異誘発の任意の方法を用いて、変異体を産生することができる。いくつかの態様において、エラーの生じやすいPCRが、変異体を作製するために利用される。さらなる方法は、天然の複数の単量体ドメイン中の保存アミノ酸を整列させることによって天然の複数の単量体ドメインを整列させる段階；ならびに、保存アミノ酸を維持すること、および保存アミノ酸周辺でアミノ酸を挿入、欠失、または変更させることで非天然の単量体ドメインをデザインして、非天然の単量体ドメインを作製する段階を含む。1つの態様において、保存アミノ酸はシステインを含む。別の態様において、挿入段階ではランダムなアミノ酸を使用するか、または任意で、挿入段階では天然の単量体ドメインの部分を使用する。この部分は理想的には、同一ファミリー由来のドメインのループをコードすることができる。アミノ酸は合成オリゴヌクレオチドを用いて、またはシャッフリングにより、または制限酵素に基づく組換えにより挿入されるかまたは交換される。本発明のヒトキメラドメインは、最小限の免疫原性が望ましい治療用途に有用である。本発明は、ヒトキメラドメインのライブラリーを作製する方法を提供する。
本発明の多量体または単量体ドメインは、当技術分野において公知の任意の方法によって産生することができる。いくつかの態様において、ポリペプチドを細菌プロモーターの転写制御下でコードするプラスミドを含む大腸菌が、タンパク質を発現させるために用いられる。集菌した後、それらを超音波処理、加熱、またはホモジナイゼーションにより溶解させ、遠心分離により清澄化させることができる。ポリペプチドはNi-NTAアガロースカラム(6×Hisタグが付いている場合)またはDEAEセファロース溶出(タグが付いていない場合)を用いて精製し、透析によって再び折り畳むことができる。誤って折り畳まれたタンパク質は、遊離スルフヒドリルをヨード酢酸でキャップすることによって無効化することができる。Qセファロース溶出、ブチルセファロース流入、SPセファロース溶出、DEAEセファロース溶出、および/またはCMセファロース溶出を用いて、ポリペプチドを精製することができる。等価な、陰イオンおよび/もしくは陽イオン交換または疎水性相互作用による精製段階が利用されてもよい。
いくつかの態様において、単量体または多量体は加熱溶解、典型的にはその後に急速冷却して大部分のタンパク質が復元するのを防ぐことによって精製される。本発明のタンパク質の熱安定性により、所望のタンパク質は加熱によって変性されないはずであり、それ故、高純度の精製段階(すなわち、混入タンパク質を取り除く精製)を可能にするはずである。いくつかの態様において、細菌細胞培養物から単量体または多量体を精製する連続フロー式加熱工程が使われる。例えば、細胞懸濁液は、細菌の溶解をもたらす温度に設定された水浴中に沈められたステンレス鋼コイルを通過させることができる(例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60分間、約55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、または100℃)。溶解された流出物は冷却浴を経由させて、急速冷却を達成し、変性された大腸菌タンパク質の復元を阻止する。大腸菌タンパク質は変性し、復元を阻止されるが、単量体または多量体は、その骨格の例外的な安定性により、これらの条件下で変性しない。加熱時間は、流速およびコイルの長さを調整することで制御される。この手法は代替的手法に比べて高収率かつ例外的に高純度(例えば、>60%、>65%、>70%、>75%、または>80%)で活性タンパク質をもたらし、臨床材料およびスクリーニングアッセイ(例えば、インビトロでの結合および阻害アッセイならびに細胞に基づく活性アッセイ)の材料を含む材料のハイスループット(例えば、96ウェルまたは384ウェル)産生および大規模(例えば、約100μl〜約1、2、5、10、15、20、50、75、100、500、または1000リットル)産生を受け入れやすい。
いくつかの態様において、本発明の単量体または多量体の製造後、ヨード酢酸を含有する溶液中でそのポリペプチドを処理して、ジスルフィド結合を形成していないシステインの遊離-SH部分をキャップする。いくつかの態様において、0.1〜100 mM (例えば、1〜10 mM)のヨード酢酸が溶液中に含まれる。
単量体ドメインをコードするポリヌクレオチド(核酸ともいう)は、典型的には、発現を介して単量体ドメインを作製するために使用される。単量体ドメインをコードする核酸は、種々の異なる供給源に由来することができる。単量体ドメインのライブラリーは、天然の単量体ドメイン、改変された単量体ドメイン(すなわち、単量体ドメイン変異体)、またはその組合せをコードする複数の異なる核酸を発現させることで調製することができる。
天然の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの断片をコードする核酸を同様に、混合させおよび/または組換えて(例えば、化学的または酵素的に産生された断片を使用することにより)、完全長の改変された単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを作製することができる。この断片および単量体ドメインは同様に、そのドメインまたは断片をコードする核酸の操作により組換えることができる。例えば、単量体ドメインの断片をコードする核酸構築体の連結を利用して、改変された単量体ドメインを作製することができる。
改変された単量体ドメインは同様に、ペプチド配列の保存配列、ランダム配列、擬似ランダム配列、または規定配列をコードする合成オリゴヌクレオチド(例えば、重複オリゴヌクレオチド)の一群を提供し、これらの配列をその後、単量体ドメインをコードするポリヌクレオチド中の所定部位にライゲーションによって挿入することにより作製することができる。同様に、1つまたは複数の単量体ドメインの配列多様性は、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異、擬似ランダム突然変異、規定のkernal突然変異、コドンに基づく突然変異などを用いて単量体ドメインを突然変異させることで拡張させることができる。得られた核酸分子は、クローニングおよび増幅に向けて宿主中で増やすことができる。いくつかの態様において、核酸は組換えられる。
本発明は同様に、単量体ドメインをコードする複数の核酸を組換え、および所望のリガンドまたはリガンド混合物などに結合する単量体ドメインについて得られたライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。選択された単量体ドメイン核酸は同様に、例えば、選択された配列と実質的に同一な野生型のまたは天然の配列と戻し交配することによるなど、中性の配列(すなわち、結合に及ぼす実質的な機能的効果を持たない配列)をコードするポリヌクレオチド配列と組換えることにより戻し交配されて、天然様の機能的単量体ドメインを産生することができる。一般的に、戻し交配の間、特性、例えば、リガンドに対する結合を保持するため、その後の選択が適用される。
いくつかの態様において、単量体ライブラリーは組換えによって調製される。このような場合、単量体ドメインを単離し、組換えて、単量体ドメインをコードする核酸配列をコンビナトリアル的に組換える(組換えは単量体ドメイン間もしくは単量体ドメイン内で、またはその両方で起こりうる)。第1の段階は、所望の特性、例えば、特定のリガンドに対する親和性を有する単量体ドメインの同定を含む。組換えの間に保存アミノ酸を維持しながら、単量体ドメインをコードする核酸配列は組換えられる、または組換えられ、多量体に連結されうる。
II. 多量体
多量体(組換えモザイクタンパク質またはコンビナトリアルモザイクタンパク質)を作製する方法は、本発明の特徴である。多量体は少なくとも2つの単量体ドメインを含む。例えば、本発明の多量体は2〜約10個の単量体ドメイン、2〜約8個の単量体ドメイン、約3〜約10個の単量体ドメイン、約7個の単量体ドメイン、約6個の単量体ドメイン、約5個の単量体ドメイン、または約4個の単量体ドメインを含みうる。いくつかの態様において、多量体は少なくとも3個の単量体ドメインを含む。単量体ドメインサイズの可能な範囲を考慮して、本発明の多量体は、例えば、100kD、90kD、80kD、70kD、60kD、50kD、40kD、30kD、25kD、20kD、15kD、10kD、5kDまたはそれよりも小さくまたはそれよりも大きくすることができる。典型的には、単量体ドメインは、関心対象の標的分子への結合についてあらかじめ選択されている。
いくつかの態様において、各単量体ドメインは、1つの標的分子に特異的に結合する。これらの態様のいくつかにおいて、各単量体は、標的分子上の異なる位置(エピトープに類似)に結合する。同じ標的分子に結合する複数の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは、各々の個々の単量体と比較して、標的分子に対する多量体の結合活性の改良をもたらす結合活性効果を引き起こす。いくつかの態様において、多量体は、単量体ドメイン単独の結合活性の少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍または100倍または1000倍の結合活性を有する。典型的には、多量体は約10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、または10-8未満のKdを有する。いくつかの態様において、多量体の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上(全てを含む)の単量体は、カルシウムまたは別のイオンなどのイオンを結合する。
別の態様において、多量体は、異なる標的分子に対する特異性を有する単量体ドメインを含む。例えば、このような多様な単量体ドメインの多量体は、ウイルス複製系の異なる成分またはウイルスの異なる血清型に特異的に結合しうる。いくつかの態様において、少なくとも1つの単量体ドメインは、毒素に結合し、少なくとも1つの単量体ドメインは細胞表面分子に結合し、それによって、毒素を標的化する機構として作用する。いくつかの態様において、多量体の少なくとも2つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは、標的の細胞または組織中の異なる標的分子に結合する。同様に、治療用の分子は、治療剤を、細胞または組織結合の特異性を有する他の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインもまた含む、多量体の単量体に結合させることによって、細胞または組織に標的化されうる。いくつかの態様において、異なる単量体はシグナル伝達経路、代謝経路の異なる成分、または同一の相加的もしくは相乗的な生理学的作用もしくは生物学的作用を及ぼす異なる代謝経路の成分に結合する。
多量体は種々の単量体ドメインの組合せを含みうる。例えば、単一の多量体において、選択された単量体ドメインは同様でもまたは全く同一であってもよく、任意で、異なってもまたは非同一であってもよい。さらに、選択された単量体ドメインは、同じ単量体ドメインファミリー由来の種々の異なる単量体ドメイン、または異なるドメインファミリー由来の種々の単量体ドメイン、あるいは任意で、その両方の組合せを含みうる。
本発明の実施に際して作製される多量体は、以下のいずれかでありうる：
(1) ホモ多量体(同じドメインの多量体、すなわち、A1-A1-A1-A1)；
(2) 同じドメインクラスの異なるドメインのヘテロ多量体、例えば、A1-A2-A3-A4。例えば、ヘテロ多量体には、A1、A2、A3およびA4が特定のNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの非天然の異なる変異体である多量体、またはA1、A2、A3、およびA4のいくつかがNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの天然の変異体である多量体が含まれる。
(3) 異なる単量体ドメインクラス、例えば、A1-B2-A2-B1由来のドメインのヘテロ多量体。例えば、A1およびA2がNotch由来の2つの異なる単量体ドメイン(天然または非天然のいずれか)であり、ならびにB1およびB2がAnato由来の2つの異なる単量体ドメイン(天然または非天然のいずれか)である場合。
本発明の実施に際して利用される多量体ライブラリーは、ホモ多量体、同じ単量体クラスの異なる単量体ドメイン(天然または非天然)のヘテロ多量体、もしくは異なる単量体クラス由来の単量体ドメイン(天然または非天然)のヘテロ多量体、またはそれらの組合せを含むことができる。その他の例示的な多量体は、例えば、三量体およびより高次の多量体(例えば、四量体)を含む。
本明細書において記述される、単量体ドメインは同様に、免疫ドメイン含有ヘテロ多量体(すなわち、少なくとも1つの免疫ドメイン変異体および1つの単量体ドメイン変異体を有する多量体)中で容易に利用される。従って、本発明の多量体は、ミニボディー、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片(ScFv)、またはFab断片などの少なくとも1つの免疫ドメイン；ならびに、例えば、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、Ca-EGF単量体ドメイン、またはこれらの変異体などの、少なくとも1つの単量体ドメインを有することができる。
ドメインが連結されて多量体を形成する前にドメインが選択される必要はない。一方、多量体に連結される前に、ドメインを標的分子に結合する能力について選択することができる。従って、例えば、多量体は、1つの標的分子に結合する2つのドメインおよび第2の標的分子に結合する第3のドメインを含むことができる。
典型的には、本発明の多量体は単一の不連続のポリペプチドである。部分的リンカー-ドメイン-部分的リンカー部分の多量体は、複数のポリペプチドのつながりであって、それぞれが部分的リンカー-ドメイン-部分的リンカー部分に相当する。
従って、本発明の多量体は以下の特質を有しうる：多価、多特異性、一本鎖、熱安定性、血中および/または貯蔵半減期の延長。さらに、単量体ドメインの少なくとも1つ、複数もしくは全てがイオン(例えば、金属イオンもしくはカルシウムイオン)を結合してもよく、少なくとも1つ、複数もしくは全ての単量体ドメインがNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインに由来してもよく、単量体ドメインの少なくとも1つ、複数もしくは全てが天然に存在しなくてもよく、および/または単量体ドメインの少なくとも1つ、複数もしくは全てが単量体ドメイン当たり1、2、3、もしくは4つのジスルフィド結合を含んでもよい。いくつかの態様において、多量体は、少なくとも1つの単量体ドメインが非天然の単量体ドメインでありかつ単量体ドメインがカルシウムを結合する少なくとも2つ(または少なくとも3つ)の単量体ドメインを含む。いくつかの態様において、多量体は少なくとも4つの単量体ドメインを含み、ここで少なくとも1つの単量体ドメインが天然に存在せず、およびここで：
a. 各単量体ドメインが30〜100アミノ酸でありかつ単量体ドメインのそれぞれが少なくとも1つのジスルフィド結合を含み；または
b. 各単量体ドメインが30〜100アミノ酸でありかつ細胞外タンパク質に由来し；または
c. 各単量体ドメインが30〜100アミノ酸でありかつタンパク質標的に結合する。
いくつかの態様において、多量体は少なくとも4つの単量体ドメインを含み、ここで少なくとも1つの単量体ドメインが天然に存在せず、およびここで、
a. 各単量体ドメインが35〜100アミノ酸であり；または
b. 各ドメインが少なくとも1つのジスルフィド結合を含みかつヒトタンパク質および/もしくは細胞外タンパク質に由来する。
いくつかの態様において、多量体は少なくとも2つの単量体ドメインを含み、ここで少なくとも1つの単量体ドメインが天然に存在せず、およびここで各ドメインが以下である：
a. 25〜50アミノ酸長かつ少なくとも1つのジスルフィド結合を含む；または
b. 25〜50アミノ酸長かつ細胞外タンパク質に由来する；または
c. 25〜50アミノ酸かつタンパク質標的に結合する；または
d. 35〜50アミノ酸長である。
いくつかの態様において、多量体は少なくとも2つの単量体ドメインを含み、ここで少なくとも1つの単量体ドメインが天然に存在せずおよび、
a. 各単量体ドメインが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む；または
b. 少なくとも1つの単量体ドメインが細胞外タンパク質に由来する；または
c. 少なくとも1つの単量体ドメインが標的タンパク質に結合する。
いくつかの態様において、本発明の多量体は同じまたはその他の多量体に結合して、凝集体を生ずる。凝集は、例えば、2つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン上の疎水性ドメインの存在によって媒介され、2つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメイン間の非共有性相互作用の形成を引き起こすことができる。または、凝集は、別の多量体中の単量体ドメインに対する結合特異性を有する多量体中の1つまたは複数の単量体ドメインによって促進されうる。凝集体は同様に、単量体ドメインまたは多量体上の親和性ペプチドの存在により生ずることができる。凝集体は単一の多量体よりも多くの標的分子結合ドメインを含むことができる。
細胞表面の標的と第2の標的の両方に対する親和性を有する多量体は、いっそう高い結合活性効果を供与することができる。場合によっては、膜流動性は、相互作用の間隔および結合価を最適化する(自己アッセンブリにより)うえでタンパク質リンカーよりも柔軟でありうる。場合によっては、多量体は、それぞれが異なる細胞上のまたは一方が細胞上でもう一方が複数の結合部位を有する分子上の2つの異なる標的に結合しうる。
III. リンカー
選択された単量体ドメインはリンカーにより連結されて単鎖の多量体を形成しうる。例えば、リンカーは、多量体中の各々の分離した個別の単量体ドメインの間に位置する。典型的には、免疫ドメインもまた、リンカー部分を介して互いに、または単量体ドメインに連結される。免疫ドメイン変異体を一緒に連結するために容易に使用されうるリンカー部分は、単量体ドメイン変異体の多量体について記述されたものと同じである。免疫ドメイン変異体を他のドメインに連結して多量体にするのに適した例示的なリンカー部分は、本明細書において記述されている。
選択された単量体ドメインをリンカーを介して連結することは、当技術分野において公知の種々の技術を使用して達成されうる。例えば、選択された単量体ドメインをコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルアッセンブリは、制限消化と再ライゲーションにより、PCRに基づく、自己プライミング重複反応により、またはその他の組換え法により達成されうる。リンカーは、単量体が標的の多量体に結合するその能力について同定される前に、または単量体が標的の多量体に結合する能力について選択された後で、単量体に結合されうる。
リンカーは、天然のものであるか、合成によるか、またはその両方の組合せでありうる。例えば、合成リンカーは、ランダムリンカー(例えば、配列およびサイズの両方において)でありうる。1つの局面において、ランダムリンカーは、十分にランダム化された配列を含みうるか、または任意で、ランダムリンカーは、天然のリンカー配列に基づきうる。リンカーは、例えば、ポリペプチドでない部分、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどを含みうる。
リンカーは、剛性であるか、または代替的には、柔軟であるか、またはその両方の組合せでありうる。リンカーの柔軟性は、リンカーと、リンカーが相互作用する単量体の両方の組成物の機能でありうる。リンカーは、2つの選択した単量体ドメインを連結し、単量体ドメインを分離した個別の単量体ドメインとして維持する。リンカーは、分離した個別の単量体ドメインが協働し、なお分離した特性、例えば、同じリガンドについての多量体中の複数の結合部位、または、例えば、異なるリガンドについての多量体中の複数の分離した結合部位を維持することを可能にしうる。場合によっては、ジスルフィド架橋が2つの連結単量体ドメイン間にまたはリンカーと単量体ドメインの間に存在する。いくつかの態様において、単量体ドメインおよび/またはリンカーは金属結合中心を含む。
2つまたはそれ以上の単量体ドメイン(すなわち、ポリペプチド鎖)が連結される、特定の場合に適したリンカーの選択は、例えば、単量体ドメインの性質、ポリペプチド多量体が結合すべき標的の構造および性質ならびに/またはタンパク質分解および酸化に対するペプチドリンカーの安定性を含む、種々のパラメータに依存しうる。
本発明は、所望の単量体ドメイン/変異体が同定されたら、リンカーの選択を最適化する方法を提供する。一般的に、単量体ドメインの組成に関して固定されているが、リンカーの組成および長さが変動しうる組成を有する多量体のライブラリーは、上記のように、容易に調製され、スクリーニングされうる。
典型的には、リンカーポリペプチドは、Gly、Ser、AlaおよびThrから選択されるアミノ酸残基を主に含みうる。例えば、ペプチドリンカーは、Gly、Ser、AlaおよびThrから選択されるアミノ酸残基の少なくとも80%、例えば少なくとも85%または少なくとも90%など、少なくとも75% (ペプチドリンカー中に存在する残基の総数に基づいて計算される)を含みうる。ペプチドリンカーは同様に、Gly、Ser、Alaおよび/またはThr残基のみからなりうる。リンカーポリペプチドは、2つの単量体ドメインが、互いに関して正確な高次構造を呈し、その結果それらが、例えば、所与の受容体のアンタゴニストとしての所望の活性を保持するようにして、2つの単量体ドメインを連結するに十分な長さを有するべきである。
この目的に適した長さは、少なくとも1アミノ酸残基、および典型的には約50アミノ酸残基よりも少ない長さ(例えば、2〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基、8〜12アミノ酸残基、または11アミノ酸残基)の長さである。同様に、リンカーをコードするポリペプチドはサイズが、例えば、約2〜約15アミノ酸、約3〜15アミノ酸、約4〜12アミノ酸、約10アミノ酸、約8アミノ酸、または約6アミノ酸の範囲でありうる。核酸(例えば、DNA、RNA、または両方の組合せ)を含有する方法および組成物において、リンカー配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、約6ヌクレオチド〜約45ヌクレオチドの間、約9ヌクレオチド〜約45ヌクレオチドの間、約12ヌクレオチド〜約36ヌクレオチドの間、約30ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、または約18ヌクレオチドでありうる。同様に、リンカーポリペプチドに含めるために選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチド多量体の活性または機能を有意に妨害しない特性を示すべきである。従って、ペプチドリンカーは、全体では電荷を示さないのが当然であり、それは、ポリペプチド多量体の活性または機能と矛盾するか、または内在性の折り畳みを妨害するか、または、問題の標的に対するポリペプチド多量体の結合を深刻に妨害する、1つもしくは複数の単量体ドメイン中のアミノ酸残基と結合または他の相互作用を形成する。
本発明の別の態様において、ペプチドリンカーはライブラリーから選択され、ここでは、ペプチドリンカー中のアミノ酸残基は、特定のポリペプチド多量体中の単量体ドメインの特定のセットのためにランダム化される。柔軟性のあるリンカーを用いて、単量体ドメインの適切な組合せを見出し、これを可変性のリンカーのこのランダムライブラリーにより最適化して、最適な長さおよび形状を有するリンカーを得ることができよう。最適なリンカーは、標的への結合に関与し、かつ、標的に結合しない場合のポリペプチド多量体中での互いに対する単量体ドメインの動きを制限する、最小の数の正しい型のアミノ酸残基を含みうる。
ポリペプチドを新規な連結融合ポリペプチドにつなげる天然のおよび人工のペプチドリンカーの使用は、文献において周知である(Hallewell et al., (1989), J.Biol.Chem. 264, 5260-5268；Alfthan et al., (1995) Protein Eng. 8, 725-731；Robinson and Sauer (1996)、Biochemistry 35, 109-116；Khandekar (1997), J.Biol.Chem. 272, 32190-32197；Fares et al., (1998), Endocrinology 139, 2459-2464；Smallshaw et al., (1999), Protein Eng. 12, 623-630；米国特許第5,856,456号)。
ペプチドリンカーの使用が広範囲に及んでいる1つの例は、軽鎖(VL)および重鎖(VH)の可変領域が人工のリンカーを介して連結されている単鎖抗体の産生についてであり、この特定の分野において膨大な刊行物が存在する。広範に使用されるペプチドリンカーは、Gly-Gly-Gly-Gly-Serアミノ酸配列の3反復((Gly4Ser)3)からなる15merである。他のリンカーは使用されてきており、ファージディスプレイ技術、ならびに選択的感染性ファージ技術が適切なリンカー配列を多様化および選択するために使用されてきた(Tang et al., (1996), J.Biol.Chem. 271, 15682-15686；Hennecke et al., (1998), Protein Eng. 11, 405-410)。ペプチドリンカーは、ヘテロ二量体タンパク質およびホモ二量体タンパク質、例えば、T細胞受容体、λCroリプレッサー、P22ファージArcリプレッサー、IL-12、TSH、FSH、IL-5、およびインターフェロン-γ中の個々の鎖を接続するために使用されてきた。ペプチドリンカーはまた、融合ポリペプチドを作製するために使用されてきた。種々のリンカーが使用されてきており、Arcリプレッサーファージディスプレイの場合には、単鎖タンパク質の安定性の増加のために、ファージディスプレイがリンカーの長さおよび組成を最適化するために使用されてきた(Robinson and Sauer (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5929-5934)。
別のタイプのリンカーはインテイン、すなわち、単鎖ポリペプチドとともに発現されるが、タンパク質スプライシングによって翻訳後に除去されるペプチドストレッチである。インテインの使用は、F.S.Gimble, Chemistry and Biology, 1998, 第5巻、第10号、251〜256頁によって概説されている。
適切なリンカーを得るためのさらに別の方法は、単純なリンカー、例えば、(Gly4Ser)nを、ランダム突然変異誘発を通して最適化することによる。
上記のように、ペプチドリンカーは、少なくともある程度の柔軟性を有することが一般的に好ましい。従って、いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、1〜25のグリシン残基、5〜20のグリシン残基、5〜15のグリシン残基、または8〜12のグリシン残基を含む。ペプチドリンカーは、典型的には、少なくとも50%のグリシン残基、例えば、少なくとも75%のグリシン残基を含む。本発明のいくつかの態様において、ペプチドリンカーはグリシン残基のみを含む。
