CN101629165A - 脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原始间充质干细胞的制备方法，它是采用人新鲜脐带，提取华通胶，经胶原酶消化后分离培养而成，适于冷冻保存。本发明还涉及按上述方法制备的原始间充质干细胞，按照国际细胞疗法协会制订的标准进行生物学表型鉴定确认为间充质干细胞。其增殖能力、纯度均高于骨髓间充质干细胞；释放的生长因子、细胞因子量明显高于骨髓间充质干细胞。

Description

脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带华通胶(Wharton’jelly)为材料制备间充质干细胞的方法及其产品。

背景技术

当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，在研究和应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，胚胎干细胞的应用存在伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；自体骨髓单个核细胞存在成分复杂，具有多向分化潜能的干细胞含量低，分化潜能有限等问题；自体骨髓MSCs来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降，体外长期扩增降低体内分化归巢潜能。

与自体MSCs相比，脐血、脐带、胎盘MSCs来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，无社会、伦理和法律方面的争议，但脐血源MSCs分离效率低，限制了其在细胞治疗和组织工程中的广泛应用；脐带、胎盘分离细胞纯度低，常混有血管内皮细胞临床不能应用。

以上表明，当前尚无一种理想的种子细胞满足临床需求，需要扩展多能干细胞的来源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种材料来源易得，培养时间较短的间充质干细胞制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的自我更新及多向分化潜能，而且易于冷冻保存。

实现本发明目的的技术方案为，采用胎儿脐带的一种特殊组织——华通胶(Wharton胶)为原材料制备间充质干细胞，称为脐带华通胶间充质干细胞(Umbilical Cord Wharton’s Jelly-Derived MSCs，UW-MSCs)。UW-MSCs制备方法为：取人新鲜脐带，以等渗平衡盐溶液或无血清培养基溶液洗去脐带残留血液，去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取华通胶并剪切成块，再以等渗平衡盐溶液或无血清DMEM培养基溶液(Dulbecco’s modification of Eagle’s mediumDulbecco)冲洗后，浸泡于0.05～0.3％胶原酶溶液中，置35～37.5℃温箱中10～30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1～10倍量的含胎牛血清培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CO₂培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2～4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2～4代，即时使用或冷冻保存备用。

用以清洗脐带残血和用以冲洗华通胶组织块所用的等渗平衡盐溶液包括D-Hank平衡液、0.9％氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)。

清洗脐带残血所用液体优选D-Hank平衡液；冲洗华通胶组织块所用液体优选无血清DMEM培养基溶液。

作为优化，将清洗后的脐带剪切成长度为2～10cm的节段，进入下一工序。

作为优化，将剥取出的脐带华通胶剪切成不大于2mm³的组织块，进入下一工序。

作为优化，培养基中胎牛血清的浓度为5～30％。

对于按本发明上述方法培养制备的干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制订的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征：

①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿成纤维样生长；

②表达CD90、CD105、CD44、CD73，HLA-ABC；不表达CD45、CD34、CD80、CD86，HLA-DR；

③体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。

脐带华通胶是位于脐带动脉、静脉与表皮之间的胶状间质组织，未见前人将其用于间充质干细胞的培养。上述鉴定结果表明本发明从脐带间质华通胶中分离的干细胞属于间充质干细胞，而不含造血干细胞。上述技术特征可以作为本发明方法所制得的间充质干细胞产品合格标准。

按本发明方法制得的间充质干细胞(UW-MSCs)与骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)相比较，原代细胞培养时间从10-12天缩短为5-6天；按本发明方法制得的MSCs增殖能力、纯度均高于BMSCs；释放的生长因子、细胞因子量明显高于BMSCs，包括干细胞因子、粒细胞集落因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-β、白介素-8等，显示了更多的医药用途。

鉴于本发明采用的是同种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。较之自体BMSCs，异基因种子细胞移植的关键问题是移植免疫学问题。为此本发明进行了***的UW-MSCs体内外免疫源性鉴定。结果为：

体外观察：以流式细胞仪进行UW-MSCs免疫表型鉴定，UW-MSCs仅表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗原HLA-DR及协同刺激抗原CD80，CD86，表明UW-MSCs体外无免疫源性。

UW-MSCs移植后整体免疫学观察：①动态混合淋巴细胞培养试验发现UW-MSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应功能；②外周血T细胞亚群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8变化，UW-MSCs均无刺激增加；③局部组织病理学检测：光镜检测UW-MSCs移植区域组织未见淋巴细胞、巨噬细胞增殖浸润等组织免疫反应性变化。

按本发明方法制备的原始干细胞因其所用材料来源和成品细胞的性能，可以解决在干细胞应用领域目前困扰医学界的多项难题，例如：①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；②成体干细胞存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等种种缺陷。

