具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。
实施例1:花生Rab7基因及其在提高花生耐盐性中的应用
一、实验材料
1.基因、菌种与水稻品种
本发明克隆了花生Rab7基因(AhRab7),大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存、根癌农杆菌菌株EHA105(购自北京天恩泽基因科技有限公司),转基因的受体材料为花生品种 “徐州68-4” (青岛农业大学遗传研究室实验室提供)。
2.植物培养基
花生转化中采用的培养基有:
基本培养基:为MS无机盐+B5有机成分(简称MSB5),添加3%蔗糖、0.8%琼脂,pH=5.8,在121℃、105Kpa条件下灭菌20min;
SIM诱导培养基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4-D;
SEM芽伸长培养基:MSB5+5 mg/L BAP。
二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤:
1、AhRab7基因植物表达载体的构建
(1)扩增AhRab7基因
克隆所述花生AhRab7基因的引物名称与序列如下:
P1 (5- TGCTTTGATTTGAGGAGGAC-3)(SEQ ID No:4);
P2 (5- ATATCTCAGCATTCACAACC -3)(SEQ ID No:5),
P1和P2分别与AhRab7基因第1-20碱基、第3235-3254碱基对应。
花生品种“徐州68-4” 由青岛农业大学遗传研究室实验室提供,通过RT-PCR扩增了AhRab7基因的编码区(其序列表如SEQ ID No:3所示)。
P3 (5-GGTACCCATGCCTTCCAGAAGAAGAAC-3) (KpnI) (SEQ ID No:6);
P4 (5-GAGCTCATCTCAGCATTCACAACCTGT-3) (SacI) (SEQ ID No:7);
上述引物序列分别与AhRab7基因第1-20碱基、第3235-3254碱基对应。
将AhRab7基因克隆后,测序结果表明该基因有7个外显子, 分别对应的碱基为173-225,554-580,743-842,1611-1757,1860-1940,2099-2244,3167-3249;该基因编码产生的氨基酸序列中有GTP结合结构域/水解结构域,分别对应的氨基酸残基为15-22,62-66,124-128,156-160。
(2) AhRab7基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接
回收PCR产物,并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒,用KpnI和SacI进行双酶切,回收含AhRab7基因的酶切片段,并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中,获得该基因的植物表达载体pBI121-AhRab7。
3、将表达载体转化花生,包括以下步骤:
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备:将pBI121-AhRab7重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞,筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落,接种到YEB(利福平 50mg/L,卡那霉素 50mg/L)液体培养基中,28℃、180rpm培养至OD600=0.5~0.8时,取2mL菌液转移到50mL YEB(利福平50mg/L,卡那霉素 50mg/L)培养基中,培养到OD600=0.6~0.8。将菌液于5000rpm离心15min后,用相同体积的液体MSB5悬浮备用。
b、花生胚小叶外植体的分离:选取饱满的花生种子,在70%酒精中浸泡1min,0.1%升汞浸泡20min,无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴,将每片子叶纵向切成2半。
c、农杆菌介导的遗传转化:切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中,28℃、90rpm温和震荡侵染10min,用无菌滤纸将残留菌液吸干,接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250 mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基,将外植体切口端嵌入培养基,培养2w左右,诱导丛生芽,培养条件:光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。
将形成丛生芽的外植体转移外到250 mg/L头孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽,培养2w,培养条件:光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。
培养2w后,切下不定芽部分转移到250 mg/L头孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培养基上,进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长,培养4w左右,期间继代培养2-3次(如图1所示)。
4、转基因植株的PCR检测