ペプチドリンカーはグリシン残基に加えて、その他の残基、特にSer、AlaおよびThrから選択される残基、特にSerを含む。従って、特定のペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyzを有するペプチドリンカーが含まれ、ここで各Xaaは、独立して、
Figure 2008520207
からなる群より選択され、かつx、yおよびzは、各々、1〜5の範囲の整数である。いくつかの態様において、各Xaaは、独立して、Ser、AlaおよびThr、特にSerからなる群より選択される。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Glyを有し、ここでXaaは、独立して、
Figure 2008520207
からなる群より選択される。いくつかの態様において、各Xaaは、独立して、Ser、AlaおよびThr、特にSerからなる群より選択される。
場合によっては、ペプチドリンカーにある程度の強固さを提供することが望ましいまたは必要であるかもしれない。このことは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列にプロリン残基を含有させることによって達成されうる。従って、本発明の別の態様において、ペプチドリンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも1つのプロリン残基を含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列の少なくとも25%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも75%がプロリン残基である、アミノ酸配列を有する。本発明の1つの特定の態様において、ペプチドリンカーはプロリン残基のみを含む。
本発明のいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基が導入されるような様式で修飾される。このようなアミノ酸残基の例は、システイン残基(これに非ポリペプチド部分が引き続いて結合する)でありうるか、またはアミノ酸配列は、インビボでのN-グリコシル化部位(それによって糖部分を(インビボで)ペプチドリンカーに結合する)を含みうる。さらなる選択肢は、進化tRNAおよびtRNA合成酵素(例えば、米国特許出願第2003/0082575号を参照のこと)を用いて、単量体ドメインまたはリンカーの中に非天然アミノ酸を遺伝子操作により組み入れることである。例えば、ケト-チロシンの挿入は、発現された単量体ドメインまたは多量体との部位特異的なカップリングを可能にする。
本発明のいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのシステイン残基、例えば、1つのシステイン残基を含む。従って、本発明のいくつかの態様において、ペプチドリンカーは、Gly、Ser、Ala、ThrおよびCysからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、このようなペプチドリンカーは、1つのシステイン残基のみを含む。
さらなる態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびシステイン残基、例えば、グリシン残基およびシステイン残基のみを含む。典型的には、ペプチドリンカー当たり1つのみのシステイン残基が含まれる。従って、システイン残基を含む特定のペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Glyn-Cys-Glymを有するペプチドリンカーが含まれ、ここでnおよびmは、それぞれ、1〜12、例えば、3〜9、4〜8、または4〜7の整数である。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGGGG-C-GGGGGを有しうる。
この手法(すなわち、非ペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の導入)は同様に、より強固なプロリン含有リンカーのために使用されうる。従って、ペプチドリンカーは、プロリンおよびシステイン残基、例えば、プロリン残基およびシステイン残基のみを含みうる。システイン残基を含む特定のプロリン含有ペプチドリンカーの1つの例には、アミノ酸配列Pron-Cys-Promを有するペプチドリンカーが含まれ、ここでnおよびmはそれぞれ1〜12、好ましくは3〜9、例えば、4〜8または4〜7の整数である。より詳細には、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列PPPPP-C-PPPPPを有しうる。
いくつかの態様において、非ポリペプチド部分のための結合基を含む、システイン残基などの、アミノ酸残基の導入の目的は、その残基に、引き続いて非ポリペプチド部分を結合させることである。例えば、非ポリペプチド部分は、ポリペプチド多量体の血清中半減期を改善しうる。従って、システイン残基は、非ポリペプチド部分に共有結合的に結合されうる。非ポリペプチド部分の好ましい例としてはPEGまたはmPEG、特にmPEGなどのポリマー分子、ならびに非ポリペプチド治療剤が挙げられる。
当業者は、システイン以外のアミノ酸残基が、非ポリペプチド部分をペプチドリンカーに結合させるために使用されうることを認識するであろう。このような他の残基の1つの特定の例には、非ポリペプチド部分をリジン残基に結合させることが含まれる。
ペプチドリンカー中の非ペプチド部分に部位特異的結合基を導入することの別の可能性は、ペプチドリンカー中に、インビボのN-グリコシル化部位、例えば、1つのインビボのN-グリコシル化部位を導入することである。例えば、1つのインビボのN-グリコシル化部位は、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を含むペプチドリンカーに導入されうる。糖部分が実際にそのインビボのN-グリコシル化部位に結合されることを保証するために、ポリペプチド多量体をコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化を行う真核生物発現宿主に挿入されなければならないことが理解されよう。
インビボのN-グリコシル化部位を含むペプチドリンカーの特定の例は、アミノ酸配列Glyn-Asn-Xaa-Ser/Thr-Glym、好ましくはGlyn-Asn-Xaa-Thr-Glymを有するペプチドリンカーであり、ここでXaaはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、かつnおよびmは、それぞれ、1〜8の範囲、好ましくは2〜5の範囲の整数である。
しばしば、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一である。それにもかかわらず、特定の態様においては、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なりうる。後者は、ポリペプチド多量体がポリペプチドの三量体また四量体である場合、特に、非ペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基がペプチドリンカーに含まれる場合に、特に関連性があると考えられている。
多くの場合、所望の効果(例えば、血清中半減期の延長)を達成するために、ポリペプチド多量体に、ほんのわずかの、典型的には1つのみの、非ペプチド部分(例えば、mPEG、糖部分または非ポリペプチド治療剤)を結合させることが所望されるかまたは必要である。明白なことに、2つのポリペプチドリンカーを含むポリペプチド三量体の場合には、1つのみのペプチドリンカーが、典型的には、例えば、システイン残基の導入によって修飾される必要があるが、一方、他のペプチドリンカーの修飾は、典型的には必要でない。この場合、ポリペプチド多量体(三量体)のすべての(両方の)ペプチドリンカーは異なる。
従って、本発明のさらなる態様において、ポリペプチド多量体中に存在するすべてのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、1つ、2つ、または3つのペプチドリンカーを除いて、例えば、1つまたは2つのペプチドリンカーを除いて、特に1つのペプチドリンカーを除いて同一である。このペプチドリンカーは、非ペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。このようなアミノ酸残基の好ましい例には、インビボのN-グリコシル化部位のシステイン残基が含まれる。
リンカーは天然または合成のリンカー配列でありうる。例示的な天然のリンカーには、例えば、第1のNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの最後のシステインと第2のNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインの最初のシステインとの間の配列が含まれ、この配列はリンカー配列として使用されうる。種々のドメイン連結の解析は、天然のリンカーが、少なくとも3アミノ酸〜20アミノ酸より少ない範囲、例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18アミノ酸長にわたることを示す。しかしながら、当業者は、より長いまたはより短いリンカー配列が使用されうることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、リンカーは以下の配列A1A2A3A4A5A6の6merであり、ここで、A1はアミノ酸A、P、T、Q、EおよびKから選択され；A2およびA3は、C、F、Y、W、またはM以外の任意のアミノ酸であり；A4はアミノ酸S、GおよびRから選択され；A5はアミノ酸H、P、およびRから選択され；かつA6はアミノ酸Tである。
単量体ドメインおよび/または免疫ドメインから多量体を作製する方法は、選択されたドメインを少なくとも1つのリンカーと連結して、少なくとも1つの多量体を作製する段階を包含しうる。例えば、多量体は少なくとも2つの単量体ドメインおよび/または免疫ドメインならびにリンカーを含みうる。次いで、多量体は、選択された単量体ドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する、改善された結合活性もしくは親和性または改変された特異性についてスクリーニングされる。この方法によって産生された多量体の組成は、本発明に含まれる。
他の方法において、選択された多量体ドメインを少なくとも1つのリンカーと連結して、選択された単量体ドメインの2つまたはそれ以上とリンカーとを含む少なくとも2つの多量体を作製する。2つまたはそれ以上の多量体は、選択された単量体ドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する、改善された結合活性もしくは親和性または改変された特異性についてスクリーニングされる。上記の方法によって産生された2つまたはそれ以上の多量体の組成も本発明の特徴である。
上記および下記の方法により産生されたリンカー、多量体または選択の多量体は、本発明の特徴である。多量体を含有するライブラリー、例えば、本発明の方法によって産生されたまたは本発明の方法によって選択された約100、250、500またはそれ以上のメンバーを含むライブラリーが提供される。いくつかの態様において、ライブラリーのメンバーを含む1つまたは複数の細胞も含まれる。組換えポリペプチドのライブラリー、例えば、約100、250、500またはそれ以上の異なる組換えポリペプチドを含むライブラリーも本発明の特徴である。
本発明の実施に際して利用される適当なリンカーは、部分的リンカー部分の絶対(obligate)ヘテロ二量体を含む。「絶対ヘテロ二量体」(「親和性ペプチド」ともいわれる)という用語は本明細書において、組成が互いとは異なり、かつ非共有結合的な、特異的様式で互いに結合し、2つのドメインを一緒に連結する2つの部分的リンカー部分の二量体をいう。特異的結合とは、他の部分的リンカーとの結合と比較して、2つの部分的リンカーが実質的に互いに結合するようなものである。従って、単一ポリペプチドとして発現される本発明の多量体とは対照的に、ヘテロ二量体を介して一緒に連結されるドメインの多量体は、個別の、部分的リンカー-単量体-部分的リンカー単位から構築される。ヘテロ二量体のアッセンブリは、例えば、混合によって達成されうる。従って、部分的リンカーがポリペプチドセグメントである場合、各部分的リンカー-単量体-部分的リンカー単位は、多量体アッセンブリの前に個別のペプチドとして発現されうる。ジスルフィド結合は、正確な非共有結合的な対形成の後にペプチドを一緒に共有結合的にロックするために加えられうる。絶対ヘテロ二量体を形成するのに適した部分的リンカー部分には、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが含まれる。例えば、部分的リンカーがポリペプチドである場合、結合ドメインは、独立して、それらの独特な連結ペプチド(すなわち、部分的リンカー)と共に産生され、後に組み合わされて多量体を生じる。例えば、Madden, M., Aldwin, L., Gallop, M. A., and Stemmer, W. P. C. (1993) Peptide linkers：Unique self-associative high-affinity peptide linkers. Thirteenth American Peptide Symposium, Edmonton, Canada (abstract)を参照されたい。従って、多量体中の結合ドメインの空間的順序は、各部分的リンカーのヘテロ二量体性の結合特異性に委ねられている。部分的リンカーは、所定の異種アミノ酸配列に特異的に結合する末端のアミノ酸配列を含みうる。このようなアミノ酸配列の例は、Bodenmuller et al., The neuropeptide head activator loses its biological activity by dimerization, (1986) EMBO J 5(8)：1825-1829に記載されているような、Hydraニューロペプチドヘッドアクチベーターである。例えば、米国特許第5,491,074号および国際公開公報第94/28173号を参照されたい。これらの部分的リンカーは、多量体が最初に単量体-部分的リンカー単位または部分的リンカー-単量体-部分的リンカー単位として産生されることを可能にする。次いで、これらは、一緒に混合され、各部分的リンカーの結合特異性に基づいて理想的な順番に構築することを可能にされる。または、部分的リンカーに連結された単量体を細胞などの、表面に接触させてもよく、この場合には、複数の単量体が結合して、部分的リンカーを介してより結合活性の高い複合体を生じうる。場合によっては、結合はランダムなブラウン運動を介して生じうる。
部分的リンカーがDNA結合モチーフを含む場合、各単量体ドメインは、独特なDNA結合特異性を排他的に有するDNA結合タンパク質を含む、上流および下流の部分的リンカーを有する(すなわち、Lp-ドメイン-Lp、ここで「Lp」は部分的リンカーの表示である)。これらのドメインは、個々に産生されてもよく、次いで、所望の順番でドメインを連結するために、これらのドメインを、適切なヌクレオチド配列(すなわち、2つの所望のドメインの部分的リンカーのDNA結合タンパク質についての特異的認識部位)を含むDNA断片と混合することによって特定の多量体に構築されうる。さらに、同じドメインは、DNA結合タンパク質認識部位の種々の組合せを含むDNA配列を加えることによって多くの異なる多量体に構築されうる。DNA断片におけるDNA結合タンパク質認識部位の組合せのさらなるランダム化は、多量体のライブラリーのアッセンブリを可能にしうる。このDNAは、インビボでの分解を妨害するために基本骨格の類似体とともに合成されうる。
いくつかの態様において、多量体は、異なるタンパク質に特異性を有する単量体ドメインを含む。異なるタンパク質は、関連性があるかまたは関連性がないものでありうる。関連性があるタンパク質の例には、タンパク質ファミリーまたはウイルスの異なる血清型のメンバーが含まれる。または、多量体の単量体ドメインは、生理学的経路中の異なる分子(例えば、異なる血液凝固タンパク質)を標的化しうる。なお他の態様において、単量体ドメインは、関連性のない経路のタンパク質に結合する(例えば、2つのドメインが血液因子に結合し、2つの他のドメインが炎症関連のタンパク質に結合し、第5のドメインが血清アルブミンに結合する)。別の態様において、多量体は、異なる病原菌または関心対象の汚染菌に結合する単量体ドメインで構成される。そのような多量体は、いくつかの病原菌または汚染菌のいずれかの可能性を検出できる単一の検出剤として有用である。
IV. 所望の結合親和性を有する単量体ドメインおよび/または多量体を同定する方法
本発明は、選択されるまたは所望とされるリガンドまたはリガンド混合物に結合する単量体ドメインを同定する方法を提供する。いくつかの態様において、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは所望の特性(例えば、結合親和性)について同定または選択され、その後、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは多量体に形成される。それらの態様の場合、所望の特性(例えば、特異的な結合特性)を有するドメインの選択をもたらす任意の方法を使用することができる。例えば、その方法は、それぞれの核酸が単量体ドメインをコードする複数の異なる核酸を提供する段階；複数の異なる核酸を翻訳し、それによって複数の異なる単量体ドメインを提供する段階；複数の異なる単量体ドメインを所望のリガンドまたはリガンド混合物の結合についてスクリーニングする段階；および、所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する複数の異なる単量体ドメインのメンバーを同定する段階を含むことができる。
ドメインのライブラリーからの単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの選択は、種々の手順によって達成されうる。例えば、所望の特性を有する単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを同定する1つの方法は、それぞれの核酸が単量体ドメインおよび/または免疫ドメインをコードする複数の核酸を翻訳する段階、複数の核酸によってコードされるポリペプチドをスクリーニングする段階、ならびに、例えば、所望のリガンドまたはリガンド混合物に結合する単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを同定し、それによって選択の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを産生する段階を含む。それぞれの核酸によって発現される単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは、当技術分野において公知の方法(すなわち、パニング、アフィニティークロマトグラフィー、FACS解析)によって、リガンドに結合するそれらの能力について試験されうる。
上記のように、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの選択は、標的タンパク質または他の標的分子(例えば、脂質、糖質、核酸など)のようなリガンドへの結合に基づきうる。他の分子は任意で、標的、例えば、Ca2＋のようなイオンとともに方法に含まれてもよい。リガンドは、公知のリガンド、例えば、複数の単量体ドメインの1つに結合することが知られているリガンドであってもよく、または例えば、所望のリガンドは、未知の単量体ドメインリガンドであってもよい。単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの他の選択は、例えば、標的タンパク質の特定の機能または活性の阻害または増強に基づきうる。標的タンパク質の活性には、例えば、エンドサイトーシスもしくは内部移行、第2メッセンジャー系の誘導、遺伝子の上方制御もしくは下方制御、細胞外マトリックスへの結合、分子の放出、または高次構造の変化が含まれうる。この場合、リガンドは公知である必要はない。選択は同様に、ハイスループットアッセイの使用を含みうる。
単量体ドメインおよび/または免疫ドメインがリガンドに結合するその能力に基づいて選択される場合、その選択の根拠には、通常、高い親和性が予測される、遅い解離速度に基づく選択が含まれうる。リガンドの結合価はまた、選択された単量体ドメインおよび/または免疫ドメインの平均結合親和性を制御するために変動されうる。リガンドは、例えば、競合物質化合物を含めることによって、希釈によって、または当業者に公知の他の方法によって、変動させた濃度で表面または基質に結合されうる。高濃度(結合価)の所定のリガンドは、比較的低い親和性を有する単量体ドメインを富化するために使用されうる一方で、低濃度(結合価)は、より高い親和性の単量体ドメインを優先的に富化しうる。
種々のレポーティングディスプレイのベクターまたは系は、本発明の単量体ドメイン、免疫ドメイン、および/または多量体をコードする核酸を発現するため、および所望の活性について試験するために使用されうる。例えば、ファージディスプレイ系は、単量体ドメインがファージ表面に融合タンパク質として発現される系である(Pharmacia, Milwaukee Wis.)。ファージディスプレイは、単量体ドメインおよび/または免疫ドメインをコードするポリペプチド配列の、繊維状バクテリオファージの表面上での提示を、典型的には、バクテリオファージの外殻タンパク質との融合物として含みうる。
一般的に、これらの方法において、各々のファージ粒子または細胞は、天然のファージまたは細胞のタンパク質配列に加えて、ディスプレイされたポリペプチドの単一の種をディスプレイする個々のライブラリーメンバーとして機能する。複数の核酸が、融合タンパク質の転写を生じる部位でファージDNAにクローニングされ、融合タンパク質の一部が複数の核酸によってコードされる。核酸分子を含むファージは、細胞中で複製および転写を受ける。融合タンパク質のリーダー配列は、ファージ粒子の先端への融合タンパク質の輸送を方向付ける。従って、この核酸によって部分的にコードされる融合タンパク質は、上記または下記に記載した方法による検出および選択のために、ファージ粒子上でディスプレイされる。例えば、ファージライブラリーを、所定の(所望の)リガンドとインキュベートすることができ、その結果、リガンドに結合する融合タンパク質配列を提供するファージ粒子は、所定のリガンドに結合するポリペプチド配列を提供しないファージ粒子から、差次的に分配される。例えば、この分離は、所定のリガンドを固定化することによって提供されうる。次いで、固定化されたリガンドに結合するファージ粒子(すなわち、ライブラリーメンバー)は回収され、親和性富化およびファージ複製の引き続くラウンドのために、選択されたファージの亜集団を増幅するために複製される。親和性富化およびファージ複製の数回のラウンドの後で、このように選択されたファージライブラリーメンバーは単離され、ディスプレイされたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が決定され、それによって、所定のリガンドに結合するポリペプチドの配列を同定する。このような方法は、PCT公開公報第91/17271号、第91/18980号、第91/19818号、および第93/08278号にさらに記載されている。
他のディスプレイ系の例としては、リボソームディスプレイ、ヌクレオチド結合ディスプレイ(例えば、米国特許第6,281,344号；同第6,194,550号、同第6,207,446号、同第6,214,553号、および同第6,258,558号を参照されたい)、ポリソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが挙げられる。細胞表面ディスプレイは種々の細胞、例えば、大腸菌細胞、酵母細胞および/または哺乳動物細胞を含む。細胞がディスプレイとして使用される場合、例えば、PCR増幅、続いて消化によって得られた核酸が細胞に導入され翻訳される。任意で、本発明の単量体ドメインまたは多量体をコードするポリペプチドが、例えば、細胞への注入によって導入されてもよい。
変異を作製する段階および所望の特性についてスクリーニングする段階を繰り返して(すなわち、再帰的に行って)、結果を最適化できることを当業者は認識するであろう。例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはその他の同様の形式において、ライブラリーの第1スクリーニングを比較的低いストリンジェンシーで行い、それによって標的分子と結合する可能な限り多くの粒子を選択することができる。次いで、選択された粒子を単離することができ、単量体または多量体をコードするポリヌクレオチドを粒子から単離することができる。その後、さらなる変異をこれらの配列から作製し、続けてさらに高い親和性でスクリーニングすることができる。
単量体ドメインは、タンパク質標的を含め、任意のタイプの標的分子を結合するよう選択することができる。例示的な標的としては、例えば、IL-6、Alpha3、cMet、ICOS、IgE、IL-1-R11、BAFF、CD40L、CD28、Her2、TRAIL-R、VEGF、TPO-R、TNFα、LFA-1、TACI、IL-1b、B7.1、B7.2、またはOX40が挙げられるが、これらに限定されることはない。標的がリガンドに対する受容体である場合、単量体ドメインは受容体のアンタゴニストまたはアゴニストとしての役割を果たすことができる。
比較的大きな標的を結合できる多量体が望まれる場合、それらは「ウォーキング」選択法によって作製することができる。図3に示されるように、この方法は、単量体ドメインのライブラリーを提供する段階および第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階によって行われる。標的に結合する少なくとも1つの単量体が同定されたら、その特定の単量体を新たなライブラリーまたは単量体ドメインのオリジナルライブラリーの各残存メンバーに共有結合的に連結させる。この新たなライブラリーメンバーはそれぞれ、1つの共通ドメインと、異なる、すなわちランダム化されている少なくとも1つのドメインとを含む。このように、いくつかの態様において、本発明は、「ウォーキング」選択法を用いて作製される多量体のライブラリーを提供する。この新たな多量体(例えば、二量体、三量体、四量体などの)ライブラリーを次いで、いっそう高い親和性で標的に結合する多量体についてスクリーニングし、いっそう高い親和性で標的に結合する多量体を同定することができる。「ウォーキング」単量体選択法は、リンカー長の制限を前提として互いと相加的にまたは場合により相乗的に作用できる単量体で構成される多量体をアッセンブルする方法を提供する。このウォーキング技術は、高親和性で大きな標的タンパク質を結合できる多量体を選択し、アッセンブルする場合に非常に有用である。ウォーキング法を繰り返して、より多くの単量体を付加し、それによって一緒に連結された2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つまたはそれ以上の単量体を含む多量体をもたらすことができる。