附图说明

图1是原代细胞粘壁后至80％融合所见细胞形态图。其中，A为第1天细胞形态；B为第3天细胞形态；C为第6天细胞形态。

图2是III代UW-MSCs流式细胞仪检测不同表型细胞含量图。

图3是III代UW-MSCs体外诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞形态图。其中，A为碱性磷酸酶染色；B为莤素红染色；C为油红“0”染色。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1～6

以下列举6个实施例，本发明的实施方法并不限于这6种。对于实施过程中部分可选择的实验材料的选用、部分可调整的工艺技术参数的实际应用，以及各实施例所得成品部分检测指标列表如下。

综合上表所列内容，按本发明方法，采用人脐带华通胶制备原始间充质干细胞的工艺步骤如下：

(一)材料选取：选择包括乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体免疫4项阴性，准备行剖腹产的健康孕妇。在剖腹产手术时截取脐带，速置D-Hank平衡液中送至细胞培养室，在超净台内对脐带进行处理。

(二)材料预处理：以D-Hank平衡液或0.9％氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、无血清培养基任何一种液体充分洗去脐带上残留的血液。

将清洗后的脐带剪切成长度为2～10cm的节段，将每个节段去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取华通胶并剪切成不大于2mm³的组织块，以无血清DMEM培养液(Dulbecco’s modified Eagle mediia)或D-Hank平衡液、0.9％氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液任何一种液体对华通胶组织块进行冲洗。

其中，清洗脐带残血所用液体优选D-Hank平衡液；冲洗华通胶组织块所用液体优选无血清DMEM培养基溶液。

(三)组织块消化：将冲洗干净的华通胶组织块置于0.05～0.3％胶原酶溶液中进行消化。I～IV型胶原酶均可使用，优选II型胶原酶。胶原酶的用量至少能浸没华通胶组织块。然后置于35～37.5℃温箱中10～30小时，华通胶组织块被消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1～10倍量含胎牛血清的培养基终止消化。培养基中胎牛血清的浓度为5～30％。分装于培养瓶或培养皿。

(四)细胞培养：将装有华通胶消化物的培养瓶或培养皿置CO₂培养箱培养。待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2～4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养。传代培养2～4代，为成品脐带华通胶原始间充质干细胞，即时使用或冷冻保存备用。

对各实施例所获得的2～4代UW-MSCs分别进行鉴定检测，鉴定检测项目包括

1.形态学观察：细胞贴壁成纤维样生长。

2.生物学表型鉴定：按国际细胞疗法协会(ISCT)2007年规定标准进行鉴定。

①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿成纤维样生长；(如图1所示)

②表达CD90、CD105、CD44、CD73、HLA-ABC。它们的含量均超过90％；(如图2所示)不表达CD45、CD34、CD80、CD86，HLA-DR。它们的含量均在3％以下。

③体外诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞，碱性磷酸酶染色、莤素红染色、油红“0”染色均为阳性。(如图3所示)

以上鉴定结果表明按本发明方法从脐带间质Wharton胶中分离的干细胞属于MSCs，而不含造血干细胞。

3.安全指标检测：对各实施例所获得的2～4代UW-MSCs分别进行安全指标检测，包括①细菌培养；②病毒检测；③支原体检测；④包括乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体在内的免疫学检测。所有批次该四项检测均为阴性。

Claims (7)

1.一种原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法制备的：

取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基溶液洗去脐带残留血液，去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取华通胶并剪切成块，再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基溶液冲洗后，浸泡于0.05～0.3％胶原酶溶液中，置35～37.5℃温箱中10～30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1～10倍量的含胎牛血清培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CO₂培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2～4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2～4代，即时使用或冷冻保存备用。

2.根据权利要求1所述的原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所用脐带材料取自经剖腹产的胎儿，并且生产该胎儿的产妇为乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体免疫4项阴性的健康孕妇。

3.根据权利要求1所述的原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将清洗残血后的脐带剪切成长度为2～10cm的节段，进入下一工序。

4.根据权利要求1所述的原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，用于清洗残血和冲洗华通胶组织块的等渗平衡盐溶液是D-Hank平衡液、0.9％氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液中任何一种。

5.根据权利要求1所述原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，用于消化华通胶组织块的胶原酶为I～IV型胶原酶中任何一种。

6.根据权利要求1所述原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，细胞培养基中胎牛血清的浓度为5～30％。

7.按权利要求1～6任一权利要求所述方法制备的间充质干细胞，在生物学表型鉴定中，具有以下技术特征：

①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿成纤维样生长；

②表达CD90、CD105、CD44、CD73，HLA-ABC；不表达CD45、CD34、CD80、CD86，HLA-DR；

③体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。

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