提取再生植株的基因组DNA,利用上述载体序列和AhRab7基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为:95℃、5min;95℃、50s,56℃、50s,72℃、1 min,30个循环;72℃、10min。转基因植株PCR阳性率达到20.1%。
5、转基因阳性植株的嫁接移栽
以12-15d苗龄的“花育23”无菌实生苗为砧木,切除距子叶节约 2cm 以上的主茎部分,用手术刀将砧木上端垂直劈开,切口深约 0.5-1cm。当T0代转基因植株幼苗长到约2-3cm时,从芽丛基部切下再生小苗做接穗,下端切成长约 0.5-1cm 的 V形伤口,切口平整。将接穗***砧木中,使砧木和接穗的形成层紧密接触,然后用封口膜缠绕接口,松紧适度。将嫁接苗置于MSB5培养基中无菌培养3-4d;然后移栽于灭菌的育苗基质中(包括蛭石、草炭土和珍珠岩)进行驯化3w,之后移栽到田间。转基因植株在田间生长情况表现正常。
6、T1代转基因植株耐盐性筛选
取T1代种子,进行催芽壮苗处理获得T1代幼苗。处理方法是:先在37℃条件下催芽3d;出完芽后进行壮苗,在24℃,14h光照∕10h黑暗的条件下培养15d。取T1代幼苗叶片,浸在200mM的NaCl溶液中处理1w,以未转基因的徐州68-4幼苗叶片为对照。对照叶片萎蔫变黄,叶绿素含量下降明显;部分转基因植株叶片较绿,叶绿素含量变化不大(如图2所示)。
为进一步分析转基因植株的耐盐性,将得到的 T1代幼苗先用3-5‰的NaCl溶液处理,逐渐提高NaCl溶液浓度,最后用12‰的NaCl溶液处理,进行耐盐性筛选时以未转基因的徐州68-4为对照。有3个独立来源的转植株幼苗在12‰的NaCl溶液处理下生长基本正常,而对照植株萎蔫(如图3所示),所以这3个转基因植株的抗盐浓度为12‰或以上。
实施例2、花生Rab7基因在提高大肠杆菌耐盐性中的应用
一、实验材料
1、菌种与水稻品种
大肠杆菌BL21、大肠杆菌菌株pET-28a由青岛农业大学遗传研究室实验室保存。
2、植物培养基
采用的培养基为LB培养基。
二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤:
1、AhRab7基因原核表达载体的构建
以携带AhRab7基因的pUC18重组的质粒为模板,通过PCR扩增AhRab7基因,所用引物为:
P5 (5-CATATGATGCCTTCCAGAAGAAGAAC-3) (NdeⅠ) (SEQ ID No:8);
P6 (5-AAGCTTTCATCTCAGCATTCACAACCTGT-3) (HindⅢ) (SEQ ID No:9);
回收PCR产物,并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒,用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切,回收含AhRab7基因的酶切片段,并克隆到原核表达载体pET-28a的对应位点中,获得该基因的原核表达载体pET-28a- AhRab7。
2、AhRab7基因在大肠杆菌中的诱导表达
挑取携带pET-28a-AhRab7的单菌落接种于含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中,37℃摇床250rpm培养16h,按1:30的比例转接过夜菌液(约340μL)转到10mL含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中,37℃摇床250rpm活化2-3h。当菌液OD600达到0.6-0.8时,加入100mM IPTG使终浓度达1mM,于37℃摇床250rpm诱导培养8h。含pET-28a的大肠杆菌BL21在IPTG诱导8h后的产物作为对照。取诱导后的菌夜1.5mL,12000rpm离心2min,弃上清加入60μL磷酸缓冲液以充分悬浮菌体,加入等体积的上样缓冲液混匀,室温放置5min,100 ℃煮沸5min后冷却至室温,12000rpm离心2min,取分离物在5%的浓缩胶、12%的分离胶上进行SDS-PAGE分析。pET-28a-AhRab7重组菌经诱导后,得到了大小约为23KDa的特异条带产物,而对照pET-28a经诱导后没有这条条带(如图4所示)。
3、pET-28a-AhRab7重组菌的耐盐性测定
按1:100取经IPTG诱导的重组菌和对照菌株,将其分别置于10mL含0、1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0% NaCl的液体LB中(含100μg/mL卡那霉素),分别取培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的培养物于600nm测其吸光度,重复3次,根据实验结果绘制其生长曲线,实验结果进行统计分析。pET-28a-AhRab7重组菌在15% NaCl溶液中还能生长,而对照菌的生长受到严重抑制(如图5所示)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 花生耐盐相关基因Rab7及其在提高耐盐性中的应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3254
<212> DNA
<213> 花生
<400> 1
tgctttgatt tgaggaggac tagaaagctc gccccaagtc tcaactctca acgcaactgc 60
tttgctgaga ctctcaacag aaagcggtta cacctttttc cgatctctct aacagaacaa 120