いくつかの態様において、選択された多量体は3つ以上のドメインを含む。そのような多量体は段階的に作製することが可能であり、例えば、この場合には各新たなドメインの付加は個別的に試験され、ドメインの効果は逐次的に試験される。代替的な態様において、ドメインを連結させて3つ以上のドメインを含む多量体を形成させ、これを、どのより小さな多量体が、またはどの各ドメインが結合するかという予備的知識なしに結合について選択する。
本発明の方法は同様に、単量体または多量体を進化させる方法を含む。図10に図解されるように、ドメイン内組換えは、単量体全体にわたりまたは異なる単量体の部分を取り入れて、新たに組換えられた単位を形成させることにより単量体に導入されうる。異なる単量体は同じ標的または異なる標的を結合することができる。例えば、いくつかの態様において、異なるanato単量体の部分が組換えられることができる。いくつかの態様において、anato単量体の部分がDSL単量体の部分および/またはLNR単量体の部分と組み合わされることができる。ドメイン間(例えば、異なる単量体を多量体にもしくは多量体間で組換える)組換えまたはモジュール(例えば、多量体内の複数の単量体)の組換えが達成されてもよい。ライブラリー間の組換えも企図される。
図8は組換えによるドメイン内最適化の過程を図解する。示されているのは3断片のPCR重複反応であり、互いに対して単一ドメインの3セグメントを組換えている。図解されているのと同じやり方で2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の断片の重複反応を利用することができる。この組換え過程には多くの用途がある。用途の1つは、配列情報のない以前に選択されたクローンの何百もの大きなプールを組換えることである。各重複が作用するには、クローンのそれぞれにおいて同じ位置に存在する(比較的)一定な配列の1つの公知領域があれば十分である(定位置手法)。ドメイン内組換え法は、ランダム断片化に基づく標準的なDNA組換え(例えば、Stemmer, Nature 370：389-391 (1994))およびDNA配列相同性に基づく再アッセンブリにより、配列関連の単量体ドメインのプールで行われてもよく、組換えられるクローンの全てにおいて一定の重複部位は必要ない。
この過程の別の用途は、複数の分離した、処理されていない(パニングされていないことを意味する)ライブラリーであって、このそれぞれにおいてシステイン間のループの1つのみがランダム化されて、各ライブラリーにおいて異なるループをランダム化しているライブラリーを作製することである。標的に対して別々にこれらのライブラリーのパニングを行った後、選択されたクローンはランダム化される。各パニングライブラリーから、ランダム化されたセグメントだけをPCRにより増幅し、複数のランダム化されたセグメントを次に単一ドメインに組み合わせ、パニングされているおよび/またはいっそう高い効力についてスクリーニングされているシャッフルライブラリーを作製する。この過程を用いて、公知配列の小数のクローンをシャッフルすることもできる。
任意の共通配列が交差点として使われてもよい。システイン含有単量体の場合、システイン残基は交差について論理にかなう場所である。しかしながら、コンピュータモデリングなどの、最適な交差部位を判定するその他の方法が存在する。あるいは、最大のエントロピーを有する残基、または最小数の分子内接触は同様に、交差に良好な部位とすることができる。
単量体または多量体を進化させる方法は、例えば、以下の段階のいずれかまたは全てを含むことができる：複数の異なる核酸であって、それぞれが単量体ドメインをコードする核酸を提供する段階；複数の異なる核酸を翻訳し、複数の異なる単量体ドメインを提供する段階；複数の異なる単量体ドメインを所望のリガンドまたはリガンド混合物の結合についてスクリーニングする段階；所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する複数の異なる単量体ドメインのメンバーを同定し、選択された単量体ドメインを提供する段階；選択された単量体ドメインを少なくとも1つのリンカーと連結させて、少なくとも2つの選択された単量体ドメインと少なくとも1つのリンカーとを含む、少なくとも1つの多量体を作製する段階；および、選択された単量体ドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性について少なくとも1つの多量体をスクリーニングする段階。
変異は単量体または多量体のいずれかに導入することができる。上記のように、単量体を改良する例は、得られる増幅産物に変異を導入する条件の下で単量体の2つまたはそれ以上(例えば、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上)の部分が別々に増幅されるドメイン内組換え(例えば、シャッフリングまたはその他の組換え法による)、それにより単量体の異なる部分に対する変異体のライブラリーを合成することを含む。PCR断片の両方が共通点を持っている「中央」または「重複」配列内に中央プライマーの5'末端を位置付けることで、得られる「左」側および「右」側ライブラリーを重複PCRにより組み合わせて、単量体のオリジナルプールの新規の変異体を作製することができる。次いで、これらの新たな変異体を所望の特性についてスクリーニングすることができ、例えば、標的に対してパニングすることができまたは機能的効果についてスクリーニングすることができる。「中央」プライマーは単量体の任意のセグメントに対応するよう選択することができ、典型的には、骨格または単量体内の1つもしくは複数の共通アミノ酸(例えば、Aドメインに見出されるものなどのシステイン)に基づくことができよう。
同様に、多量体は、変異を単量体のレベルで導入し、その後、単量体の変異体ライブラリーを組換えることにより作製することができる。より大きな規模で、所望の特性を有する多量体(単一またはプール)を組換えて、より長い多量体を形成させることができる。場合によっては、変異を単量体にまたはリンカーに(典型的には合成的に)導入して、ライブラリーを形成させる。これは、例えば、2つの異なる標的に結合する2つの異なる多量体を用い、それによって1つの標的に結合する部分ともう1つの標的を結合する部分とを有する多量体を最終的に選択することで達成されうる。例えば、図9を参照されたい。
さらなる変異は、ドメイン間で異なる長さおよび組成のリンカーを挿入することにより導入することができる。これはドメイン間に最適なリンカーの選択を可能にする。いくつかの態様において、リンカーの最適な長さおよび組成は、ドメインの最適な結合を可能にするであろう。いくつかの態様において、特定の結合親和性を有するドメインが異なるリンカーにより連結され、最適なリンカーが結合アッセイで選択される。例えば、ドメインは所望の結合特性について選択され、その後、種々のリンカーを含むライブラリーに形成される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、最適なリンカーを同定することができる。あるいは、標的の分子結合に及ぼすドメインまたはリンカーの影響が知られていない多量体ライブラリーが形成されてもよい。
本発明の方法は同様に、複数の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを提供することにより1つまたは複数の選択された多量体を作製することを含む。複数の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを所望のリガンドまたはリガンド混合物の結合についてスクリーニングする。所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する複数のドメインのメンバーを同定し、それによって所望の親和性を有するドメインを提供する。同定されたドメインを少なくとも1つのリンカーと連結させて、各多量体が少なくとも2つの選択されたドメインと少なくとも1つのリンカーとを含む、多量体を作製する；および、選択されたドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性について多量体をスクリーニングし、それによって1つまたは複数の選択された多量体を同定する。
多量体ライブラリーは、いくつかの態様において、各ライブラリーメンバーが組換え部位として(例えば、lox部位)を含む、2つまたはそれ以上のライブラリーまたは単量体もしくは多量体をリコンビナーゼに基づく手法において組み合わせることにより作製することができる。分子的に多様なライブラリーメンバーのいっそう大きなプールには、原理上、いっそう高い標的結合親和性および機能的活性などの、所望の特性を有するいっそう多くの変異体が収容される。大腸菌に形質転換できるファージベクター中でライブラリーが構築される場合、ライブラリーのサイズ(109〜1010)は大腸菌の形質転換効率によって制限される。リコンビナーゼ/組換え部位の系(例えば、Cre-loxPの系)およびインビボ組換えを利用して、大腸菌の形質転換効率によってサイズが制限されないライブラリーを作製することができる。
例えば、Cre-loxP系を用いて1010、1011、1012、1013またはそれ以上の多様性を有する二量体ライブラリーを作製することができる。いくつかの態様において、処理されていない1つの単量体ライブラリーの宿主としての大腸菌と、もう1つの単量体ライブラリーを保有する繊維状ファージが使用される。ライブラリーサイズはこの場合、感染性ファージ(一方のライブラリーを保有する)の数および易感染性大腸菌細胞(他方のライブラリーを保有する)の数によってのみ制限される。例えば、1012個を超えるファージを1012個の大腸菌細胞(OD600 = 1で1 L)に感染させることで、1012個もの数の二量体の組合せを産生することができよう。
多量体の選択は、単量体ドメインを同定するための前述のものを含めて、種々の技術を用いて達成することができる。その他の選択方法は、例えば、選択された単量体ドメインと比べて、リガンドに対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性に基づく選択を含む。例えば、選択は特定の細胞型との、または一連の関連する細胞もしくはタンパク質型(例えば、異なるウイルス血清型)との選択的な結合に基づくことができる。次いで、例えば、リガンドの結合活性について選択された特性の最適化は、本発明において記述されるように、ドメインを組換えることで、および個々の単量体ドメインもしくはリンカードメインのアミノ酸配列またはそのようなドメインをコードするヌクレオチド配列を操作することで達成することができる。
多量体を同定する方法の1つは、多量体をディスプレイすることにより達成することができる。単量体ドメインと同様に、多量体は任意で、前述のように、種々のディスプレイ系、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、ヌクレオチド結合ディスプレイ(例えば、米国特許第6,281,344号；同第6,194,550号、同第6,207,446号、同第6,214,553号、および同第6,258,558号を参照されたい)および/または細胞表面ディスプレイで発現されてもまたはディスプレイされてもよい。細胞表面ディスプレイは、以下に限定されることはないが、大腸菌、酵母または哺乳動物細胞を含むことができる。さらに、複数の結合部位を有する多量体のディスプレイライブラリーを、リガンドに対するまたは複数のリガンドに対する結合活性もしくは親和性または改変された特異性についてパニングすることができる。
単量体または多量体は、2-ハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて酵母細胞で標的結合活性についてスクリーニングすることができる。このタイプのスクリーニングでは、スクリーニングされる単量体または多量体ライブラリーは、ライブラリーの各単量体または多量体と酵母の転写活性化因子断片(すなわち、Gal4)との間の融合タンパク質の形成を指令するベクターにクローニングされる。「標的」タンパク質をコードする配列は、標的とGal4タンパク質の残部(DNA結合ドメイン)との間の融合タンパク質の産生をもたらすベクターにクローニングされる。第3のプラスミドは、Gal4結合部位のDNA配列の下流にレポーター遺伝子を含有する。標的タンパク質に結合できる単量体は、これとともにGal4活性化ドメインをもたらし、このようにして機能的なGal4タンパク質を再構成する。レポーター遺伝子上流の結合部位に結合したこの機能的なGal4タンパク質は、レポーター遺伝子の発現および標的結合タンパク質としての単量体または多量体の選択をもたらす。(Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88：9578；Fields S. and Song O. (1989) Nature 340：245を参照のこと)。ライブラリースクリーニングに2-ハイブリッド系を用いることは、米国特許第5,811,238号にさらに記述されている(同様に、Silver S.C. and Hunt S.W. (1993) Mol. Biol. Rep. 17：155；Durfee et al., (1993) Genes Devel. 7：555；Yang et al., (1992) Science 257：680；Luban et al., (1993) Cell 73：1067；Hardy et al., (1992) Genes Devel. 6：801；Bartel et al., (1993) Biotechniques 14：920；およびVojtek et al., (1993) Cell 74：205を参照のこと)。本発明を実行するのに有用な別のスクリーニング系は、大腸菌/BCCP相互作用スクリーニング系である(Germino et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 90：993；Guarente L. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 90：1639)。
その他の変化物では複数の結合化合物の使用を含み、その結果、これらの分子の単量体ドメイン、多量体またはライブラリーを、異なる結合特異性を有するさまざまなリガンドまたは化合物について同時にスクリーニングすることができる。複数の所定のリガンドまたは化合物を単一のライブラリーで同時にスクリーニングすることができ、またはいくつかの単量体ドメインもしくは多量体に対して逐次的にスクリーニングすることができる。1つの変化物では、それぞれが別個のビーズ(またはビーズの一部)上でコードされる複数のリガンドまたは化合物を適当な結合条件の下で、これらの分子の単量体ドメイン、多量体またはライブラリーと混合し、インキュベートすることができる。次いで、複数のリガンドまたは化合物を含むビーズの回収を利用して、親和性選択により、選択された単量体ドメイン、選択された多量体またはライブラリーメンバーを単離することができる。一般に、その後の親和性スクリーニングのラウンドは、ビーズの同一混合物、その一部、またはたった1つもしくは2つの個々のリガンドもしくは化合物を含有するビーズを含むことができる。この手法は効率的なスクリーニングを提供し、実験室自動化、一括処理、およびハイスループット・スクリーニング法と適合する。
別の態様において、多量体を、複数のリガンドであって、それぞれが異なる標識を含むリガンドを結合する能力について同時にスクリーニングすることができる。例えば、各リガンドを異なる蛍光標識で標識し、多量体または多量体ライブラリーと同時に接触させることができる。次いで、所望の親和性を有する多量体を、所望の標識に連結された標識の存在に基づいて(例えば、FACSソーティングにより)同定する。
単量体ドメインまたは多量体のいずれか(便宜のため以下の考察では「親和剤」といわれる)のライブラリーをいくつかの異なる形式で複数のリガンドに対して同時にスクリーニングする(すなわち、パニングする)ことができる。例えば、複数のリガンドを単純混合物中で、アレイ中でスクリーニングすることができ、細胞もしくは組織上でディスプレイする(例えば、細胞または組織は、本発明の単量体ドメインまたは多量体によって結合されうる多数の分子を提供する)ことができ、および/または固定化することができる。例えば、図4を参照されたい。親和剤のライブラリーが任意で、酵母またはファージディスプレイ系でディスプレイされてもよい。同様に、必要に応じて、リガンド(例えば、cDNAライブラリー中にコードされる)が酵母またはファージディスプレイ系にディスプレイされてもよい。
最初に、親和剤ライブラリーを複数のリガンドに対してパニングする。任意で、得られた「ヒット」を1回または複数回リガンドに対しパニングして、得られた親和剤の群を濃縮してもよい。
必要に応じて、個々の親和剤および/またはリガンドの同一性を判定することができる。いくつかの態様において、親和剤をファージ上でディスプレイする。初期のスクリーニングにおいて結合すると同定された親和剤を第1および第2の部分に分ける。第1の部分を細菌に感染させ、使用されるファージのタイプに応じて、プラークまたは細菌コロニーのいずれかを生じさせる。発現ファージを固定化し、その後、下記のように選択されたファージにディスプレイされたリガンドでプローブする。
第2の部分をビーズにカップリングしまたは別の方法で固定化し、固定化された第2の部分に、オリジナル混合物中のリガンドの少なくともいくつかを含有するファージディスプレイライブラリーを接触させる。第2の部分に結合するファージを続いて溶出させ、上記の段落で記述した固定化ファージと接触させる。ファージ間の相互作用を検出し(例えば、リガンド発現ファージに特異的なモノクローナル抗体を用いて)、得られたファージのポリヌクレオチドを単離することができる。
いくつかの態様において、親和剤-リガンド対の同一性を判定する。例えば、親和剤とリガンドの両方がファージまたは酵母上でディスプレイされる場合、その対由来のDNAを単離し、配列決定することができる。いくつかの態様において、リガンドおよび親和剤に特異的なポリヌクレオチドを増幅する。各反応用の増幅プライマーは、得られる増幅産物が融合されるように相補的な5'配列を含んでおり、それによって親和剤の少なくとも一部およびリガンドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含むハイブリッドポリヌクレオチドを形成させることができる。得られたハイブリッドを用い親和剤またはリガンド(例えば、cDNAにコードされた)ポリヌクレオチドライブラリーをプローブして、親和剤とリガンドの両方を同定することができる。例えば、図10を参照されたい。
複数の多量体であって、このそれぞれがリガンド混合物中のリガンドに結合する多量体を同時に作製および同定するため、上記の方法を「ウォーキング」と容易に組み合わせることができる。これらの態様において、親和剤(単量体ドメイン、免疫ドメインまたは多量体)の第1のライブラリーを複数のリガンドに対してパニングし、溶出された親和剤を親和剤の第1または第2のライブラリーと連結させて、多量体親和剤(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、またはそれ以上の単量体または免疫ドメインを含む)のライブラリーを形成し、これをその後に複数のリガンドに対してパニングする。この方法を繰り返して、いっそう大きな多量体親和剤を作製し続けることができる。単量体ドメインの数を増加させることで、特定の標的に対するいっそう高い親和性および結合活性をもたらすことができる。もちろん、各段階で、パニングを任意で繰り返して、重要な結合剤を濃縮してもよい。場合によっては、ウォーキングは、単量体の末端に組換え部位(例えば、lox部位)を挿入し、リコンビナーゼを介した事象により単量体ライブラリーを組換えることで促進されよう。
上記の方法の選択された多量体は、例えば、選択された多量体を組換えるかまたはシャッフリングすることによって(組換えは多量体間もしくは多量体内またはその両方で起こりうる)、選択された多量体を突然変異させることによってなど、さらに操作することができる。これによって改変された多量体をもたらし、これを選択の多量体と比べて増強された特性を有するメンバーについてスクリーニングし、選択し、それによって選択の改変多量体を産生することができる。
本明細書中の記述を考慮すれば、以下の過程が続けて行われうることは明らかである。天然のもしくは非天然の単量体ドメインが組換えられてもよく、または変異体が形成されてもよい。任意でドメインは最初にまたは後に、それらが対象とされる宿主内で免疫原性である可能性が低い配列について選択されてもよい。任意で、組換えられたドメインを含むファージライブラリーは、所望の親和性についてパニングされてもよい。ファージにより発現される単量体ドメインまたは多量体は、標的に対するIC50についてスクリーニングされてもよい。ヘテロマーまたはホモマーの多量体が選択されうる。選択されたポリペプチドは、例えば、ヘテロ-またはホモ-多量体の標的を含め、任意の標的に対するその親和性について選択されてもよい。
本発明の有意な利点は、公知のリガンド、または未知のリガンドを用いて、単量体ドメインおよび/または多量体を選択できるということである。リガンド構造に関する事前情報は、関心対象の単量体ドメインまたは関心対象の多量体を単離するのに必要とされない。同定された単量体ドメインおよび/または多量体は生物活性を有することができ、このことは選択のまたは所望のリガンドに対して少なくとも特異的な結合親和性を含むことを意味するものであり、場合によっては、その他の化合物の結合を遮断する、代謝経路を刺激するまたは阻害する、シグナルまたは伝令としての役割を果たす、細胞活性を刺激するまたは阻害するなどの能力をさらに含むことができよう。単量体ドメインは、受容体に対する天然のリガンドが同定されていない受容体(オーファン受容体)に対するリガンドとして機能するよう作製することができる。これらのオーファンリガンドは、それらが結合する受容体先端部を遮断するかまたは活性化するよう作製することができる。
単量体ドメインおよび/または多量体を選択するため、単一のリガンドが使われてもよく、または任意で種々のリガンドが使われてもよい。本発明の単量体ドメインおよび/または免疫ドメインは、単一のリガンドまたは種々のリガンドを結合することができる。本発明の多量体は、単一のリガンドに対する複数の別個の結合部位を有してもよく、または任意で、種々のリガンドに対する複数の結合部位を有してもよい。
V. ライブラリー
本発明は同様に、単量体ドメインのライブラリーならびに単量体ドメインおよび/または免疫ドメインをコードする核酸のライブラリーを提供する。ライブラリーは、例えば、単量体ドメインをコードする約10、100、250、500、1000、もしくは10,000個またはそれ以上の核酸を含むことができ、またはライブラリーは、例えば、単量体ドメインをコードする約10、100、250、500、1000もしくは10,000個またはそれ以上のポリペプチドを含むことができる。ライブラリーは、同じシステイン枠を含有する単量体ドメイン、例えば、anatoドメイン、DSLドメイン、LNRドメイン、またはインテグリンβドメインを含むことができる。
いくつかの態様において、変異体は、単量体ドメイン(例えば、LDL受容体クラスAドメイン)の同一ファミリー由来の2つまたはそれ以上の異なる配列を組換えることにより作製される。あるいは、異なるファミリー由来の2つまたはそれ以上の異なる単量体ドメインを組み合わせて、多量体を形成させることができる。いくつかの態様において、多量体は以下のファミリークラスの少なくとも1つの単量体または単量体変異体から形成される：Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインならびにこれらの誘導体。別の態様において、単量体ドメインおよび異なる単量体ドメインは、Pfamデータベースおよび/またはSMARTデータベースで見出される1つまたは複数のドメインを含むことができる。上記の方法により産生されるライブラリー、ライブラリーの1つまたは複数のメンバーを含む1つまたは複数の細胞、およびライブラリーの1つまたは複数のメンバーを含む1つまたは複数のディスプレイも本発明に含まれる。
任意で、単量体ドメインをコードする核酸文字列のデータセットは、例えば、単量体ドメインをコードする第1の文字列を、異なる単量体ドメインをコードする1つまたは複数の文字列と混合し、それによって本明細書において記述されるものを含め、単量体ドメインをコードする核酸文字列のデータセットをもたらすことにより作製されてもよい。別の態様において、単量体ドメインおよび異なる単量体ドメインは、Pfamデータベースおよび/またはSMARTデータベースで見出される1つまたは複数のドメインを含むことができる。この方法はさらに、単量体ドメインをコードする第1の文字列および異なる単量体ドメインをコードする1つまたは複数の第2の文字列をコンピュータ内に入力する段階ならびにコンピュータ内でその、多量体文字列またはライブラリーを作製する段階を含むことができる。
ライブラリーは所望のリガンドもしくはリガンド混合物の結合などの所望の特性についてスクリーニングされてもよく、または別の方法で選択的な条件に曝露されてもよい。例えば、単量体ドメインのライブラリーのメンバーを公知のもしくは未知のリガンドもしくはリガンド混合物との結合に向けてディスプレイし、プレスクリーニングしてもよく、または血清中でインキュベートして、血清プロテアーゼの影響を受けやすいクローンを除去してもよい。次いで、単量体ドメイン配列を突然変異誘発(例えば、組換える、化学的に改変するなど)しまたは別の方法で改変してもよく、新たな単量体ドメインを、改善された親和性でリガンドまたはリガンド混合物に結合するかを再度スクリーニングしてもよい。選択された単量体ドメインを組み合わせるかまたは連結して、多量体を形成させることができ、これをリガンドまたはリガンド混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性についてスクリーニングすることができる。改変された特異性とは特異性が広くなること、例えば、複数の関連ウイルスの結合を意味してもよく、または任意で、改変された特異性とは特異性が狭くなること、例えば、リガンドの特定領域内での結合を意味してもよい。結合活性を計算するのに利用できるいくつかの方法が存在することを当業者は認識するであろう。例えば、Mammen et al., Angew Chem Int. Ed. 37：2754-2794 (1998)；Muller et al., Anal. Biochem. 261：149-158 (1998)を参照されたい。
本発明は同様に、ヒトタンパク質に由来するキメラ単量体ドメインのライブラリーを作製する方法であって、ヒトタンパク質のうちの少なくとも2つの異なる天然変異体の各々からの少なくとも1つのループに対応するループ配列であって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であるループ配列を提供する段階；およびループ配列を共有結合的に結び付けて、各キメラ配列が、少なくとも2つのループを有するキメラ単量体ドメインをコードする、少なくとも2つの異なるキメラ配列のライブラリーを作製する段階を含む方法を提供する。典型的には、キメラドメインは少なくとも4つのループ、および通常は、少なくとも6つのループを有する。前述のように、本発明は、ジスルフィド結合、二次タンパク質構造間の架橋、および分子動態(すなわち、柔軟性)の可能性などの、特異的な特徴によって同定された3タイプのループを提供する。この3タイプのループ配列は、システインによって規定されたループ配列、構造によって規定されたループ配列、およびB因子によって規定されたループ配列である。
または、ヒトキメラドメインライブラリーはループレベルに照らして、アミノ酸レベルで天然のヒト単量体ドメインを修飾することで作製することができる。免疫原性の可能性を最小限に抑えるため、ヒト単量体ドメインの同一ファミリー由来のタンパク質配列において天然に存在する残基だけを利用して、キメラ配列を作製する。これは、単量体ドメインの同一ファミリー由来の少なくとも2つのヒト単量体ドメインの配列アライメントを提供し、ヒト単量体ドメイン間で異なるヒト単量体ドメイン配列において対応位置のアミノ酸残基を同定し、それぞれのヒトキメラ単量体ドメイン配列が種類と位置において、単量体ドメインの同一ファミリー由来の2つまたはそれ以上のヒト単量体ドメイン由来の残基に相当するアミノ酸残基からなる2つまたはそれ以上のヒトキメラ単量体ドメインを作製することにより達成することができる。ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーは、標的分子との結合についてヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングし、および標的分子に結合するヒトキメラ単量体ドメインを同定することにより、関心対象の標的に結合するヒトキメラ単量体ドメインを同定するように利用することができる。初期の配列アライメント段階で利用される適当な天然のヒト単量体ドメイン配列は、本明細書において記述される天然の単量体ドメインのいずれかに対応するものを含む。
本発明のヒトキメラドメインライブラリーは(ループを変化させることで作製されようとも単一のアミノ酸残基を変化させることで作製されようとも)、当業者に公知の方法により調製することができる。これらのライブラリーを作製するのに特に適した方法は、国際公開公報第01/23401号に記述されるスプリット-プール形式およびトリヌクレオチド合成形式である。
VI. 融合タンパク質
いくつかの態様において、本発明の単量体または多量体を別のポリペプチドに連結させて、融合タンパク質を形成させる。当技術分野における任意のポリペプチドを融合パートナーとして利用できるものの、融合パートナーが多量体を形成する場合に有用でありうる。例えば、本発明の単量体または多量体は、例えば、抗体の以下の位置または位置の組合せに融合させることができる：
1. VH1および/もしくはVL1ドメインのN末端に、任意でリーダーペプチド直後におよびドメインが始まる前に(骨格領域1)；
2. VH1もしくはVL1ドメインに取って代わるよう、CH1もしくはCL1ドメインのN末端に；
3. 重鎖のN末端に、任意でCH1ドメイン後におよび蝶番部中のシステイン残基の前に(Fc-融合)；
4. CH3ドメインのN末端に；
5. CH3ドメインのC末端に、任意で短いリンカーを介して最後のアミノ酸残基に付着されてもよい；
6. CH3ドメインに取って代わるよう、CH2ドメインのC末端に；
7. CL1もしくはCH1ドメインのC末端に、任意で鎖間ジスルフィドを形成するシステインの後に；または
8. VH1もしくはVL1ドメインのC末端に。例えば、図7を参照されたい。
いくつかの態様において、単量体または多量体ドメインは、医薬として有用な分子(例えば、タンパク質、核酸、有機小分子など)に連結される。例示的な医薬タンパク質としては、例えば、サイトカイン、抗体、ケモカイン、増殖因子、インターロイキン、細胞表面タンパク質、細胞外ドメイン、細胞表面受容体、細胞毒素などが挙げられる。例示的な小分子医薬としては、小分子の毒素または治療薬が挙げられる。
いくつかの態様において、単量体または多量体は組織特異的なまたは疾患特異的な標的タンパク質に結合するよう選択される。組織特異的なタンパク質は、動物でのその他の組織と比べて1つまたはいくつかの特定の組織において、排他的にまたはかなり高いレベルで発現されるタンパク質である。同様に、疾患特異的なタンパク質は、動物でのその他の非病変細胞または組織と比べて1つまたはいくつかの病変細胞または組織において、排他的にまたはかなり高いレベルで発現されるタンパク質である。そのような疾患の例としては、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、肝硬変、肝炎、混合性結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性赤血球増加症、乾癬、原発性血小板血症、ならびに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、胸部、頸部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮の癌などの細胞増殖性疾患；後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド沈着症、貧血症、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウエルナー症候群、癌や、血液透析や、体外循環の合併症、ウイルス性の、細菌性の、真菌性の、寄生性の、原虫に起因する、および蠕虫に起因する感染、ならびに外傷などの自己免疫/炎症性疾患；うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性性心臓弁膜症、石灰化大動脈弁狭窄、先天性大動脈二尖弁、僧帽弁輪部石灰、僧帽弁逸脱、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスに伴う心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、新生心臓病、先天性心疾患、心臓移植の合併症、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓症、血管腫瘍、ならびに血栓溶解や、バルーン血管形成や、血管移植術や、冠動脈バイパス術の合併症などの心疾患；てんかん、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、認知症、パーキンソン病およびその他の錐体外路疾患、筋萎縮性側索硬化症およびその他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮、網膜色素変性症、遺伝性運動失調症、多発性硬化症およびその他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎瘍、ウイルス性中枢神経障害、クルを含むプリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、 およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、神経系の栄養性および代謝性疾患、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽細胞腫(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳三叉神経症候群、知的障害およびダウン症を含む中枢神経系のその他の発達障害、脳性麻痺、神経系障害(neuroskeletal disorders)、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィーおよびその他の神経筋障害、末梢神経系障害、皮膚筋炎および多発性筋炎、遺伝性の、代謝性の、内分泌性の、および中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、気分障害、不安障害、および統合失調症を含む精神疾患、季節性情動障害(SAD)、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性神経障害、遅発性ジスキネジー、筋失調症、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、トウレット障害、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ならびに家族性前頭側頭型痴呆などの神経疾患；かつ尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、てんかん、性腺発育障害、WAGR症候群(ウィルムス腫瘍, 無虹彩、泌尿生殖器異常、および知的障害)、スミス・マーゲニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー・マリー・ツース病および神経線維腫症などの遺伝性ニューロパシー、甲状腺機能低下症、水頭症、シデナム舞踏病および脳性麻痺などの発作性疾患、二分脊椎症、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、ならびに感音難聴などの発達障害が挙げられるが、これらに限定されることはない。例示的な疾患または状態としては、例えば、MS、SLE、ITP、IDDM、MG、CLL、CD、RA、第VIII因子血友病、移植、動脈硬化症、シェーグレン症候群、川崎病、抗リン脂質Ab、AHA、潰瘍性大腸炎、多発性骨髄腫、糸球体腎炎、季節性アレルギー、およびIgA腎症が挙げられる。
いくつかの態様において、標的タンパク質に結合する単量体または多量体は、標的タンパク質が発現される特異的組織または疾患関連細胞に、得られる複合体または融合体が標的化されるように医薬タンパク質または小分子に連結される。そのような複合体または融合体で用いる単量体または多量体を、標的タンパク質との結合について最初に選択することができ、結合がその他の非標的細胞または組織で低減されるかまたは解消されることが望ましい、その他の細胞または組織に対する陰性選択によって(例えば、骨髄または薬物毒性の下限を決めるその他の組織を標的化するのを回避するため)引き続き選択することができる。医薬を感受性組織から遠ざけることによって、治療濃度域が高まり、その結果、高用量を安全に投与することができる。別の方法では、単量体または多量体のライブラリーを動物に注入し、その後、関心対象の特定の組織または細胞に結合する単量体または多量体を単離することにより、動物でインビボパニングを行うことができる。
上記の融合タンパク質は同様に、医薬タンパク質と単量体または多量体との間にリンカーペプチドを含むことができる。ペプチドリンカー配列は、例えば、各ポリペプチドがその二次および三次構造に折り畳まれるのを確実とするのに十分な距離でポリペプチド成分を分離するため利用することができる。融合タンパク質は一般に、化学的結合を含め、標準的な技術を用いて調製することができる。融合タンパク質は同様に、標準的な技術により発現系において組換えタンパク質として発現することができる。
例示的な組織特異的または疾患特異的タンパク質は、例えば、米国特許出願第2002/0107215号の表IおよびIIで見出すことができる。標的タンパク質が特異的に発現されうる例示的な組織は、例えば、肝臓、膵臓、副腎、甲状腺、唾液腺、下垂体、脳、脊髄、肺、心臓、胸部、骨格筋、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、結腸直腸、胃、卵巣、小腸、子宮、胎盤、前立腺、睾丸、結腸、結腸、胃腸、膀胱、気管、腎臓、または脂肪組織を含む。
VII. 組成物
本発明は同様に、本発明の方法によって産生された組成物を含む。例えば、本発明は、本発明の方法によって産生された単量体ドメインを含むライブラリーから選択または同定された単量体ドメインを含む。
核酸およびポリペプチドの組成物は、本発明に含まれる。例えば、本発明は、それぞれの核酸が少なくとも1つの単量体ドメインまたは免疫ドメインをコードする複数の異なる核酸を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つの単量体ドメインはNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメイン、およびこれらの1つまたは複数の変異体からなる群より選択される。適当な単量体ドメインは同様に、Pfamデータベースおよび/またはSMARTデータベースに記載されているものを含む。
本発明は同様に、複数の単量体ドメインであって、天然のポリペプチドに比べ順番または配列が改変されている単量体ドメインを含む1つまたは複数のポリペプチドをコードする組換え核酸を提供する。例えば、天然のポリペプチドはNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメイン、およびこれらの1つまたは複数の変異体からなる群より選択することができる。別の態様において、天然のポリペプチドは、Pfamデータベースおよび/またはSMARTデータベースで見出される単量体ドメインをコードする。
本発明の方法によって産生された組成物、例えば、単量体ドメインならびにその多量体およびライブラリーを含む、本発明の全組成物は、任意で親和性材料のマトリックスに結合されうる。親和性材料の例としては、ビーズ、カラム、固体支持体、マイクロアレイ、試薬支持体のその他のプールなどが挙げられる。いくつかの態様において、溶液中のスクリーニングでは、ビオチン化された標的を用いる。これらの態様において、標的をファージライブラリーとインキュベートし、結合したファージを有する標的をストレプトアビジンビーズによって捕捉する。
本発明の組成物は親和性材料のマトリックス、例えば、組換えポリペプチドに結合されうる。親和性材料の例としては、例えば、ビーズ、カラム、固体支持体などが挙げられる。
VIII 治療的および予防的な処置方法
本発明は同様に、1つまたは複数の、上記の本発明の核酸またはポリペプチド(あるいは薬学的に許容される賦形剤および1つまたは複数のこのような核酸またはポリペプチドを含む組成物)をインビボまたはエクスビボで、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジを含む哺乳動物、または哺乳動物でない脊椎動物、例えば、鳥類(例えば、ニワトリもしくはアヒル)、魚類、あるいは無脊椎動物を含めて、被験体に投与することによって、疾患または障害を治療的にまたは予防的に処置する方法を含む。
本発明の1つの局面において、エクスビボの方法において、1つまたは複数の細胞または被験体の関心対象の細胞の集団(例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌など)が被験体から入手されるか取り出され、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療的に処置するのに有効な、本発明の選択された単量体ドメインおよび/または多量体の一定の量と接触される。次いで、接触された細胞は、処置される被験体中の関心対象の、それが得られた部位または別の部位(例えば、上記に規定したものを含む)で被験体に戻されるかまたは送達される。所望の場合、接触された細胞は、標準的移植技術および周知の移植技術を使用して、被験体中の関心対象の組織、器官、または系の部位(上記のすべてのものを含む)に移植されうるか、または、例えば、標準的な送達技術または輸血技術を使用して、血液またはリンパ系に送達されうる。
本発明は同様に、1つまたは複数の細胞または被験体の関心対象の細胞の集団が、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療的に処置するのに有効な、本発明の選択された単量体ドメインおよび/または多量体の一定の量と、直接的にまたは間接的に接触される、インビボの方法を提供する。直接的な接触/投与様式においては、選択された単量体ドメインおよび/または多量体は、典型的には、処置される細胞または関心対象の組織の部位(例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌など)に、局所的投与、注射(例えば、注射針または注射器の使用による)、またはワクチン送達あるいは組織、器官、または皮膚の組織に押し込む遺伝子銃送達を含む、種々の様式のいずれかによって、直接的に投与または輸送される。選択された単量体ドメインおよび/または多量体は、例えば、筋肉内に、皮内に、真皮下に、皮下に、経口に、腹腔内に、鞘内に、静脈内に送達されうるか、または身体の腔内に配置されるか(例えば、外科手術の間を含む)、あるいは吸入または膣投与もしくは直腸投与により送達されうる。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は少なくとも25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml、100 mg/ml、150 mg/mlまたはそれ以上の濃度で調製される。そのような濃度は、例えば、皮下処方物に有用である。
インビボでの間接的な接触/投与様式において、選択された単量体ドメインおよび/または多量体は、本発明のポリペプチドを、そこから処置が容易にされうる1つまたは複数の細胞または細胞の集団に直接的に接触または投与することによって、典型的には、上記のもの(例えば、皮膚細胞、器官系、リンパ系、または血液細胞系など)を含む、処置される細胞または関心対象の組織の部位に間接的に投与または輸送される。例えば、被験体の体内の腫瘍細胞は、選択の単量体ドメインおよび/または多量体の関心対象の部位(例えば、体内の、関心対象の組織、器官、もしくは細胞、または血液もしくはリンパ系)への送達が行われて、有効な予防的または治療的処置がもたらされるような十分量の選択の単量体ドメインおよび/または多量体と血液もしくはリンパ系の細胞、皮膚、または器官を接触させることによって処置されうる。このような接触、投与、または輸送は、典型的には、上記の投与経路または様式の1つまたは複数を用いて行われる。
別の局面において、本発明はエクスビボの方法を提供し、ここでは、1つまたは複数の関心対象の細胞または被験体の関心対象の細胞の集団(例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌など)が被験体から入手されるか取り出され、この1つまたは複数の細胞または細胞の集団を、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療的に処置するのに有効な、関心対象の生物学的に活性なポリペプチド(例えば、選択された単量体ドメインおよび/または多量体)をコードする本発明の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築体と接触させることによって形質転換する。この1つまたは複数の細胞または細胞の集団は、十分な量のポリヌクレオチド構築体およびこの核酸配列の発現を制御するプロモーターと接触され、その結果、ポリヌクレオチド構築体(およびプロモーター)の細胞への取り込みが起こり、本発明の標的の核酸配列の十分な発現を生じて、疾患、障害、または状態を予防的にまたは治療的に処置するのに有効な、選択された単量体ドメインおよび/または多量体をコードする、生物学的に活性な一定量のポリペプチドを産生する。このポリヌクレオチド構築体は、本発明の核酸配列の発現を制御するプロモーター配列(例えば、CMVプロモーター配列)および/または、必要に応じて、少なくとも1つまたは複数の、本発明の別のポリペプチド、サイトカイン、アジュバント、または同時刺激性分子、または関心対象の他のポリペプチドをコードする、1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含みうる。
トランスフェクションの後、形質転換細胞は被験体に、それらを得た組織の部位もしくは系へまたは被験体内で処置される別の部位(例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌など)へ戻されるか、送達されるか、または輸送される。必要に応じて、細胞は、標準的かつ周知の移植技術を用いて被験体内の関心対象の組織、皮膚、器官、または身体系に移植されうるか、あるいは標準的な送達または輸血技術を用いて血液またはリンパ系に送達されうる。形質転換細胞のこのような送達、投与、または輸送は、典型的には、1つまたは複数の、上記の投与経路または様式を用いて行われる。標的核酸の発現は自然に起こりまたは誘導されてもよく(以下にさらに詳細に記述される)、部位または組織系で疾患または状態を処置するのに十分なおよび有効な、コードポリペプチドの量が発現される。
別の局面において、本発明は、疾患、障害、またはその他の状態を予防的にまたは治療的に処置するうえで有効な、生物学的に活性な関心対象のポリペプチド(例えば、選択された単量体ドメインおよび/または多量体)をコードする本発明の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築体と細胞または細胞の集団を接触させる(あるいは上記の投与経路または様式の1つまたは複数を用いて細胞または細胞の集団に投与するかまたは輸送する)ことにより、1つもしくは複数の関心対象の細胞または被験体の細胞の集団(例えば、上記の細胞および細胞系ならびに被験体を含む)が被験体の体内において形質転換されるインビボの方法を提供する。
ポリヌクレオチド構築体は、疾患または障害にかかった細胞に、直接的に投与または輸送されうる(例えば、上記の投与経路または様式の1つまたは複数を用いる直接的な接触により)。あるいは、ポリヌクレオチド構築体は、疾患または障害にかかった細胞に間接的に投与または輸送されうる。これは、疾患を有しない細胞または他の疾患を有する細胞を、上記の投与経路または様式の1つまたは複数を用いて、生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸配列およびその核酸配列の発現を制御するプロモーターを含む、十分な量のポリヌクレオチド構築体と最初に直接的に接触させることによって行われる。その結果、細胞へのポリヌクレオチド構築体(およびプロモーター)の取込みが起こり、本発明の核酸配列の十分な発現が生じて疾患または障害を予防的にまたは治療的に処置するのに有効な量の生物学的に活性なポリペプチドを産生し、それによってポリヌクレオチド構築体または得られた発現されたポリペプチドは天然にまたは自動的に、被験体の身体の、最初の送達部位、系、組織、または器官から、被験体の身体の、疾患の部位、組織、器官、または系に輸送される(例えば、血液またはリンパ系を介して)。標的核酸の発現は天然に生じるか、または誘導されることができ(以下にさらに詳細に記述されるように)、その結果、一定量の発現されたポリペプチドは、その部位または組織系での疾患または状態を処置するのに十分かつ効果的である。このポリヌクレオチド構築体は、本発明の核酸配列の発現を制御するプロモーター配列(例えば、CMVプロモーター配列)および/または、必要に応じて、少なくとも1つまたは複数の、本発明の別のポリペプチド、サイトカイン、アジュバント、または同時刺激性分子、または関心対象の他のポリペプチドをコードする、1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含みうる。
上記のようなインビボまたはエクスビボの処置方法の各々において、賦形剤および本発明のポリペプチドまたは核酸を含む組成物が投与または送達されうる。1つの局面において、薬学的に許容される賦形剤および本発明のポリペプチドまたは核酸を含む組成物は、疾患または障害を処置するのに有効な量で、上記のように被験体に投与または送達される。
別の局面において、上記のインビボおよびエクスビボの処置方法の各々において、細胞または被験体に投与されるポリヌクレオチドの量は、被験体の1つまたは複数の細胞へのポリヌクレオチドの取込みが起こり、その核酸配列の十分な発現が生じて、免疫原(例えば、抗原)によって誘導される免疫応答を含め、被験体での免疫応答を増強するのに有効な量の生物学的に活性なポリペプチドを産生するような量でありうる。別の局面において、このような方法の各々の場合、細胞または被験体に投与されるポリペプチドの量は、免疫原(例えば、抗原)によって誘導されるものを含め、被験体での免疫応答を増強するのに十分な量でありうる。
なお別の局面において、ポリヌクレオチド構築体(またはポリヌクレオチド構築体を含む組成物)が生理学的に活性なポリペプチドを被験体に送達するために使用される、インビボまたはインビボの処理方法において、ポリヌクレオチド構築体の発現は、誘導性のオンおよびオフ遺伝子発現系を用いて誘導されうる。このようなオンおよびオフ遺伝子発現系の例には、Tet-On (商標)遺伝子発現システムおよびTet-Off (商標)遺伝子発現システムがそれぞれ挙げられる(例えば、このような系の各々の詳細な記載については、Clontechカタログ2000、110-111頁を参照されたい)。他の制御可能なまたは誘導性のオンおよびオフ遺伝子発現系は、当業者に公知である。このような系を用いると、ポリヌクレオチド構築体の標的の核酸の発現が、正確、可逆的、かつ定量的な様式で調節されうる。標的核酸の遺伝子発現は、例えば、標的核酸を含むポリヌクレオチド構築体を含む安定なトランスフェクト細胞が、関心対象の組織部位、器官、または系に送達または輸送されるか、または関心対象の組織部位、器官、または系に接触されるように作製された後で、誘導されうる。このような系は、標的核酸の発現を遅らせるか、または正確に制御することが有利であるような処置の方法および様式において特に利点がある。(例えば、手術の完了のための時間および/または手術後の治癒を可能にするため；標的核酸を含むポリヌクレオチド構築体が、処置される部位、細胞、系、または組織に到達するための時間を可能にするため；構築体で形質転換された細胞を含む移植物が、その移植物が接合または接着などされた組織または器官の上または中に取り込まれるための時間を可能にするため)。
IX. さらなる多量体の用途
本発明の多量体の潜在的な適用は多岐にわたり、親和剤が所望とされる任意の用途を含む。例えば、本発明は、アンタゴニストを作製するための適用において使用されうる。ここでは、選択された単量体ドメインまたは多量体は、2つのタンパク質間の相互作用を遮断する。任意で、本発明はアゴニストを作製してもよい。例えば、2つの異なるタンパク質、例えば、酵素および基質を結合する多量体は、例えば、酵素活性および/または基質変換を含め、タンパク質の機能を増強しうる。
その他の適用には細胞標的化が含まれる。例えば、特定の細胞表面タンパク質を認識する単量体ドメインおよび/または免疫ドメインからなる多量体は、特定の細胞型に選択的に結合しうる。抗ウイルス剤として単量体ドメインおよび/または免疫ドメインを含む適用も含まれる。例えば、ウイルス粒子上の異なるエピトープに結合する多量体は、多価ゆえに抗ウイルス剤として有用でありうる。その他の適用には、タンパク質精製、タンパク質検出、バイオセンサー、リガンド-アフィニティー捕捉実験などが含まれうるがこれらに限定されない。さらに、ドメインまたは多量体は、例えば、治療剤または診断剤としての、任意の適当な用途のために慣用的な手段によってバルクで合成されうる。
本発明はさらに、血液因子(例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球)に結合する単量体ドメインを提供する。
いくつかの態様において、単量体ドメインは免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分に結合する。
免疫グロブリンに結合する単量体ドメインの4つのファミリー(すなわち、ファミリー1、2、3および4)が同定されている。