caacaacaaa aagcggttac actttttttt cccgatcggt gaaaaagtaa ccatgccttc 180
cagaagaaga actctattga aggtcatcat tctcggtgac agcgggtaag ttacttttcg 240
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cacgatttcc gtttttctgc cacctactta gctcaattcg atcgaatttt ttttctccct 360
aggatcttgt atttttgtcg ctttctgctg cggaaattgc cttttgtttt caactctttt 420
tcttgatgca tacgcacgat tggttgatac tggaaagaaa ttttcactat atttgatcgt 480
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ttccctaaca aatataattt agatatgtga ataagaagtt tagcaaccag tacaaggcaa 780
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tatcacaagc aatgtctaag tgatttttca aatgttaagc tgtgcaataa ttttttcagg 1860
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<211> 206
<212> PRT
<213> 花生
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Met Pro Ser Arg Arg Arg Thr Leu Leu Lys Val Ile Ile Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Gly Val Gly Lys Thr Ser Leu Met Asn Gln Tyr Val Asn Lys Lys
20 25 30
Phe Ser Asn Gln Tyr Lys Ala Thr Ile Gly Ala Asp Phe Leu Thr Lys
35 40 45
Glu Val Gln Phe Glu Asp Arg Leu Phe Thr Leu Gln Ile Trp Asp Thr
50 55 60
Ala Gly Gln Glu Arg Phe Gln Ser Leu Gly Val Ala Phe Tyr Arg Gly
65 70 75 80
Ala Asp Cys Cys Val Leu Val Tyr Asp Val Asn Ser Met Lys Ser Phe
85 90 95
Asp Asn Leu Asn Asn Trp Arg Glu Glu Phe Leu Ile Gln Ala Ser Pro
100 105 110
Ser Asp Pro Glu Asn Phe Pro Phe Val Val Ile Gly Asn Lys Val Asp
115 120 125
Ile Asp Gly Gly Asn Ser Arg Val Val Ser Glu Lys Lys Ala Arg Ala
130 135 140
Trp Cys Ala Ser Lys Gly Asn Ile Pro Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Lys
145 150 155 160
Glu Gly Ile Asn Val Glu Glu Ala Phe Gln Cys Ile Ala Lys Asn Ala
165 170 175
Leu Lys Ser Gly Glu Glu Glu Glu Leu Tyr Leu Pro Asp Thr Ile Asp
180 185 190
Val Gly Thr Ser Ser Gln Gln Arg Ala Thr Gly Cys Glu Cys
195 200 205
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<212> cDNA
<213> 花生
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gggctgattg ctgtgttctt gtatatgatg ttaattcaat gaaatcattc gacaacctta 300
acaactggag ggaggaattt ctgattcagg ctagtccttc cgatccagag aattttcctt 360
ttgttgttat aggaaacaag gtagatattg atggtggaaa cagtagagtg gtttcggaaa 420
agaaggctcg ggcttggtgt gcatcaaaag gaaatatccc atattttgag acatctgcca 480
aggaaggtat taacgttgaa gaagcattcc agtgcatagc caagaatgcc ctgaaaagtg 540
gggaagaaga ggaattaact gttttattgt agatacctac ccgacacaat tgatgttgga 600
accagcagtc agcaacgggc aacaggttgt gaatgctgag at 642
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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