ファミリー1の配列を以下に示す。ダッシュ記号は間隔のためだけに含まれる。
Figure 2008520207
ファミリー2は以下のモチーフを有する。
Figure 2008520207
IgGファミリー2モチーフを含む例示的な配列を以下に示す。ダッシュ記号は間隔のためだけに含まれる。
Figure 2008520207
ファミリー3は2つの以下のモチーフのどちらかを有する。
Figure 2008520207
IgGファミリー3モチーフを含む例示的な配列を以下に示す。ダッシュ記号は間隔のためだけに含まれる。
Figure 2008520207
ファミリー3アライメントに基づく、IgGを結合するかつAドメイン骨格中の3番目のシステイン直前の配列SSGRを有するさらなる非天然の単量体ドメイン。これらの単量体ドメインの配列を以下に示す。ダッシュ記号は間隔のためだけに含まれる。
Figure 2008520207
赤血球(RBC)または血清アルブミン(CSA)に結合する単量体ドメインは、米国特許出願第2005/0048512号に記述されており、例えば、以下を含む。
Figure 2008520207
本発明は、例えば、本発明の多量体または動物での関心対象のタンパク質を含む、タンパク質の血清中半減期を延長させる方法を提供する。関心対象のタンパク質は、治療的な、予防的な、またはその他の点で望ましい機能性を有する任意のタンパク質(本発明の別の単量体ドメインまたは多量体を含む)とすることができる。この方法は、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)またはトランスフェリン、IgGまたはその一部などの血清タンパク質、赤血球などのような、血液により運搬される分子または細胞などの半減期延長分子に特異的に結合する結合タンパク質として同定された単量体ドメインを最初に提供する段階を含む。いくつかの態様において、半減期延長分子-結合単量体を、関心対象のタンパク質に結合親和性を有する別の単量体ドメインに共有結合的に連結させることができる。任意で関心対象のタンパク質を結合してよい、この多量体を哺乳動物に投与し、そこでその多量体は半減期延長分子(例えば、HSA、トランスフェリン、IgG、赤血球など)と結び付いて、複合体を形成することができよう。この複合体形成は、多量体および/または結合タンパク質をタンパク質分解ならびに/または多量体および/もしくはタンパク質のその他の除去から保護し、それによってタンパク質および/または多量体の半減期を延長させる、半減期の延長をもたらす(例えば、以下の実施例3を参照のこと)。本発明のこの用途の変化物の1つでは、関心対象のタンパク質に共有結合的に連結された半減期延長分子-結合単量体を含む。関心対象のタンパク質は、単量体ドメイン、単量体ドメインの多量体、または合成薬物を含むことができる。あるいは、免疫グロブリンまたは赤血球のいずれかに結合する単量体を上記の方法によって作製し、半減期の延長に使用することができよう。
半減期延長分子-結合多量体は、典型的には、少なくとも2つのドメイン、キメラドメイン、または突然変異ドメイン(すなわち、関心対象の標的に結合する1つと、血液により運搬される分子または細胞に結合する1つ)の多量体である。適当なドメイン、例えば、本明細書において記述されるものを半減期延長分子との結合についてさらにスクリーニングし、選択することができる。半減期延長分子-結合多量体は、例えば、半減期延長分子-結合活性についてプレスクリーニングされた単量体ドメインを利用し、本明細書において記述される多量体を作成する方法によって作製される。例えば、一部の半減期延長分子-結合LDL受容体クラスAドメイン単量体を以下の実施例2で記述する。
いくつかの態様において、多量体は、HSA、トランスフェリン、IgG、赤血球またはその他の半減期延長分子に結合する少なくとも1つのドメインであって、本明細書において提供されるNotch/LNRドメインモチーフ、DSLドメインモチーフ、Anatoドメインモチーフ、インテグリンβドメインモチーフ、またはCa-EGFドメインモチーフを含むドメインを含み、および多量体は、標的分子を結合する少なくとも第2のドメインであって、本明細書において提供されるNotch/LNRドメインモチーフ、DSLドメインモチーフ、Anatoドメインモチーフ、インテグリンβドメインモチーフ、またはCa-EGFドメインモチーフを含む第2のドメインを含む。分子の血清中半減期は、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、400、500時間またはそれ以上の時間となるよう延長させることができる。
本発明は同様に、哺乳動物における免疫応答の抑制または軽減のための方法を提供する。この方法は、免疫抑制性の標的に結合する単量体ドメインを最初に選択する段階を含む。そのような「免疫抑制性の標的」は、別のタンパク質に結合された場合、哺乳動物での免疫抑制性の結果をもたらす任意のタンパク質と定義される。次に、免疫抑制性の単量体ドメインは直接的に投与されてもよく、または免疫抑制性の単量体ドメインの所望の標的化をもたらしうる別のタンパク質にまたは別の単量体ドメインに共有結合的に連結されてもよい。免疫抑制性の多量体は、典型的には、少なくとも2つのドメイン、キメラドメイン、または突然変異ドメインの多量体である。適当なドメインは、本明細書において記述されるものの全てを含み、免疫抑制性の標的との結合についてさらにスクリーニングされ、選択される。免疫抑制性の多量体は、例えば、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、またはインテグリンβ単量体ドメインを利用し、本明細書において記述される多量体を作成する方法によって作製される。
いくつかの態様において、単量体ドメインはリガンド阻害、リガンドクリアランスまたはリガンド刺激に使われる。これらの方法において可能なリガンドとしては、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または増殖因子が挙げられる。
受容体とのリガンド結合の阻害が望まれるなら、リガンドの受容体と接するリガンドの部分でリガンドに結合する、またはリガンドと接する受容体の部分で受容体に結合する、単量体ドメインを選択し、それによってリガンド-受容体の相互作用を阻止する。必要に応じて、単量体ドメインは任意で半減期延長分子に連結されてもよい。
リガンドクリアランスとは、体液中で可溶性リガンドの半減期を調節することをいう。例えば、半減期延長分子がないときは、大部分の単量体ドメインは、短い半減期を有する。すなわち、リガンドとの単量体ドメインの結合はリガンドの半減期を低減し、それによってリガンド濃度を低減させるであろう。単量体ドメインが結合したリガンドの部分は、一般に重要ではないが、その受容体に結合するリガンドの部分でリガンドを結合することが有益であり、それによってリガンドの効果をさらに阻害することができる。この方法は血流中の任意の分子の濃度を低減させるのに有用である。いくつかの態様において、血流中の分子の濃度は、分子の腎臓クリアランス率を促進させることで低減される。典型的には、単量体ドメイン-分子複合体は約40 KDa未満、約50 KDa未満、または約60 KDa未満である。
または、半減期延長分子に結合する第1の単量体ドメインとリガンドの受容体に結合しないリガンドの部分に結合する第2の単量体ドメインとを含む多量体を用いて、リガンドの半減期を増加させることができる。
別の態様において、リガンドに結合する第1の単量体ドメインと受容体に結合する第2の単量体ドメインとを含む多量体を用いて、受容体に対するリガンドの実効的な親和性を増大させることができる。
別の態様において、受容体に結合する少なくとも2つの単量体を含む多量体を用いて、2つの受容体を、両方が多量体を結合することで接近させ、それによって受容体を活性化させる。
いくつかの態様において、2つの異なる単量体を有する多量体を用いて、標的により駆動される結合活性の増大を採用することができる。例えば、第1の単量体は第1の細胞型の細胞表面分子に標的化することができ、第2の単量体は第2の細胞型の表面分子に標的化することができる。多量体を形成させるよう2つの単量体を連結し、その後、多量体を2つの細胞型の混合物に加えることで、結合が細胞間で起こるはずであり、初期の結合事象が1つの多量体と2つの細胞との間で起こったら、その他の多量体も両細胞を結合することができよう。
本発明の潜在的用途のさらなる例は、薬物結合(例えば、標的化のための放射ヌクレオチドの結合、薬物の半減期延長のための医薬の結合、過剰摂取による処置および中毒治療のための制御物質の結合)、免疫機能調節(例えば、CTLA-4のような受容体の結合による免疫原性の遮断、CD80のような受容体の結合による免疫原性の増強、またはFc型結合による補体活性化)、および特殊送達(例えば、リンカー切断による徐放、電気輸送ドメイン、二量体化ドメイン、または以下との特異的結合：細胞侵入ドメイン、FcRなどのクリアランス受容体、経粘膜輸送のためのplgRなどの経口送達受容体およびトランスフェリンRなどの血液脳関門輸送受容体)の能力がある、単量体ドメイン、およびその多量体を含む。
さらに、異なる機能を持つ単量体または多量体は、組み合わされて組み合わされた機能を有する多量体を形成する。例えば、記載されるHSA結合単量体および記載されるCD40L結合単量体は共に他の多量体に追加されることにより、免疫原性を低下させかつ多量体の半減期を増加させることができる。
さらなる態様において、単量体または多量体を検出可能な標識(例えば、Cy3、Cy5など)に連結することができ、またはレポーター遺伝子産物(例えば、CAT、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、GFPなど)に連結することができる。
いくつかの態様において、本発明の単量体を、検出アッセイで二次試薬として用いるため、特定の動物、例えば、ヤギ、ウサギ、マウスなどの抗体を結合する能力について選択する。
場合によっては、単量体または多量体の対を同じ標的に結合するよう選択する(すなわち、サンドイッチに基づくアッセイで用いるため)。適合した単量体または多量体の対を選択するため、2つの異なる単量体または多量体は、典型的には、標的タンパク質を同時に結合することができる。そのような対を同定する手法の1つは、以下の段階を含む：
(1) 標的タンパク質を結合するよう以前に選択されたファージまたはタンパク質混合物を固定化する段階
(2) 固定化されたファージまたはタンパク質に標的タンパク質を接触させる段階および洗浄する段階；
(3) 結合された標的にファージまたはタンパク質混合物を接触させる段階および洗浄する段階；ならびに
(4) 固定化されたファージまたはタンパク質を溶出させることなく、結合されたファージまたはタンパク質を溶出させる段階。
いくつかの態様において、異なる薬物マーカーを有する異なるファージ集団が使われる。
本発明の多量体または単量体ドメインの1つの用途は、検出アッセイまたはその他の親和性に基づくアッセイにおいて抗体またはその他の親和剤に取って代わる用途である。すなわち、いくつかの態様において、単量体ドメインまたは多量体は、混合物中の標的以外の成分を結合する能力に対して選択される。一般的な手法は、アッセイの間のサンプル組成を模倣することを含め、アッセイの条件に酷似する条件の下で親和性選択を行うことを含むことができる。従って、選択の段階は、標的リガンドを含んでいない混合物に単量体ドメインまたは多量体を接触させる段階および混合物に結合する任意の単量体ドメインまたは多量体を負に選択する段階を含むことができよう。従って、アッセイのサンプル(血清、血液、組織、細胞、尿、***など)に相当する、(抗体、単量体ドメインまたは多量体を用いて枯渇させることができる標的リガンドの存在しない)混合物をブロッキング剤として使用することができる。そのようなサブトラクションは、例えば、標的に結合するがその他の血清タンパク質または非標的組織に結合しない医薬タンパク質を作製するのに有用である。
X. 単量体ドメインおよび/または多量体の核酸およびポリペプチドのさらなる操作
上述のように、本発明のポリペプチドは改変されうる。これらのポリペプチドをコードする修飾または改変された核酸配列を作製するための種々の多様な作製手段の記載は、以下の刊行物およびその中で引用される参考文献の中で上記におよび下記に記述されている。
Figure 2008520207
多様性を作製する突然変異の方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発
Figure 2008520207
ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発
Figure 2008520207
オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発
Figure 2008520207
ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発
Figure 2008520207
ギャップを有する二重鎖DNAを用いる突然変異誘発
Figure 2008520207
が挙げられる。
さらなる適当な方法としては、点ミスマッチ修復(Kramer et al., Point Mismatch Repair, (1984) Cell 38：879-887)、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発(Carter et al., (1985) Nucl. Acids Res. 13：4431-4443；およびCarter, (1987) Methods in Enzymol. 154：382-403)、欠失突然変異誘発(Eghtedarzadeh & Henikoff, (1986) Nucl. Acids Res. 14：5115)、制限選択および制限精製(Wells et al., (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317：415-423)、全体の遺伝子合成による突然変異誘発(Nambiar et al., (1984) Science 223：1299-1301；Sakamar and Khorana, (1988) Nucl. Acids Res. 14：6361-6372；Wells et al., (1985) Gene 34：315-323；およびGrundstrom et al., (1985) Nucl. Acids Res. 13：3305-3316)、
二本鎖切断修復(Mandecki, (1986) PNAS USA, 83：7177-7181；およびArnold, (1993) Curr. Op. Biotech. 4：450-455)が挙げられる。上記の方法の多くに関するさらなる詳細は、Methods in Enzymology 第154巻の中で見出すことができ、これは同様に、種々の突然変異誘発方法に伴う問題解決のための有用な標準について記述している。
さまざまな多様性を作製する方法に関するさらなる詳細は、
Figure 2008520207
の中で見出すことができる。
本発明の別の局面は、核酸をコードする単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体および/または選択された多量体のクローニングおよび発現を含む。従って、多量体ドメインは、当技術分野において周知の発現系を用いて単一のタンパク質として合成されうる。上記の多くのテキストに加えて、単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体および/または選択された多量体のような核酸を発現するのに関連性のあるベクター、プロモーターおよび多くの他のトピックスの使用を含め、本明細書において有用な分子生物学技術について記述する一般的なテキストは、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 第152巻、Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)；Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Mannual (第2版) 第1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al(編)., Current Protocols (Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.,の合弁事業) (1999年から補遺) (「Ausubel」)を含む。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Q-レプリカーゼ増幅およびその他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含めて、核酸をコードする単量体ドメインおよび多量体を同定する、単離するおよびクローニングする際に有用な、インビトロ増幅法によって当業者を導くのに十分な技術の例は、Berger、Sambrook、およびAusubel、ならびに
Figure 2008520207
の中で見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改良法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記述されている。PCRによって大きな核酸を増幅する改良法は、Cheng et al., (1994) Nature 369：684-685およびその中で引用されている参考文献に要約されており、その中では40 kbまでのPCRアンプリコンが作製されている。逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、本質的にどんなRNAでも制限消化、PCR伸長および配列決定に適した二本鎖DNAに変換できることを当業者は理解するであろう。Ausubel、SambrookおよびBerger、全て前記を参照されたい。
本発明は同様に、宿主細胞への本発明のベクターの導入、ならびに組換え技術による本発明の単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、免疫ドメイン、多量体および/または選択された多量体の産生に関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターとできる本発明のベクターを用いて遺伝的に操作される(すなわち、遺伝子導入される、形質転換されるまたは形質移入される)。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でありうる。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するのに、形質転換体を選択するのに、または関心対象の単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体および/もしくは選択された多量体の遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地中で培養されうる。温度、pHなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者には明らかであり、ならびに、例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 第3版, Wiley-Liss, New Yorkおよびその中で引用されている参考文献を含め、本明細書において引用される参考文献から明らかであろう。
前述のように、本発明のポリペプチドは同様に、植物、酵母、真菌、細菌などのような動物以外の細胞で産生されうる。実際に、全体にわたって述べたように、ファージディスプレイはそのようなポリペプチドを産生するのに特に関連した技術である。Sambrook、BergerおよびAusubelに加えて、細胞培養に関する詳細は、Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips (編) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)およびAtlas an Parks (編) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLの中で見出すことができる。
本発明は同様に、薬学的特性を改善するための、免疫原性を低減するための、または多量体および/もしくは単量体ドメインの細胞もしくは組織への輸送(例えば、血液脳関門を通して、もしくは皮膚を通して)を容易にするための、単量体ドメイン、免疫ドメインおよび/または多量体の改変を含む。これらの類の改変は、種々の修飾(例えば、糖基の付加またはグリコシル化)、PEGの付加、ある種のタンパク質(例えば、HSAまたはその他の血清タンパク質)を結合するタンパク質ドメインの付加、細胞へ、細胞からおよび細胞を通してシグナルを移動または輸送するタンパク質の断片または配列の付加を含む。さらなる成分を多量体および/または単量体ドメインに付加して、多量体および/または単量体ドメインの特性を操作することもできる。例えば、公知の受容体を結合するドメイン(例えば、Fc受容体を結合するFc-領域タンパク質ドメイン)、毒素または毒素の一部、多量体もしくは単量体ドメインを活性化するために選択的に切断されうるプロドメイン、レポーター分子(例えば、緑色蛍光タンパク質)、レポーター分子を結合する成分(放射線治療のための放射性核種、ビオチンもしくはアビジンなどの)または修飾の組合せを含めて、種々の成分を付加することもできる。
XI. さらなるスクリーニングの方法
本発明は同様に、以下の段階によって潜在的な免疫原性についてタンパク質をスクリーニングする方法を提供する：
候補タンパク質配列を提供する段階；
候補タンパク質配列をヒトタンパク質配列のデータベースと比較する段階；
データベース由来のヒトタンパク質配列の部分に相当する候補タンパク質配列の部分を同定する段階；および
候補タンパク質配列とデータベース由来のヒトタンパク質配列との間の一致の程度を判定する段階。
一般に、候補タンパク質配列とデータベース由来のヒトタンパク質配列の1つまたは複数との間の一致の程度が大きい程、データベース由来のヒトタンパク質配列のいずれとも一致性がほとんどない候補タンパク質に比べ、それだけ免疫原性の可能性が低くなると予測される。免疫原性のアミノ酸および/または配列の数の制限または除去を利用して、例えば、ライブラリーをスクリーニングする前に、またはした後に、単量体ドメインの免疫原性を低減させることもできる。免疫原性の配列は、例えば、HLA I型もしくはII型配列またはプロテアソーム部位を含む。これらのアミノ酸を同定するため、種々の市販の製品およびコンピュータプログラム、例えば、Tepitope (Roche)、Parker Matrix、ProPred-Iマトリックス、Biovation、Epivax、Epimatrixを利用することができる。
候補タンパク質をスクリーニングするための本発明の方法の実施に際して用いるのに適したヒトタンパク質配列のデータベースは、World Wide Webにてncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgiで見出すことができる(さらに、以下のウェブサイトを利用して、短い、ほぼ完全な適合を検索することができる：World Wide Webの
Figure 2008520207
)。この方法は、例えば、キメラ単量体ドメインなどの、キメラタンパク質中の交差配列が免疫原性による事象を引き起こす可能性が高いかどうかを判定する際に特に有用である。交差配列がヒトタンパク質配列のデータベースで見出される配列の部分に当たるなら、交差配列が免疫原性による事象を引き起こす可能性はいっそう低いと考えられる。
本発明の方法によって調製されたヒトキメラドメインライブラリーを、結合親和性に加えて、潜在的な免疫原性についてスクリーニングすることができる。さらに、データベース由来のヒトタンパク質配列の部分に関する情報を利用して、ヒト様キメラタンパク質のタンパク質ライブラリーをデザインすることができる。そのようなライブラリーは、天然のヒトタンパク質に存在する「交差配列」に関する情報を用いて作製することができる。「交差配列」という用語は、その全体が少なくとも1つの天然のヒトタンパク質に見られる配列であって、その配列の一部が2つまたはそれ以上の天然タンパク質に見られるものを本明細書においていう。すなわち、後者の2つまたはそれ以上の天然タンパク質の組換えは、配列のキメラ部分が別の天然タンパク質に見られる配列に実際に相当するキメラタンパク質を作製することができよう。交差配列は、第1および第2の天然のヒトタンパク質配列に見られるが、第3の天然のヒトタンパク質配列には見られない、種類と位置が同一のアミノ酸残基によって、第1のアミノ酸位置が占有される2つの連続したアミノ酸残基位置のキメラ接合部を含む。第2のアミノ酸位置は、第2および第3の天然のヒトタンパク質配列に見られるが、第1の天然のヒトタンパク質配列には見られない、種類と位置が同一のアミノ酸残基によって占有される。換言すれば、「第2の」天然のヒトタンパク質配列は、上記のように、交差配列がその全体において現れる天然のヒトタンパク質に相当する。
本発明によれば、ヒト様キメラタンパク質のライブラリーは、以下の段階によって作製される：同一ファミリーのタンパク質由来のタンパク質に相当するデータベース由来のヒトタンパク質配列を同定する段階；同一ファミリーのタンパク質由来のヒトタンパク質配列を参照タンパク質配列と整列させる段階；同一ファミリーの異なるヒトタンパク質配列に由来する部分配列のセットであって、それぞれが、異なる天然のヒトタンパク質配列に由来する少なくとも1つのその他の部分配列と同一性の領域を共有する部分配列を同定する段階；第1、第2、および第3の部分配列由来のキメラ接合部であって、それぞれの部分配列が異なる天然のヒトタンパク質配列に由来し、第1および第2の天然のヒトタンパク質配列に共通するが、第3の天然のヒトタンパク質配列には共通しないアミノ酸残基によって第1のアミノ酸位置が占有され、かつ第2および第3の天然のヒトタンパク質配列に共通するアミノ酸残基によって第2のアミノ酸位置が占有される2つの連続したアミノ酸残基位置を含むキメラ接合部を同定する段階；ならびにそれぞれ配列が部分配列のセット由来の2つまたはそれ以上の部分配列に相当し、かつそれぞれが、同定されたキメラ接合部の複数のうちの1つを含む、ヒト様キメラタンパク質分子を作製する段階。
すなわち、例えば、第1の天然のヒトタンパク質配列がA-B-Cであり、第2がB-C-D-Eであり、第3がD-E-Fであるなら、キメラ接合部はC-Dである。または、第1の天然のヒトタンパク質配列がD-E-F-Gであり、第2がB-C-D-E-Fであり、第3がA-B-C-Dであるなら、キメラ接合部はD-Eである。ヒト様キメラタンパク質分子は、種々の方法で作製することができる。例えば、キメラ接合部をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドを、配列が上記の部分配列のセット由来の2つまたはそれ以上の部分配列に相当するオリゴヌクレオチドと組換えて、ヒト様キメラタンパク質、およびそのライブラリーを作製することができる。天然のヒトタンパク質を整列させるのに使われる参照配列は、同一ファミリーの天然ヒトタンパク質由来の配列、またはファミリー内のタンパク質のキメラもしくはその他の変異体である。
XII. 動物モデル
本発明の別の局面は、単量体または多量体ドメインの免疫原性を試験するための特異的な非ヒト動物モデルの開発である。そのような非ヒト動物モデルを作製する方法は、レシピエント非ヒト動物の少なくとも一部の細胞に、同一ファミリーのタンパク質由来の複数のヒトタンパク質をコードする遺伝子であって、同一ファミリーのタンパク質由来の複数のヒトタンパク質を発現できる遺伝子組換え非ヒト動物が得られるよう、ベクターが導入される細胞の少なくとも一部において機能的であるプロモーターにそれぞれ機能的に連結されている遺伝子を含むベクターを導入する段階を含む。
本発明の実施に際して利用される適当な非ヒト動物は、ヒトを除く、全ての脊椎動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなど)を含む。典型的には、タンパク質ファミリーの複数のメンバーは、そのファミリーの少なくとも2種のメンバー、および通常は少なくとも10種のファミリーメンバーを含む。いくつかの態様において、複数はタンパク質ファミリーの全ての公知メンバーを含む。使用できる例示的な遺伝子は、例えば、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメイン、および本明細書において記述されるその他のドメインファミリーのメンバーなどの、単量体ドメインをコードするものを含む。
本発明の非ヒト動物モデルを用いて、非ヒト動物モデルにより発現される同一ファミリーのタンパク質に由来する単量体または多量体ドメインの免疫原性についてスクリーニングすることができる。本発明は、上記の方法によって作製された非ヒト動物モデル、ならびに同一ファミリーのタンパク質由来の複数のヒトタンパク質(本明細書において記述される単量体ドメインなどの)をコードするDNA分子であって、DNA分子がトランスジェニック非ヒト動物に胚形成期で導入されており、かつDNA分子が導入された細胞の少なくとも一部においてプロモーターにそれぞれ機能的に連結されているDNA分子を、体細胞および生殖細胞が含みかつ発現する、トランスジェニック非ヒト動物を含む。
Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメイン由来の結合タンパク質をスクリーニングするのに有用なマウスモデルの1例を以下のように記述する。野生型ヒトNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインをコードする遺伝子クラスターをPCRによってヒト細胞から増幅する。次に、これらの断片を用いて、上記の方法によりトランスジェニックマウスを作製する。このトランスジェニックマウスはヒトNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインを「自己」と認識し、従ってNotch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、インテグリンβ単量体ドメイン、またはCa-EGF単量体ドメインに関してはヒトの「自己性」を模倣するであろう。個々のNotch/LNR由来の単量体、DSL由来の単量体、Anato由来の単量体、インテグリンβ由来の単量体、またはCa-EGF由来の単量体または多量体は、Notch/LNR由来の単量体、DSL由来の単量体、Anato由来の単量体、インテグリンβ由来の単量体、またはCa-EGF由来の単量体または多量体をマウスに注射し、その後、引き起こされた免疫応答(または応答の欠如)を分析することにより、これらのマウスで試験される。マウスは、それらがマウス抗ヒト応答(MAHR)を発現したかどうかを判定するよう試験される。MAHRの発生を引き起こさない単量体および多量体は、ヒトに投与された場合、非免疫原性である可能性が高い。
歴史的に、トランスジェニックマウスでのMAHR試験は、その単一のタンパク質に関しトランスジェニックであるマウスにおいて個々のタンパク質を試験するのに用いられる。その一方、上記の方法は、ヒトタンパク質ファミリー全体を「自己」と認識する非ヒト動物モデルであって、それぞれ大幅に変化した結合活性や用途の能力がある大変多くの変異体タンパク質を評価するのに使用できる非ヒト動物モデルを提供する。
XIII. キット
本発明の方法において必要とされる成分(典型的には、混合していない形態で)およびキットの成分(包装材料、成分および/または方法を使用するための使用説明書、成分を保持するための1つまたは複数の容器(反応試験管、カラムなど))を含むキットは、本発明の特徴である。本発明のキットは、多量体ライブラリー、または単一の型のライブラリーを含むことができる。キットは同様に、検出可能に標識された分子を含め、検出を容易にする緩衝液または試薬などの、標的分子の結合を促進するのに適した試薬を含むことができる。単量体ドメインなどとのリガンドの結合を較正するための標準物質も本発明のキットの中に含むことができる。
本発明は同様に、商業的に価値のある結合アッセイおよびアッセイを実践するためのキットを提供する。本発明のアッセイのいくつかにおいて、1つまたは複数のリガンドが単量体ドメイン、免疫ドメインおよび/または多量体の結合を検出するために利用される。このようなアッセイは、単量体ドメインおよび/または多量体とのリガンドの結合を検出するため、当技術分野における任意の公知の方法、例えば、フローサイトメトリー法、蛍光顕微鏡法、プラズモン共鳴法などに基づく。
アッセイに基づくキットも提供される。キットは、典型的には、容器および1つまたは複数のリガンドを含む。キットは任意で、アッセイを行うための指示書、さらなる検出試薬、緩衝液、またはこれらの成分のいずれかの使用のための使用説明書などを含んでもよい。または、キットは、本発明の単量体ドメインおよび/または多量体の発現のための、細胞、ベクター(例えば、本発明のポリペプチドを含む、発現ベクター、分泌ベクター)を含むことができる。
さらなる局面において、本発明は、本明細書における任意の組成物、単量体ドメイン、免疫ドメイン、多量体、細胞、細胞培養物、装置、装置の成分もしくはキットの使用、本明細書における任意の方法もしくはアッセイの実践、および/または本明細書における任意のアッセイもしくは方法を実践するための任意の装置もしくはキットの使用および/または治療用処方物としての本明細書における細胞、細胞培養物、組成物もしくは他の特徴の使用を提供する。本明細書において記述される処置のための治療用処方物としての本明細書における全ての成分の製造も提供される。
XIV. 集積システム
本発明は、単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体および/または選択された多量体ならびにこのようなポリペプチドをコードする核酸に対応する文字列を含む、コンピュータ、コンピュータ読み取り可能な媒体および集積システムを提供する。これらの配列はインシリコ組換え方法により、または標準的な配列アライメントもしくは文章処理ソフトウェアにより操作することができる。
例えば、異なるタイプの類似性および種々のストリンジェンシーの考慮および文字列長は、本明細書における集積システムにおいて検出され認識されることができる。例えば、多くの相同性判定方法が、生体高分子の配列の比較分析のため、文章処理におけるスペルチェックのため、および種々のデータベースからのデータ検索のためデザインされてきた。天然のポリヌクレオチド中の4つの基本的な核酸塩基の間の二重らせん対相補体の相互作用の理解とともに、相補的な相同ポリヌクレオチド文字列のアニーリングを模擬するモデルを同様に、本明細書における配列に対応する文字列上で典型的に行われる配列アライメントまたはその他の操作(例えば、文章処理操作、配列または部分配列の文字列を含む図の構築、出力表など)の基礎として使用することができる。配列類似性を計算するのにGOを用いるソフトウェアパッケージの1例はBLASTであり、これは、本明細書における配列に対応する文字列を入力することによって本発明に適応させることができる。
BLASTはAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215：403-410に記述されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター(World Wide Webのncbi.nlm.nih.govで利用可能)を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に問合せ配列における長さWの短いワード(これは、データベース配列における同じ長さのワードと整列される場合、ある正の値の閾値スコアTに適合するか、それらを満たすかのいずれかである)を同定することによって、高スコア配列(HCP)ペアを同定する工程を包含する。Tは、隣接ワードスコア閾値という(Altschul et al., 前記)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始するための元として作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加されうる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM (適合残基の対に対する報酬(reward)スコア；常に＞0)およびパラメータN (ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコア付けマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xで減少する場合；1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが0もしくはそれ以下になる場合；または配列のいずれかの末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXは、アライメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)では、デフォルトとして11のワード長(W)、10の期待値(E)、100のカットオフ、M=5、N=-4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムでは、デフォルトとして3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915を参照のこと)を使用する。
有用な配列アライメントアルゴリズムのさらなる例は、PILEUPである。PILEUPは、進行的な、対のアライメントを用いて、関連する配列の群から複数の配列アライメントを作製する。これは同様に、アライメントを作製するために使用される集積した関連性を示す樹形図をプロットしうる。PILEUPでは、Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35：351-360の進行的なアライメント方法の単純化を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5：151-153によって記載される方法に類似する。プログラムは、例えば、最大長5000文字の300配列までを整列させることができる。複数のアライメント手順は、2つの整列した配列のクラスターを生成する2つの最も類似する配列の対のアライメントから始まる。次いで、このクラスターは、次に最も関連する配列または整列された配列のクラスターに整列されうる。2つの配列のクラスターは、2つの個々の配列の対のアライメントの単純な伸長によって整列されうる。最終的なアライメントは、一連の進行的な、対のアライメントによって達成される。このプログラムは同様に、集積した関連性の系統樹または樹形図をプロットするために使用されうる。このプログラムは、配列比較領域に対する特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定することで実行される。例えば、単量体ドメインファミリー中の保存アミノ酸を決定するためにまたはファミリー中の単量体ドメインの配列を比較するため、本発明の配列、またはコード核酸を整列させて、構造-機能情報を提供する。
1つの局面において、コンピュータシステムは、「インシリコ」の配列組換えまたは単量体ドメインに対応する文字列のシャッフリングを実行するために使用される。種々のこのような方法が、1999年2月5日付で出願された(米国特許出願第60/118854号)、SelifonovおよびStemmerの「Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics」ならびに1999年10月12日付で出願された(米国特許出願第09/416,375号)、SelifonovおよびStemmerの「Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics」に示されている。手短に言えば、遺伝子オペレーターが、例えば、突然変異、組換え、死などのような遺伝的現象を模倣することにより、所定の配列を変化させるよう遺伝的アルゴリズムにおいて使用される。配列を最適化するための多次元解析が同様に、例えば、'375出願において記述されるように、コンピュータシステムにおいて実行されうる。
デジタルシステムは同様に、オリゴヌクレオチド合成機に指示して、例えば、遺伝子再構築もしくは組換えに使われるオリゴヌクレオチドを合成することができ、または市販の供給源からのオリゴヌクレオチドを注文することができる(例えば、適切な注文フォームを印刷することによりもしくはインターネット上で注文フォームにリンクすることにより)。
このデジタルシステムは同様に、(例えば、配列または組換えのアライメント、例えば、本明細書において記述されるような、組換えられた単量体ドメインに基づき)核酸合成を制御するためのアウトプット要素を含むことができ、すなわち、本発明の集積システムは、任意でオリゴヌクレオチド合成機またはオリゴヌクレオチド合成制御装置を含んでもよい。このシステムは、アライメントの下流で発生するその他の操作または、例えば、アッセイに関して上で述べたように、本明細書中の配列に対応する文字列を使用して実行されるその他の操作を含むことができる。
実施例
以下の実施例は例証のために提供され、特許請求の範囲に記載されている発明を限定するために提供されるものではない。
実施例1
この実施例は、単量体ドメインの選択および多量体の作製について記述する。
単量体ドメインを同定するためのおよび選択された単量体ドメインから多量体を作製するための出発材料ならびに手順は、種々のヒト配列および/または非ヒト配列のいずれかより導き出すことができる。例えば、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する特異的結合を有する選択された単量体ドメインを産生するため、1つまたは複数の単量体ドメイン遺伝子が、特定のリガンドに結合する単量体ドメインのファミリーから選択される。1つまたは複数の単量体ドメイン遺伝子をコードする核酸配列は、ゲノムDNAもしくはcDNAのPCR増幅によって得ることができ、または任意で、重複するオリゴヌクレオチドを使用して合成的に産生されてもよい。
最も一般的には、次いで、これらの配列を、発現およびスクリーニングのため、細胞表面ディスプレイの様式(すなわち、細菌、酵母、または哺乳動物(COS)の細胞表面ディスプレイ；ファージディスプレイ)にクローニングする。組換え配列を、これらが発現され細胞表面にディスプレイされる適切な宿主細胞にトランスフェクト(形質導入または形質転換)する。例えば、細胞を、標識された(例えば、蛍光的に標識された)所望のリガンドで染色することができる。染色された細胞をフローサイトメトリーにより分別し、遺伝子をコードする選択された単量体ドメインを陽性細胞から回収する(例えば、プラスミド単離、PCRまたは増殖およびクローニングにより)。染色および分別の過程は反復の複数回とすることができる(例えば、所望のレベルの富化が得られるまで、所望のリガンドの漸進的な減少濃度を使用する)。あるいは、所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する細胞を同定するために使用されうる、当技術分野において公知の任意のスクリーニングまたは検出方法を利用することができる。
細胞を結合する所望のリガンドまたはリガンド混合物から回収された選択の単量体ドメインをコードする遺伝子は、本明細書においてまたは引用文献において記述される方法のいずれかによって任意で組換えられてもよい。次いで、多様化のこのラウンドにおいて産生された組換え配列を、所望のまたは標的のリガンドについて改善された親和性を有する組換え遺伝子を同定するために、同じまたは異なる方法によってスクリーニングする。多様化および選択の過程は、所望の親和性が得られるまで任意で反復されてもよい。
これらの方法によって選択された選択の単量体ドメイン核酸を、例えば、DNAライゲーションによる選択の単量体ドメインをコードする核酸配列のコンビナトリアルアッセンブリにより、または任意で、PCRに基づく、自己プライミング重複反応により、リンカー配列を介して一緒に連結して、多量体を作製することができる。次いで、多量体をコードする核酸配列を、発現およびスクリーニングのため、細胞表面ディスプレイの様式(すなわち、細菌、酵母、または哺乳動物(COS)の細胞表面ディスプレイ；ファージディスプレイ)にクローニングする。組換え配列を、これらが発現され細胞表面にディスプレイされる適切な宿主細胞にトランスフェクト(形質導入または形質転換)する。例えば、細胞を、標識された、例えば、蛍光的に標識された所望のリガンドまたはリガンド混合物で染色することができる。染色された細胞をフローサイトメトリーにより分別し、遺伝子をコードする選択された多量体を陽性細胞から回収する(例えば、PCRまたは増殖およびクローニングにより)。陽性細胞は選択された単量体ドメインに比べて、所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する、改善された結合活性もしくは親和性または変化した特異性を有する多量体を含む。染色および分別の過程は反復の複数回とすることができる(例えば、所望のレベルの富化が得られるまで、所望のリガンドまたはリガンド混合物の漸進的な減少濃度を使用する)。あるいは、所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する細胞を同定するために使用されうる、当技術分野において公知の任意のスクリーニングまたは検出方法を利用することができる。
細胞を結合する所望のリガンドまたはリガンド混合物から回収された選択の多量体をコードする遺伝子は、本明細書においてまたは引用文献において記述される方法のいずれかによって任意で組換えられてもよい。次いで、多様化のこのラウンドにおいて産生された組換え配列を、所望のまたは標的のリガンドについて改善された結合活性もしくは親和性または変化した特異性を有する組換え遺伝子を同定するために、同じまたは異なる方法によってスクリーニングする。多様化および選択の過程は、所望の結合活性もしくは親和性または変化した特異性が得られるまで任意で反復されてもよい。
実施例2
この実施例は、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合できる単量体ドメインの選択について記述する。
ファージの産生のため、大腸菌DH10B細胞(Invitrogen)に、pIIIファージタンパク質との融合体としてLDL受容体クラスAドメイン変異体のライブラリーをコードするファージベクターを形質転換した。これらの細胞を形質転換するため、エレクトロポレーションシステムMicroPulser (Bio-Rad)を、この同じ製造業者により供与されたキュベットとともに用いた。DNA溶液を細胞懸濁液100μlと混合し、氷上でインキュベートし、キュベット(電極ギャップ1 mm)の中に移した。パルス後、SOC培地(2 % w/vトリプトン、0.5 % w/v酵母抽出物、10 mM NaCl、10 mM MgSO4、10 mM MgCl2) 2 mlを加え、形質転換混合物を37℃で1時間インキュベートした。複数の形質転換物を混ぜ合わせて、20μg/mテトラサイクリンおよび2 mM CaCl2を含有する2×YT培地500 mlに希釈した。ライゲーション済みのDNA計10μgを用いた10回のエレクトロポレーションで、1.2×108個の独立したクローンが得られた。
Aドメイン変異体ファージのライブラリーをコードするファージベクターを形質転換した細胞を含有する培養物160 mlを22℃、250 rpmで24時間増殖させ、その後、無菌の遠心分離管に移した。細胞を遠心分離(15分、5000 g、4℃)によって沈降させた。ファージ粒子の入った上清を1/5容量の20 % w/v PEG 8000、15 % w/v NaClと混合し、4℃で数時間インキュベートした。遠心分離(20分、10000 g、4℃)の後、沈殿したファージ粒子を2 mM CaCl2の入った冷TBS (50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0) 2 mlに溶解した。溶液を氷上で30分間インキュベートし、1.5 mlの反応容器2本に分配した。溶解していない成分を除去するための遠心分離(5分、18500 g、4℃)の後、上清を新たな反応容器に移した。1/5容量の20 % w/v PEG 8000、15 % w/v NaClを加え、氷上で60分間のインキュベーションによって、ファージを再沈殿させた。遠心分離(30分、18500 g、4℃)および上清の除去後、沈殿したファージ粒子を2 mM CaCl2の入ったTBS計1 mlに溶解した。氷上で30分間のインキュベーション後、溶液を上記のように遠心分離した。ファージ粒子の入った上清を親和性濃縮に直接使用した。
ファージの親和性濃縮は96ウェルプレート(Maxisorp, NUNC, Denmark)を用いて行われた。シングルウェルを100μg/mlのヒト血清アルブミン(HSA, Sigma)のTBS溶液150μlとのインキュベーションによりRTで12時間コーティングした。HSAインキュベーション後に残存する結合部位は、RTで2時間2% w/vウシ血清アルブミン(BSA)のTBST (0.1 % v/v Tween 20入りのTBS) 250μlとのインキュベーションによって飽和された。その後、およそ5×1011個のファージ粒子を含有するファージ溶液40μlを3 % BSAおよび2 mM CaCl2の入ったTBST 80μlとRTで1時間混合した。結合していないファージ粒子を除去するために、ウェルを2 mM CaCl2の入ったTBST 130μlによって1分間5回洗浄した。
ウェル表面に結合したファージを0.1 Mグリシン/HCl pH 2.2 130μlとの15分間のインキュベーションにより、または500μg/mlのHSAのTBS液130μlを加えることにより競合的な方法で溶出させた。前者の場合、溶出液を1 M Tris/HCl pH 8.0 30μlと混合することで、ウェルからの除去後に溶出分画のpHをすぐに中性にした。
ファージの増幅のため、溶出液を用いて大腸菌K91BluKan細胞(F+)に感染させた。溶出したファージ溶液50μlを細胞の調製物50μlと混合し、RTで10分間インキュベートした。その後、20μg/mlのテトラサイクリンの入ったLB培地20 mlを加え、感染細胞を22℃、250 rpmで36時間増殖させた。その後、細胞を沈降させた(10分、5000 g、4℃)。上記のように沈殿によって上清からファージを回収した。ファージ粒子の反復親和性濃縮の場合、この実施例に記述されたのと同じ手順が使われた。HSAに対するその後2ラウンドのパニングの後、ランダムなコロニーをピックし、使われた標的タンパク質に対するその結合特性について試験した。
実施例3
この実施例は、HSAに結合できる単量体ドメインの生物活性の判定について記述する。
インビボでのタンパク質の血清中半減期を延長させるHSA結合ドメインの能力を示すために、以下の実験設定が行われた。HSAの結合について進化したAドメイン(実施例2参照)とストレプトアビジン結合Aドメインとからなる多量体のAドメインをストレプトアビジン結合Aドメインそれ自体と比較した。それらのタンパク質を、ヒト血清アルブミン(HSA)を負荷したまたは負荷していない(対照として)マウスに注射した。Aドメインタンパク質の血中レベルをモニターした。
それ故、HSAの結合について進化したAドメイン(実施例1参照)を標準的な分子生物学法により、ストレプトアビジン結合Aドメイン多量体と遺伝子レベルで融合させた(Maniatis et al.,を参照のこと)。Aドメイン多量体ならびにヘキサヒスチジンタグおよびHAタグをコードする、得られた遺伝子構築体を用いて、大腸菌においてタンパク質を産生させた。再折り畳みおよび親和性タグを介した精製の後、タンパク質を150 mM NaCl、5 mM Tris pH 8.0、100μM CaCl2に対して数回透析し、ろ過滅菌した(0.45μM)。
2セットの動物実験が行われた。第1のセットでは、2.5μMの濃度で調製された各タンパク質溶液1 mlを個々のマウスの尾静脈に注射し、注射から2、5および10分後に血清サンプルを採取した。第2のセットでは、前記のタンパク質溶液に50 mg/mlのヒト血清アルブミンを追加した。上記のように、動物1匹当たり各溶液1 mlを注射した。注射されたストレプトアビジン結合Aドメイン二量体の場合には、注射から2、5および10分後に血清サンプルを採取し、その一方で、三量体の場合には、血清サンプルを10、30および120分後に採取した。全ての実験は二つ組として行い、個々の動物を時点ごとにアッセイした。
血清サンプル中のAドメインの血中濃度を検出するために、酵素連結イムノソルベントアッセイ(ELISA)が行われた。それ故、マキシソープ96ウェルマイクロタイタープレート(NUNC, Denmark)のウェルを、2 mM CaCl2の入ったTBS中、各1μgの抗His6抗体を用いて4℃で1時間コーティングした。残存する結合部位をカゼイン(Sigma)溶液で1時間ブロッキングした後に、0.1 % Tweenおよび2 mM CaCl2を含有するTBSでウェルを3回洗浄した。血清サンプルの連続的濃度希釈液を調製し、Aドメインタンパク質を捕捉するために2時間ウェル中でインキュベートした。前記同様に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合している抗HAタグ抗体(Roche Diagnostics, 25μg/ml)を加え、2時間インキュベートした。前記同様に洗浄した後、HRP基質(Pierce)を加え、製造元の使用説明書にしたがって検出反応の発色を行った。血清サンプル中に存在するAドメインタンパク質の量を反映する光吸収を、450 nmの波長で測定した。得られた値を規準化し、時間的尺度に対してプロットした。
得られた値の評価から、HSAの存在なしで約4分、動物にHSAを負荷した場合にはそれぞれ5.2分の、ストレプトアビジン結合Aドメインの血清中半減期が示された。HSA結合Aドメインを含むAドメインの三量体では、HSAの存在なしで6.3分の血清中半減期が示されたが、HSAが動物に存在していた場合には38分の顕著に増大した半減期が示された。このことから明らかに、HSA結合Aドメインを融合パートナーとして用いて、タンパク質治療薬を含め、任意のタンパク質の血清中半減期を増加できることが示唆される。
実施例4
この実施例は、血中のタンパク質の半減期の延長を実証する実験について記述する。
本発明の単量体ドメインを用いてタンパク質の血中半減期を延長できることをさらに実証するため、サル血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒトIgG、およびヒト赤血球に対して選択された個々の単量体ドメインタンパク質をヘパリン添加ヒトまたはサル全血の一定分量に加えた。
以下の羅列は、この実施例で解析された単量体ドメインの配列を供与する。
Figure 2008520207
次いで、単量体タンパク質を含有する血液一定分量を個々の透析袋(25,000 MWCO)に加え、密封し、Tris緩衝生理食塩水4 L中にて室温で終夜撹拌した。
抗6×His抗体を96ウェルプレート(Nunc)との疎水性相互作用によって固定化した。各血液サンプルからの血清の連続希釈液をこの固定化抗体と3時間インキュベートした。プレートを洗浄して未結合タンパク質を除去し、α-HA-HRPでプローブして単量体を検出した。
透析実験において長い半減期を有すると同定された単量体は、HA、FLAG、E-Tag、またはmycエピトープタグのいずれかを含むように構築された。各タグに対しタンパク質1つを含有する、4つの単量体をプールして、2つのプールを作製した。
生理食塩水中2.5 mLの全容量中に0.25 mg/kg/単量体の用量で、1プールにつきサル1頭に皮下注射した。24、48、96、および120時間の時点で血液サンプルを採血した。抗6×His抗体を96ウェルプレート(Nunc)との疎水性相互作用によって固定化した。各血液サンプルからの血清の連続希釈液をこの固定化抗体と3時間インキュベートした。プレートを洗浄して未結合タンパク質を除去し、α-HA-HRP、α-FLAG-HRP、α-ETag-HRP、およびα-myc-HRPで別々にプローブして、単量体を検出した。
以下は市販の抗体と抗IgG多量体との間の比較を例証する。
Figure 2008520207
実施例5
この実施例は、「ウォーキング」によるタンパク質特異的な単量体ドメインおよび二量体の開発について記述する。
単量体ドメインをコードするDNA配列のライブラリーは、Stemmer et al., Gene 164：49-53 (1995)に記述されているようにアッセンブリPCRにより作製される。
PCR断片を適切な制限酵素(例えば、XmaIおよびSfiI)で消化した。消化産物を3%アガロースゲルで分離し、ドメイン断片をゲルから精製する。DNA断片をファージディスプレイベクターfuse5-HA、つまりインフレームのHA-エピトープを保有するfuse5の派生体の対応制限部位にライゲーションした。ライゲーション混合物をTransforMax(商標) EC100(商標)エレクトロコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレーションする。形質転換された大腸菌細胞を20μg/mlのテトラサイクリンと2 mM CaCl2の入った2×YT培地中37℃で終夜増殖させる。
ファージ粒子をPEG沈殿により培地から精製する。96ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorp)の個々のウェルを標的タンパク質(1μg/ウェル)の0.1 M NaHCO3液でコーティングする。10 mg/mlのカゼインを含有するTBS緩衝液でウェルをブロッキングした後、精製ファージを約1〜3×1011個の典型的な数で加える。マイクロタイタープレートを4℃で4時間インキュベートし、洗浄緩衝液(TBS/Tween)で5回洗浄し、結合した粒子をグリシン-HCl緩衝液pH 2.2の添加により溶出させる。溶出液を1 M Tris-HCl (pH 9.1)の添加によって中和する。ファージ溶出液を大腸菌K91BlueKan細胞によって増幅し、精製の後、第2および第3ラウンドの親和性選択に対する投入菌として用いる(上記の段階を繰り返す)。
最終溶出液からのファージを、精製なしで、DNA配列をコードするドメインをPCR増幅するための鋳型として直接的に用いる。
PCR産物を精製し、その後に適当な制限酵素で(例えば、BpmIで50%およびBsrDIで50%)消化する。
DNAライゲーションを利用して未処理ドメイン断片のライブラリーを付着させることで、消化された単量体断片を二量体に「ウォーキング」する。ドメインを増幅させるのに適したプライマーを用いた初期ドメインライブラリー(上記のPEG精製から得られた)のPCR増幅によって、未処理のドメイン配列を得る。PCR断片を精製し、2等分し、次に適当な制限酵素(例えば、BpmIまたはBsrDIのいずれか)で消化する。
消化産物を2%アガロースゲルで分離し、ドメイン断片をゲルから精製した。精製された断片を2つの別個のプール(例えば、未処理/BpmI + 選択/BsrDI & 未処理/BsrDI + 選択/BpmI)に組み合わせて、16℃で終夜ライゲーションする。
二量体ドメイン断片をPCR増幅し(5サイクル)、適当な制限酵素(例えば、XmaIおよびSfiI)で消化し、2%アガロースゲルから精製する。高親和性の結合剤を得るようさらにストリンジェントに行われる洗浄を除いて、スクリーニング段階を上記の通り繰り返す。感染後、K91BlueKan細胞を40μg/mlのテトラサイクリンの入った2×YT寒天プレートに蒔いて、終夜増殖させる。単一のコロニーをピックし、20μg/mlのテトラサイクリンと2 mM CaCl2の入った2×YT培地中で終夜増殖させる。ファージ粒子をこれらの培養物から精製する。
個々のファージクローンのその標的タンパク質との結合をELISAにより分析した。最大のELISAシグナルをもたらすクローンを配列決定し、その後、タンパク質発現ベクターに再クローニングした。
IPTGを用いて発現ベクターでタンパク質の産生を誘導し、そのタンパク質を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。タンパク質特異的な単量体を次のように特徴付ける。
ビアコア
250 RUのタンパク質をNHS/EDCカップリングによりCM5チップ(ビアコア)に固定化する。単量体タンパク質の0.5および5μM溶液を、誘導体化されたチップの一面に流し、標準的なビアコアソフトウェアパッケージを用いてデータを解析する。
ELISA
1ウェル当たりタンパク質10ナノグラムを96ウェルプレート(Nunc)との疎水性相互作用によって固定化する。プレートを5 mg/mLのカゼインでブロッキングした。単量体タンパク質の連続希釈液を各ウェルに加え、3時間インキュベートした。プレートを洗浄して未結合タンパク質を除去し、α-HA-HRPでプローブして単量体を検出した。
機能アッセイ
単量体の生物活性を判定する機能アッセイを同様に行うことができ、例えば、単量体の結合特異性を判定するアッセイ、単量体がその標的分子に結合することによって代謝経路を拮抗するかまたは刺激するかどうかを判定するアッセイなどを含むことができる。
実施例6
この実施例は、いっそう大きな多様性のライブラリーを作製するためのインビボでのタンパク質内組換えについて記述する。
オルソロガスなloxP部位が側面に位置した、単量体をコードするプラスミドベクター(pCKに由来するベクター；下記参照)をその適合するloxP部位を介してファージベクターとCre依存的に組換えた。組換え構築体に特異的なプライマーを用いたPCRにより、組換えファージベクターを検出した。DNA配列決定によって、的確な組換え産物が作製されたことが示唆された。
試薬および実験手順
pCK-cre-lox-Mb-loxP
このベクターは2つの特に関連のある特徴を有する。第1に、それはPlacの制御下に、部位特異的なDNAリコンビナーゼCreをコードするcre遺伝子を保有する。PCR産物の末端にXbaI (5')およびSfiI (3')を組み入れたcre特異的なプライマーを用いて、Creをp705-cre (GeneBridgesより)からPCR増幅した。この産物をXbaIおよびSfiIで消化し、pCK110919-HC-Bla (pACYC ori)のbla-、CmR派生体pCKの同一部位にクローニングし、pCK-creを得た。
第2の特徴は、2つのオルソロガスなloxP部位、つまりCreにより触媒される部位特異的なDNA組換えに必要なloxP(野生型)およびloxP(FAS)が側面に位置した未処理のAドメインライブラリーである。例えば、Siegel, R. W., et al., FEBS Letters 505：467-473 (2001)を参照されたい。これらの部位は稀にしか別のものと組み換わらない。loxP部位をpCK-creに逐次的に組み込んだ。loxP(WT)ならびに消化済みのEcoRIおよびHinDIII消化pCKへのライゲーションを可能にするEcoRIおよびHinDIII適合性の突出部を保有する、5'リン酸化オリゴヌクレオチドloxP(K)およびloxP(K_rc)をともにハイブリダイズし、標準的なライゲーション反応(T4リガーゼ；16℃で終夜)でpCK-creに連結した。
得られたプラスミドをEcoRIおよびSphIで消化し、loxP(FAS)ならびにEcoRIおよびSphI適合性の突出部を保有する、ハイブリダイズした5'リン酸化オリゴloxP(L)およびloxP(L_rc)に連結した。ライブラリー構築の準備をするため、pCK-cre-lox-P(wt)-loxP(FAS)の大量精製(Qiagen MAXIプレップ)をQiagenのプロトコルにしたがって行った。Qiagen精製プラスミドをさらに精製するためCsCl勾配遠心分離に供した。次いで、この構築体をSphIおよびBglIIで消化し、既存のAドメインライブラリープールのPCR増幅を介して得られた、消化済みの未処理Aドメインライブラリーインサートに連結した。デザインによって、loxP部位およびMbはインフレームであり、これによってloxPコードリンカーを有するMbが作製される。このライブラリーを下記に詳述されるようにインビボでの組換え手順で利用した。
fUSE5HA-Mb-lox-loxベクター
このベクターはGeorge Smithの研究室(ミズーリ大学)からのfUSE5の派生体である。これを次に免疫検出アッセイのためHAタグを保有するように修飾した。loxP部位をfUSE5HAに逐次的に組み込んだ。loxP(WT)、終止コドンの鎖ならびにXmaIおよびSfiI適合性の突出部を保有する、5'リン酸化オリゴヌクレオチドloxP(I)およびloxP(I)_rcをともにハイブリダイズし、標準的なライゲーション反応(New England Biolabs T4リガーゼ；16℃で終夜)でXmaIおよびSfiI消化済みのfUSE5HAに連結した。
得られたファージベクターを次にXmaIおよびSphIで消化し、loxP(FAS)ならびにXmaIおよびSphIと適合する突出部を保有する、ハイブリダイズしたオリゴloxP(J)およびloxP(J)_rcに連結した。この構築体をXmaI/SfiIで消化し、次いで予め切断(XmaI/SfiI)された未処理Aドメインライブラリーインサート(PCR産物)に連結した。終止コドンはloxP部位の間に位置しており、gIIIの発現ひいては、感染性ファージの産生を阻止する。
その次に、連結されたベクター/ライブラリーを、下記に詳述されるように、fUSE5HA-Mb-lox-loxファージのレスキューを可能にするgIII発現プラスミドを持つ大腸菌宿主に形質転換した。
pCK-gIII
このプラスミドはgIIIをその天然プロモーターの制御下に保有する。これはプライマーgIIIプロモーター_EcoRIおよびgIIIプロモーター_HinDIIIを用いてVCSM13ヘルパーファージ(Stratagene)からgIIIおよびそのプロモーターをPCR増幅することにより構築された。この産物をEcoRIおよびHinDIIIで消化し、pCK110919-HC-Blaの同一部位にクローニングした。gIIIはそれ自体のプロモーターの制御下にあるので、gIII発現は構成的であると推定される。pCK-gIIIを大腸菌EC100 (Epicentre)に形質転換した。
インビボ組換え手順
要約すれば、この手順は以下の重要な段階を含む：a) プラスミド由来のgIIIを発現する大腸菌宿主でのfUSE5HA-Mb-lox-loxライブラリーの感染体の産出(すなわち、レスキュー)；b) 第2次ライブラリー(pCK)のクローニングおよびF+ TG1大腸菌への形質転換；c) レスキューされたfUSE5HA-Mb-lox-loxファージライブラリーでの第2次ライブラリーを保有する培養物の感染。
a. ファージベクターのレスキュー
pCK-gIIIを保有するエレクトロコンピテント細胞を標準的なプロトコルにより調製した。これらの細胞は4×108/μg DNAの形質転換率を有しており、fUSE5HA-lox-loxベクターおよび未処理Aドメインライブラリーインサートの大量ラーゲーション物(ベクターDNA約5μg)でエレクトロポレーションされた。細胞液およそ70μL/キュベットでの個々のエレクトロポレーション(DNA 100 ng/エレクトロポレーション)の後、温かいSOC培地930μLを加え、37℃で1時間振盪させながら細胞を回復させた。次に、テトラサイクリンを終濃度0.2μg/mLまで加えて、細胞を37℃で約45分間振盪した。この培養物の一定分量を取り出し、10倍に連続的に希釈し、培養皿に蒔いて、得られたライブラリーサイズを判定した(1.8×107)。残存する培養物を2×500 mLの2×YT (pCK-gIIIおよびfUSE5HAに基づくベクターを選択するため、それぞれ、20μg/mLのクロラムフェニコールおよび20μg/mLのテトラサイクリンの入った)に希釈し、30℃で終夜増殖させた。
レスキューされたファージは標準的なPEG/NaCl沈殿プロトコルを用いて回収された。力価はおよそ形質導入単位1×1012/mLであった。
b. 第2次ライブラリーのクローニングおよび大腸菌宿主への形質転換
連結されたpCK/未処理Aドメインライブラリーを細菌F+宿主にエレクトロポレーションする。結果はおよそ108のライブラリーサイズと予想される。振盪しながらの37℃で1時間の回復時間の後、エレクトロポレーション細胞をOD600 約0.05まで2×YT (加えて20μg/mLのクロラムフェニコール)に希釈し、fUSEHA-Mb-lox-loxによる感染の前に37℃で対数増殖中期まで増殖させる。
c. レスキューされたfUSE5HA-Mb-lox-loxファージライブラリーでの第2次ライブラリーを保有する培養物の感染
組換え体の作製を最大限にするため、培養の間の大腸菌の高感染率(> 50%)が望ましい。大腸菌の感染性はF線毛の発現および増殖条件を含めて、いくつかの要因に依存する。大腸菌バックグラウンドTG1 (F'を保有する)およびK91 (Hfr菌株)が組換え系の宿主にあった。
オリゴヌクレオチド：
Figure 2008520207
実施例7
この実施例は標的との結合のための単量体および/またはリンカーの最適化による多量体の最適化について記述する。
図8は、三量体の多量体で例示される、標的との多量体の結合を最適化するための手法を例証する。図では、最初に単量体のライブラリーが標的(例えば、BAFF)との結合についてパニングされている。しかしながら、単量体の中には互いから遠く離れた、標的上の位置に結合しうるものもあり、その結果、これらの部位に結合するドメインは、リンカーペプチドによって連結されることができない。それ故、単量体の最適化の前にこれらの単量体由来のホモまたはヘテロ三量体の大きなライブラリーを作製し、スクリーニングすることが有用である。これらの三量体ライブラリーは、例えば、ファージ(単量体の大プールから作製されるヘテロ三量体の場合に典型的)にてスクリーニングされてもよく、または別々に作製およびアッセイされてもよい(例えば、ホモ三量体の場合)。この方法により、最良の三量体が同定される。アッセイとしては、標的との結合アッセイまたは機能的なタンパク質もしくは細胞に基づくアッセイでの多量体のアゴニストもしくはアンタゴニスト効力の判定を挙げることができる。
次に、最良な単一の三量体の単量体ドメインが第2段階として最適化される。ホモ多量体は、1つのドメイン配列しか存在しないので、最適化するのが最も容易であるが、ヘテロ多量体が合成されてもよい。ホモ多量体の場合、単量体と比べて多量体による結合の増加は、結合活性効果である。
ドメイン配列それ自体の最適化(例えば、組換えまたはNNKランダム化による)およびファージパニングの後、改善された単量体を用いて、リンカーライブラリーにより二量体を構築する。リンカーライブラリーは、例えば、NNK組成および/または可変の配列長を有するリンカーから形成されうる。
このリンカーライブラリーのパニングの後、最良のクローン(例えば、阻害の効力またはその他の機能アッセイによって判定された)を複数(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つなど)の配列最適化ドメインと長さおよび配列最適化リンカーとからなる多量体に変換する。
この方法を実証するため、多量体をBAFFとの結合について最適化する。BAFF結合クローンの抗BAFF2は、三量体としてまたは単量体としてほぼ等しい親和性でBAFFに結合する。三量体内の単量体を隔てるリンカー配列は、長さが4アミノ酸であり、これは異常に短い。単量体間のリンカー長の伸長は、三量体内の各単量体の複数の結合接触を可能にし、単量体分子に比べて三量体の親和性を大いに高めうることが提案された。
これを試験するため、リンカー配列のライブラリーを2つの単量体間で作製し、潜在的にいっそう高い親和性の二量体分子を作製する。次いで、同定された最適なリンカーモチーフを用いて、潜在的にさらに高い親和性の三量体BAFF結合分子を作製する。
これらのライブラリーは、長さが4から18アミノ酸まで変化するランダムコドンNNKからなる。これらのライブラリーのリンカーオリゴヌクレオチドは、以下である。
Figure 2008520207
これらの配列のライブラリーをPCRにより作製する。鋳型としてクローン抗BAFF2を用いたPCRでリンカーオリゴヌクレオチドとともに汎用プライマーSfiI
Figure 2008520207
を用いる。PCR産物をQiagen Qiaquickカラムで精製し、次にBsrDIで消化する。親の抗BAFF2クローンをBpmIで消化する。これらの消化物をQiagen Qiaquickカラムで精製し、ともにライゲーションする。このライゲーション物をSfiIプライマーおよびプライマーBpmI
Figure 2008520207
を用いた10サイクルのPCRによって増幅させる。Qiagen Qiaquickカラムを用いた精製の後、DNAをXmaIおよびSfiIで消化する。消化産物を3%アガロースゲルで分離し、二量体BAFFドメイン断片をゲルから精製する。DNA断片をファージディスプレイベクターfuse5-HA、つまりインフレームのHA-エピトープを保有するfuse5の派生体の対応制限部位にライゲーションする。ライゲーション混合物をTransforMax(商標) EC100(商標)エレクトロコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレーションする。形質転換された大腸菌細胞を20μg/mlのテトラサイクリンの入った2×YT培地中37℃で終夜増殖させる。ファージ粒子をPEG沈殿により培地から精製し、パニングに使用する。
実施例8
この実施例は、改善された機能を有する単量体ドメインを同定するためのドメイン内組換えについて記述する。
単量体配列を数段階のパニングと1段階の組換えにより作製して、CD40リガンドまたはヒト血清アルブミンのいずれかに結合する単量体を同定した。CD40LおよびHSAを3つの異なるAドメインファージライブラリーに対してパニングした。2ラウンドのパニング後、溶出されたファージプールを2セットのオリゴヌクレオチドでPCR増幅して、2つの重複断片を産生させた。次いで、この2つの断片をともに融合させ、ファージミドベクターpIDにクローニングして、2断片組換えの産物を融合させた。次いで、組換えライブラリー(各1010サイズ)を溶液中パニングとストレプトアビジン磁気ビーズ捕捉によりCD40LおよびHSA標的に対して2ラウンド、パニングした。
次いで、選択されたファージミドプールをタンパク質高発現のため、タンパク質発現ベクターpET、つまりT7ポリメラーゼ駆動ベクターに再クローニングした。大体1400個のクローンを標準的なELISAにより抗CD40L結合単量体についてスクリーニングし、約2000個のクローンをHSAについてスクリーニングした。全てのクローンはユニーク配列であった。
ELISAプレートのウェルをCD40L 0.2μgまたはHAS 0.5μgでコーティングし、単量体発現クローン溶菌液5μlを各ウェルに適用した。次いで、結合した単量体(これはヘマグルチニン(HA)融合体として産生された)を抗HA-HRP結合抗体により検出し、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素活性により発色し、450 nmのODで測定した。陽性クローンは、ELISA測定値を既存の三量体抗CD40L 2.2と比較することによって選択され、T7プライマーを用いて配列決定された。
抗CD40Lサンプルの場合、2つの抗CD40L 2.2Igクローンを選択の単量体クローンと同じプレートで増殖させ、陽性対照として並行して処理した。形質転換された2つの空のpETベクタークローンを増殖させ、陰性対照として処理した。OD450でのELISA測定値および対応するクローン配列を示す。
同じ選択およびスクリーニング過程をHSAに適用する。既存の抗HSA単量体および三量体を陽性対照として使用し、空のpETベクターを陰性対照として使用した。陽性の結合剤を抗HSA三量体と等しいまたは抗HSA三量体よりも良好なELISAシグナルを有するものとして選択した。
抗CD40L2.2Ig結合以上のOD450を有するクローンの陽性率は、およそCD40Lの場合0.7%およびHSAの場合0.4%であった。
同定された配列を以下に記載する。
Figure 2008520207
この実施例はLDL受容体Aドメインの使用を実証するが、同じ技術を用いて、本発明の単量体ドメインでの所望の結合特性を作製できることを当業者なら理解するであろう。
実施例9
この実施例は、所与の配列位置に天然のドメインで認められる残基のみを含む単量体を含むライブラリーのデザインおよび分析のための例示的な方法について記述する。この目的のため、所与のファミリーの全ての天然ドメインの配列アライメントを構築する。システイン残基はアライメントのうちの最も保存された特徴になりやすいので、これらの残基をさらなるデザインのためのガイドとして使用する。長さの変化による構造的変動性を考慮するため、2つのシステイン間の配列の各ストレッチを別々に検討する。各システイン間の配列に対し、長さのヒストグラムを構築する。公知のドメインにおいておよそ10%またはそれ以上の頻度で認められる長さをライブラリーデザインで用いるために検討する。別々の配列アライメントを各長さに構築し、部分アライメントにおいて所与の位置におよそ5%を超える頻度で現れるアミノ酸をその長さの最終的なライブラリーデザインで許容する。この過程を各システイン間の配列セグメントに対し繰り返して、最終的なライブラリーデザインを作製する。次いで、所望のタンパク質多様性を最適に発現するようデザインされた縮重コドンを有するオリゴヌクレオチドを合成し、標準的な方法を用いアッセンブルして、最終的なライブラリーを作製する。
典型的には、PCRアッセンブリのためセット1と2、セット2と3、およびセット3と4の間で9塩基の重複を有する4セットの重複オリゴヌクレオチドをデザインする。場合によっては、2セット間で9塩基の重複を有する2セットの重複オリゴヌクレオチドをデザインする。ライブラリーを以下のプロトコルで構築する。
オリゴヌクレオチド
各オリゴヌクレオチドの10μM希釈標準溶液を調製する。各セットに対し等モル量のオリゴを混合する(セット1、2、3および4)。オリゴヌクレオチドを2つのPCRアッセンブリ段階でアッセンブルする：第1ラウンドのPCRではセット1と2、およびセット3と4をアッセンブルし、第2ラウンドのPCRでは第1ラウンドのPCR産物を用いて、各ライブラリーの完全長をアッセンブルする。
PCRアッセンブリ-ラウンド1
以下のオリゴの対を用いて別々のPCR反応を行う：セット1 対 プールセット2の各オリゴ；セット2 対 プールセット1の各オリゴ；セット3 対 プールセット4の各オリゴ；セット4 対 プールセット3の各オリゴ。PCR反応混合物は容量が50μLであり、10×PCR緩衝液5μL、2.5 mM dNTPs 8μL、それぞれのオリゴおよびその対合オリゴプール5μL、LA Taqポリメラーゼ0.5μLならびに水26.5μLを含む。PCR反応条件は以下の通りである：[94℃/10秒、25℃/30秒、72℃/30秒]を18サイクルおよび[94℃/30秒、25℃/30秒、72℃/1分]を2サイクル。各PCR反応液5μLをTBE緩衝液中3%の低融点アガロースゲルで泳動して、予想されるPCR産物の存在を検証する。
PCRアッセンブリ-ラウンド2
全てのラウンド1 PCR産物をそれぞれのPCR反応液からの5μLとプールする。10×PCR緩衝液4μL、2.5 mM dNTPs 8μL、プールしたラウンド1 PCR産物10μL、LA Taq 0.5μLおよび水27.5μLを含む反応容量50μLならびに以下の反応条件を用いて、各ライブラリー骨格の完全長産物をPCRによりアッセンブルする：[94℃/10秒、25℃/30秒、72℃/30秒]を8サイクルおよび[94℃/30秒、25℃/30秒、72℃/1分]を2サイクル。
レスキューPCRおよびSfi消化
完全にアッセンブルされたライブラリー骨格をPCRにより増幅して、ライブラリー産生に十分な材料を作製する。4つの別々な50μLのPCR反応を行う。各反応混合物は10×PCR緩衝液2.5μL、2.5 mM dNTPs 8μL、ラウンド2 PCR産物25μL、LA Taq 0.5μL、10μMの5'および3'各レスキューPCRプライマー(表2) 5μL、ならびに水4μLを含む。反応条件は以下の通りである：[94℃/10秒、25℃/30秒、72℃/30秒]を8サイクルおよび[94℃/30秒、45℃/30秒、72℃/1分]を2サイクル。反応混合物5μLをTBE緩衝液中3%の低融点アガロースゲルで泳動して、増幅産物が的確なサイズであることを確認する。次いで、増幅産物をQIAGEN QIAquickカラムにより精製し、EB緩衝液に溶出し、Sfi消化ARI 2ベクターへのクローニングのためSfi制限酵素で消化する。アッセンブルされたライブラリー骨格20μgを全容量1,000μL中200単位のSfi制限酵素で、50℃にて3時間消化する。消化されたDNAをQIAGEN QIAquickカラムで精製し、水に溶出する。
試験ライゲーション
ライゲーションに最適なライブラリーインサート/ベクター比率を判定するため、Sfi消化ライブラリーインサートの各希釈系列(1/1、1/5、1/25、1/125および1/625) 1μLをSfi消化ARI 2ベクター1μL、T4 DNAリガーゼ1μL、10×リガーゼ緩衝液1μLおよび水7μLとともにライゲーションに用いる。ライゲーション反応混合物を室温で2時間インキュベートして、ライゲーション産物を作製する。ライゲーション産物1μLを0.1 cmキュベット中40μLのEC100細胞と混合し、氷上で5分間インキュベートし、これをエレクトロポレーションし、SOC 1 mL中37℃で1時間回復させる。各エレクトロポレーションに対し、希釈系列(1/1、1/10、1/100、1/1,000)の各5μLをテトラサイクリン入りの寒天プレートにスポットして、最適なインサート/ベクター比率を判定する。さらに、希釈液の各々の50μLを培養皿に蒔いて、ライブラリーQCのため単一のコロニーを増殖させる。
配列解析およびタンパク質発現
個々のクローンをピックし、96ウェルプレート中20μg/mLのテトラサイクリンの入った2×YT 0.4 mL中で終夜増殖させる。終夜増殖させた細胞を遠沈し、1/5希釈の上清0.5μLを用いて、配列決定用に5'および3'レスキュープライマーによりライブラリーインサートを増幅させる。DNA配列解析を利用して、予想されるライブラリーインサートの存在を検証する。タンパク質発現を調べるため、ライブラリーインサートをpEVE発現ベクターに移入する。終夜培養物からの選択クローンのプール上清0.5μLを、N末端のHAエピトープおよびC末端のHis8タグとインフレームであるSfi制限部位を有するPCRプライマーの対によって増幅させる。PCR反応混合物は以下を含む：ファージ(32上清のプール) 0.5μL、10×LA Taq緩衝液5μL、2.5 mM dNTPs 8μL、10μMのEGF Eve 5および10μMの3Sfi Nプライマー各5μL、ならびにLA Taqポリメラーゼ0.5μL。PCR反応条件は以下の通りである：[94℃/10秒、45℃/30秒、72℃/30秒]を23サイクルおよび[94℃/秒、45℃/30秒、72℃/1分]を2サイクル。増幅産物をQIAquickカラムにより精製し、Sfi酵素で消化し、Sfi消化pEVEベクターと製造元の仕様書にしたがい室温で2時間ライゲーションする。ライゲーション産物1μLをエレクトロポレーションによりBL21細胞40μLに形質転換し、カナマイシンプレートに蒔き、37℃のインキュベーター内で終夜増殖させる。コロニーをピックし、2×YT培地0.5 mL中で終夜培養する。翌日、終夜培養物50μLを2×YT培地1 mLに植菌し、OD600が約0.8に達するまで約2.5時間増殖させ、その時点で、タンパク質発現のためにIPTGを1 mMの終濃度まで加える。細胞を15分間3,600 rpmで遠沈し、ペレットをTBS/2 mM Ca++ 100μLに懸濁し、65℃で5分間加熱してタンパク質を放出し、15分間3,600 rpmで遠沈する。各クローン由来の上清を4〜12%のNuPAGEゲル、各10μLの還元剤(Invitrogen)有りまたは無しで泳動する。還元および非還元サンプル間のバンド位置の移動は、発現タンパク質が適切に折り畳まれている可能性が高いことを示唆する。
ライブラリースケールアップ
完全なライブラリーをARI 2にライゲーションし、EC100細胞に形質転換し、その後K91細胞で増幅させる。ライゲーションはSfi消化ベクター25μg、Sfi消化ライブラリーインサート2.5μg、T4 DNAリガーゼ5μL、および10×DNAリガーゼ緩衝液250μLを用い2.5 mLの最終容量中にて室温で終夜行う。ライゲーション産物を酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿し、水400μLに懸濁し、NaAc/EtOHで再沈殿し、H2O 50μLに再懸濁する。ライブラリーを、DNA 10μLおよびEC100細胞200μLを含む容器中でエレクトロポレーションし、SOC培地50 mLに移し、300 rpmで37℃にて1時間増殖させる。一定分量5μLを取り出し、(1) ライブラリーサイズを判定するために連続的に希釈し、(2) 配列検証のためにプレートアウトする。SOC 50 mL中の形質転換EC100を等分し、0.5のOD600を有するK91細胞の培養物500 mL 6つに加え、振盪せずに37℃で30分間インキュベートする。テトラサイクリンを濃度0.2μg/mLまで加え、培養物を300 rpmで37℃にて30分間増殖させる。最終的に、テトラサイクリンを終濃度20μg/mLまで加え、培養物を300 rpmで37℃にて終夜増殖させる。細胞を8,000 rpmで10分間遠心分離する。PEG 40 gおよびNaCl 30 g/1000 mLの添加、ならびに8,000 rpmで10分間の遠心分離により、上清中のファージを沈殿させる。ファージをTBS/2 mM Ca++ 50 mLに再懸濁し、5,000 rpmで10分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。上清に終濃度20%のPEGおよび1.5 MのNaClを加え、これを氷上に40分間置き、ファージを5,000 rpmで10分間遠沈し、TBS/2 mM Ca++ 10 mLに再懸濁する。ファージ力価を連続希釈により判定する。
実施例10
この実施例は、2セットの重複オリゴヌクレオチドを用いてライブラリーメンバーをアッセンブルしたことを除いては、上記の実施例9に記載の方法を利用したLNRドメイン由来ライブラリーのデザインおよび分析について記述する。
天然のLNRドメインの配列アライメントに基づき、天然のLNRドメインにおいてのみ見出されるアミノ酸を各位置に含むLNRドメインをコードする縮重オリゴヌクレオチドのパネルをデザインした。LNRライブラリーのデザインを以下に示す。
Figure 2008520207
縮重オリゴヌクレオチド配列を下記表に示す。
Figure 2008520207
NはA、T、G、またはCを表し： BはG、C、またはTを表し；DはG、A、またはTを表し；HはA、T、またはCを表し；KはGまたはTを表し；MはAまたはCを表し；RはAまたはGを表し；SはGまたはCを表し；VはG、A、またはCを表し；WはAまたはTを表し；およびYはTまたはCを表す。
次いで、オリゴヌクレオチドをPCRによってアッセンブルした。完全長の単量体ドメイン配列を、レスキューオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。完全長の配列をM13ファージのpIII遺伝子に挿入して、LNR単量体ドメインのライブラリーを作製した。ライブラリー由来の個々の12ファージをPCRにより増幅し、増幅産物を配列決定した。配列決定の結果から、ファージがライブラリーに対し予想されるサイズと配列のインサートを含むことが確認された。ライブラリーには、約47〜52アミノ酸を含む6.0×109個の単量体ドメインが含まれていた。配列決定の結果を下記表に示す。
Figure 2008520207
LNRライブラリー由来のクローンを、折り畳みタンパク質を産生するその能力について試験した。SDS-PAGEによって、これらのクローンが加熱溶解後に完全長の可溶性タンパク質を産生することが検証された。
実施例11
この実施例は、上記の実施例9に記載の方法を利用したDSLドメイン由来ライブラリーのデザインおよび分析について記述する。
天然のDSLドメインの配列アライメントに基づき、天然のDSLドメインにおいてのみ見出されるアミノ酸を各位置に含むDSLドメインをコードする縮重オリゴヌクレオチドのパネルをデザインした。DSLライブラリーのデザインを以下に示す。
Figure 2008520207
縮重オリゴヌクレオチド配列を下記表に示す。
Figure 2008520207
NはA、T、G、またはCを表し： BはG、C、またはTを表し；DはG、A、またはTを表し；HはA、T、またはCを表し；KはGまたはTを表し；MはAまたはCを表し；RはAまたはGを表し；SはGまたはCを表し；VはG、A、またはCを表し；WはAまたはTを表し；およびYはTまたはCを表す。
ライブラリー由来の個々の13ファージをPCRにより増幅し、増幅産物を配列決定した。配列決定の結果から、ファージがライブラリーに対し予想されるサイズと配列のインサートを含むことが確認された。ライブラリーには、約55アミノ酸を含む3.60×109個の単量体ドメインが含まれていた。配列決定の結果を下記表に示す。
Figure 2008520207
DSLライブラリー由来のクローンを、折り畳みタンパク質を産生するその能力について試験した。SDS-PAGEによって、これらのクローンが加熱溶解後に完全長の可溶性タンパク質を産生することが検証された。
実施例12
この実施例は、上記の実施例9に記載の方法を利用したanatoドメイン由来ライブラリーのデザインおよび分析について記述する。
天然のanatoドメインの配列アライメントに基づき、天然のanatoドメインにおいてのみ見出されるアミノ酸を各位置に含むanatoドメインをコードする縮重オリゴヌクレオチドのパネルをデザインした。anatoライブラリーのデザインを以下に示す。
Figure 2008520207
縮重オリゴヌクレオチド配列を下記表に示す。
Figure 2008520207
NはA、T、G、またはCを表し： BはG、C、またはTを表し；DはG、A、またはTを表し；HはA、T、またはCを表し；KはGまたはTを表し；MはAまたはCを表し；RはAまたはGを表し；SはGまたはCを表し；VはG、A、またはCを表し；WはAまたはTを表し；およびYはTまたはCを表す。
ライブラリー由来の個々の15ファージをPCRにより増幅し、増幅産物を配列決定した。配列決定の結果から、ファージがライブラリーに対し予想されるサイズと配列のインサートを含むことが確認された。ライブラリーには、57〜59アミノ酸を含む2.70×109個の単量体ドメインが含まれていた。配列決定の結果を下記表に示す。
Figure 2008520207
anatoライブラリー由来のクローンを、折り畳みタンパク質を産生するその能力について試験した。SDS-PAGEによって、これらのクローンが加熱溶解後に完全長の可溶性タンパク質を産生することが検証された。
実施例13
この実施例は、上記の実施例9に記載の方法を利用したインテグリンβドメイン由来ライブラリーのデザインおよび分析について記述する。
天然のインテグリンβドメインの配列アライメントに基づき、天然のインテグリンβドメインにおいてのみ見出されるアミノ酸を各位置に含むインテグリンβドメインをコードする縮重オリゴヌクレオチドのパネルをデザインした。インテグリンβライブラリーのデザインを以下に示す。
Figure 2008520207
縮重オリゴヌクレオチド配列を下記表に示す。
Figure 2008520207
NはA、T、G、またはCを表し： BはG、C、またはTを表し；DはG、A、またはTを表し；HはA、T、またはCを表し；KはGまたはTを表し；MはAまたはCを表し；RはAまたはGを表し；SはGまたはCを表し；VはG、A、またはCを表し；WはAまたはTを表し；およびYはTまたはCを表す。
ライブラリー由来の個々の32ファージをPCRにより増幅し、増幅産物を配列決定した。配列決定の結果から、ファージがライブラリーに対し予想されるサイズと配列のインサートを含むことが確認された。ライブラリーには、58〜65アミノ酸を含む2.84×109個の単量体ドメインが含まれていた。配列決定の結果を下記表に示す。クローン17および31は、ドメインインサートを含んでいないクローンと同定されたが、むしろ形質転換由来の空のベクターバックグラウンドに当たる。
Figure 2008520207
インテグリンβライブラリー由来のクローンを、折り畳みタンパク質を産生するその能力について試験した。SDS-PAGEによって、これらのクローンが加熱溶解後に完全長の可溶性タンパク質を産生することが検証された。
実施例14
この実施例は、ランダム化されたシステイン間のループを有するタンパク質からなるライブラリーを作製する例示的な方法について記述する。この実施例では、前述の別々のループ、別々のライブラリー手法とは対照的に、複数のシステイン間のループを同一ライブラリー内で同時にランダム化する。
以下のパターンを有する39〜45アミノ酸のタンパク質ドメインをコードするAドメインNNKライブラリーを構築した。
Figure 2008520207
ここで、
C1〜C6：システイン；
X(n)：各位置に任意の残基を有するnアミノ酸の配列；
E1〜E3：グルタミン；
F：フェニルアラニン；
R1〜R2：アルギニン；
A：アラニン；
G1〜G4：グリシン；
I：イソロイシン；
P：プロリン；
S1〜S3：セリン；
W：トリプトファン；
V：バリン；
D1〜D5：アスパラギン酸；ならびに
C1-C3、C2-C5およびC4-C6はジスルフィドを形成する。
ライブラリーは、Stemmer et al., Gene 164：49-53 (1995)に記述されるアッセンブリPCRにより、チロシンコドン(TAT)または可変の非保存コドン(NNK)を含有するDNA配列のライブラリーを作製することによって構築された。天然のAドメイン骨格およびライブラリーA1 (前述の)を構築するために使われたデザインに比べて、この手法では、1) これらの潜在的に重要な残基をランダム化する代わりに、より多くの既存の残基を適所において保持する、ならびに2) システイン間の残基の平均数が天然のAドメインまたはA1ライブラリーのそれを超えて伸びるように、全20種のアミノ酸(NNKコドン)の可変長のアミノ酸の鎖を挿入する。チロシンは、恐らくチロシンがなしうる多くの異なる接触のため、抗体結合部位において大きな比率を占めることが分かったので、オリゴヌクレオチドの中にチロシンコドンを含有させることによりチロシン残基の割合を増大させた。このPCR反応で使われたオリゴヌクレオチドは、以下である。
Figure 2008520207
ここでR=A/G、Y=C/T、M=A/C、K=G/T、S=C/G、W=A/T、B=C/G/T、D=A/G/T、H=A/C/T、V=A/C/G、およびN=A/C/G/T。
ライブラリーは、それぞれのプールが400 pmolのDNAを含有するオリゴヌクレオチドの4プールの混合物を用いた10サイクルのPCR増幅の初期ラウンドを通じて構築された。プール1にはオリゴヌクレオチド1〜9が含まれ、プール2には10〜17が含まれ、プール3には18だけが含まれ、プール4には19〜27が含まれた。完全にアッセンブルされたライブラリーは、プール1および4を用いたさらに8サイクルのPCRを通じて得られた。ライブラリー断片をXmaIおよびSfiIで消化した。DNA断片をファージディスプレイベクターfuse5-HA、つまりインフレームのHA-エピトープを保有するfuse5の派生体の対応制限部位にライゲーションした。ライゲーション混合物をTransforMax(商標) EC100(商標)エレクトロコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレーションし、2×109個の個別のクローンのライブラリーを得た。形質転換された大腸菌細胞を20μg/mlのテトラサイクリンの入った2×YT培地中37℃で終夜増殖させた。ファージ粒子をPEG沈殿により培地から精製し、1.1×1013/mlの力価が測定された。24クローンの配列を決定したところ、ライブラリーデザインの予想と一致していた。
前述の発明は明確化および理解の目的でいくぶん詳細に記述されているが、この開示を読むことで、形態および詳細の種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱することなくなされうることが当業者には明らかであろう。例えば、上述の全ての技術、方法、組成物、装置および系が種々の組合せで使用されうる。本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、またはその他の文書は、あたかも各々の個々の刊行物、特許、特許出願、またはその他の文書が、全ての目的で参照により組み入れられることが個別的に示されるのと同じ程度に、全ての目的でその全体が参照により組み入れられる。
リガンドに結合する単量体ドメインを同定する、選択された単量体ドメインを単離する、選択された単量体ドメインを種々の組合せで連結することによって選択された単量体ドメインの多量体を作製するおよび多量体をスクリーニングして、リガンドに結合する複数の単量体を含む多量体を同定する一般的なスキームを図解的に示す。 別の選択ストラテジーの略図である(誘導選択)。適切な結合特性を有する単量体ドメインを単量体ドメインのライブラリーから同定する。次いで、同定された単量体ドメインを単量体ドメインの別のライブラリー由来の単量体ドメインに連結させて、多量体のライブラリーを形成させる。多量体ライブラリーをスクリーニングして、標的に同時に結合する一対の単量体ドメインを同定する。その後、最適な結合特性が多量体で得られるまで、この過程を繰り返すことができる。 いっそう高い親和性で標的を結合する多量体を作製するためのウォーキング選択を図解する。 細胞上にディスプレイされた複数のリガンドに対する単量体ドメインのライブラリーのスクリーニングを図解する。 結合活性の増大のための単量体ドメインおよび多量体の態様を図解する。この図は特定の遺伝子産物および結合親和性を図解するが、これらは単なる例にすぎないことやその他の結合標的を同一のまたは類似の高次構造で使用できることを理解されたい。 結合活性の増大のための単量体ドメインおよび多量体の態様を図解する。この図は特定の遺伝子産物および結合親和性を図解するが、これらは単なる例にすぎないことやその他の結合標的を同一のまたは類似の高次構造で使用できることを理解されたい。 本発明の種々の可能な抗体-単量体または多量体の高次構造を図解する。いくつかの態様において、単量体または多量体が抗体のFab断片に置き換わる。 単量体のドメイン内最適化の方法を図解する。 考えられる多量体最適化段階の順序を図解しており、その段階では最適な単量体その後に多量体が選択され、続けて単量体の最適化、リンカーの最適化その後に多量体の最適化が行われる。 単量体および/または多量体ライブラリーを組換えて、新たな変異を導入する4つの例示的な方法を図解する。図10Aは、異なる単量体の部分が組換えられて新たな単量体を生ずる、単量体のドメイン内組換えの1つの例示的な態様を図解する。図10Bは、図10Aに記載されるように組換えられた単量体の部分がさらに組換えられて、さらに新しい単量体を生ずる、ドメイン内組換えの第2の態様を図解する。図10Cは、組換えられた異なる単量体が互いに連結されて、すなわち多量体を生ずる、ドメイン間組換えの1つの態様を図解する。図10Dは、同じ標的分子に結合する連結済みの組換え単量体、すなわち多量体が、異なる標的分子を認識するその他の組換え単量体に連結されて、異なる標的分子に同時に結合する新たな多量体を生ずる、モジュール間組換えの1つの態様を図解する。 半減期延長分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインおよびその他2つの異なる分子に結合するその他の単量体ドメインを含む、本発明の多量体の考えられる高次構造を描く。この図では、2つの単量体ドメインが第1の標的分子に結合し、別の単量体ドメインが第2の標的分子に結合する。

Claims (37)

  1. 以下の段階を含む、標的分子に結合する単量体ドメインを同定する方法：
    a) 単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、非天然の単量体ドメインのライブラリーを提供する段階であって、
    ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、段階;
    b) 第1の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階；ならびに
    c) 少なくとも1つの標的分子に結合する少なくとも1つの単量体ドメインを同定する段階。
  2. 少なくとも1つの単量体ドメインが、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されない標的分子に特異的に結合する、請求項1記載の方法。
  3. Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
    DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項1記載の方法。
  4. Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつ式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  5. Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
    Figure 2008520207
    請求項1記載の方法。
  6. 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
    同定された単量体ドメインを第2の単量体ドメインに連結させて、各々が少なくとも2つの単量体ドメインを含む多量体のライブラリーを形成する段階;
    第1の標的分子に結合する能力について多量体のライブラリーをスクリーニングする段階；および
    第1の標的分子に結合する多量体を同定する段階。
  7. 選択された多量体の各単量体ドメインが同じ標的分子に結合する、請求項6記載の方法。
  8. 選択された多量体が3つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
  9. 選択された多量体が4つの単量体ドメインを含む、請求項6記載の方法。
  10. 少なくとも1つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異した単量体ドメインを含むライブラリーを提供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  11. 突然変異させる段階が、ポリペプチドドメインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの、複数のポリヌクレオチド断片を組換える段階を含む、請求項10記載の方法。
  12. 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
    第2の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリーをスクリーニングする段階;
    第2の標的分子に結合する単量体ドメインを同定する段階;
    第1の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインを、第2の標的分子に対する親和性を有する少なくとも1つの単量体ドメインと連結させ、それによって第1および第2の標的分子に対する親和性を有する多量体を形成する段階。
  13. 単量体ドメインのライブラリーがファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは細胞表面ディスプレイとして発現される、請求項1記載の方法。
  14. 単量体ドメインのライブラリーがマイクロアレイ上に提示される、請求項1記載の方法。
  15. 標的分子が、非天然の単量体ドメインと少なくとも90%同一である天然の単量体ドメインによって結合されず、
    非天然の単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択される、
    標的分子に特異的に結合する単量体ドメインを含む、非天然のタンパク質。
  16. 単量体ドメインが少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
  17. 単量体ドメインが少なくとも3つのジスルフィド結合を含む、請求項15記載のタンパク質。
  18. 単量体ドメインがイオンを結合する、請求項15記載のタンパク質。
  19. イオンがカルシウムである、請求項18記載のタンパク質。
  20. 単量体ドメインが30〜100アミノ酸長である、請求項15記載のタンパク質。
  21. Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、請求項15記載のタンパク質。
  22. Notch/LNR単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成し；ならびに
    DSL単量体ドメインのC1-C5、C2-C4およびC3-C6がジスルフィド結合を形成する、請求項15記載のタンパク質。
  23. Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    および式中αがw、y、f、およびlからなる群より選択され；βがv、I、l、a、m、およびfからなる群より選択され；χがg、a、s、およびtからなる群より選択され；δがk、r、e、q、およびdからなる群より選択され；εがv、a、s、およびtからなる群より選択され；ならびにφがd、e、およびnからなる群より選択される、請求項15記載のタンパク質。
  24. Ca-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつインテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含む：
    Figure 2008520207
    請求項23記載のタンパク質。
  25. 単量体ドメインが異種アミノ酸配列に融合される、請求項15記載のタンパク質。
  26. 異種アミノ酸が、異種リンカーによって第1の単量体ドメインに連結された第2の単量体ドメインである、請求項25記載のタンパク質。
  27. 第1の単量体ドメインが第1の標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが第2の標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
  28. 第1の単量体ドメインが第1の部位で標的分子を結合し、第2の単量体ドメインが異なる部位に標的分子を結合する、請求項26記載のタンパク質。
  29. 単量体ドメイン単独の結合活性と比較して標的分子に対する改善された結合活性を有する、請求項26記載のタンパク質。
  30. 単量体ドメインがポリペプチドリンカーによって連結される、請求項26記載のタンパク質。
  31. 請求項15記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  32. 請求項31記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
  33. 単量体ドメインが、Ca-EGF単量体ドメイン、Notch/LNR単量体ドメイン、DSL単量体ドメイン、Anato単量体ドメイン、およびインテグリンβ単量体ドメインからなる群より選択され、
    ここでCa-EGF単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Notch/LNR単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    DSL単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    Anato単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    インテグリンβ単量体ドメインが以下の配列を含み：
    Figure 2008520207
    かつ式中「x」が任意のアミノ酸である、非天然の単量体ドメインを含むタンパク質のライブラリー。
  34. 多量体の各単量体ドメインが非天然の単量体ドメインである、請求項33記載のライブラリー。
  35. ライブラリーが、リンカーによって連結された少なくとも2つの単量体ドメインを含む複数の多量体を含む、請求項33記載のライブラリー。
  36. ライブラリーが、異なる単量体ドメインを含む少なくとも100種の異なるタンパク質を含む、請求項33記載のライブラリー。
  37. 請求項33記載のタンパク質のライブラリーをコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
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