CN108795941B

CN108795941B - 一种诱导型启动子及其应用

Info

Publication number: CN108795941B
Application number: CN201810705759.8A
Authority: CN
Inventors: 赵春梅; 隋炯明; 李恩广; 王晶珊; 乔利仙; 郑春花; 孔祥远
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-07-02
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2038-07-02
Also published as: CN108795941A

Abstract

本发明公开了一种诱导型启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的启动子序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了含有该启动子的重组载体、转化子或表达盒。将本发明的启动子构建植物表达载体转化植物体，可以驱动外源基因在转基因植物中被盐胁迫诱导表达，适合构建植物表达载体用于作物抗逆性改良和作物高产、品质改良。

Description

一种诱导型启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种诱导型启动子及其应用。

背景技术

随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的作物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。

目前，大量优良新基因被分离克隆，但植物基因工程中较为广泛使用的启动子比如来自花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子，来自植物本身的Act1、Ubi1等启动子，均是组成型启动子。由于组成型启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，应用中逐渐暴露出一些问题。在多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必须甚至有毒，不利于植物正常生长。

植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量调控不同水平的启动子，而且需要适合于不同植物背景、不同的器官、组织、转基因类型的启动子以避免在转基因过程中的不利影响。

诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达，因此，植物生物技术领域的一个研究热点就是发掘植物源的诱导型启动子。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的：一是提供一种诱导型启动子，二是提供一种该启动子的重组载体、表达盒和转化子，三是提供该诱导型启动子、重组载体、表达盒及转化子的应用。

为了达到本发明的目的，本发明的技术方案如下：

启动子，选自以下任一组并具有启动子功能的核酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的核酸序列或SEQ ID NO.1所示的核酸序列的103bp～1914bp、536bp～1914bp、1250bp～1914bp、1405bp～1914bp、1736bp～1914bp中的至少一段；

2)与1)核酸序列互补的核酸序列；

3)在高等严紧条件下与1)或2)限定的核酸序列杂交的核酸序列；

4)对上述1)或2)所示核酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核酸序列；

5)与1)或2)限定的核酸序列具有90％以上同源性的核酸序列。

含有上述启动子的重组载体、转化子或表达盒。

在上述方案的基础上，所述重组载体为在多克隆位点处***上述启动子的重组质粒。

在上述方案的基础上，所述重组载体为将上述所示启动子序列***HindⅢ和NcoⅠ酶切识别位点间得到的重组质粒。

在上述方案的基础上，所述的载体为pMD18-T或pCAM1301。

在上述方案的基础上，所述表达盒由具有启动子功能的核酸序列，所要启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述具有启动子功能的核酸序列与所述目的基因连接，所述目的基因与所述转录终止序列连接；所述具有启动子功能的核酸序列与所述目的基因序列来源相同或者不同。

在上述方案的基础上，所述转化子为转化入重组载体的重组菌或转基因细胞系。

在上述方案的基础上，所述启动子为诱导型启动子。

上述启动子在防御、胁迫或压力条件下启动或促进目的基因表达中的应用。

扩增上述启动子的全长及其任意片段的引物对。

本发明技术方案的优点：

本发明的技术方案获得了一种新型的诱导型启动子，该启动子可以驱动外源基因在转基因植物中被盐胁迫诱导表达，适合构建植物表达载体用于作物抗逆性改良和作物高产、品质改良。

本发明获得了一种在双子叶植物如烟草中有效发挥作用的盐胁迫诱导型启动子，实现了该启动子驱动外源基因在烟草的盐胁迫诱导表达。

通过将本发明的诱导型启动子与GUS报告基因融合并跟踪GUS酶在有无盐诱导处理下烟草植株内的表达情况，就可以确定该启动子在烟草植株中的盐诱导表达模式。

附图说明

图1、电泳图谱，其中a和b中的M1和M2为marker，a中的1泳道为克隆AhRabG3f-P启动子的电泳图，b中的2泳道为构建的pMD18-T-AhRabG3f-P载体进行酶切验证的电泳图；

图2、AhRabG3f-P启动子中的功能元件预测；

图3、AhRabG3f-P启动子缺失片段示意图；

图4、系列长度启动子植物表达载体的酶切验证；泳道M：marker DL2000；泳道1、2分别为pCAMBIA1301、pCAM-RabG3f全长启动子；泳道3～7为P1～P5的5'端系列缺失启动子表达载体的酶切验证；

图5、转基因烟草叶片GUS染色分析；1-6分别代表pCAM-RabG3f-P、pCAM-RabG3f-P1、pCAM-RabG3f-P2、pCAM-RabG3f-P3、pCAM-RabG3f-P4、pCAM-RabG3f-P5转基因烟草叶片；

图6、NaCl处理下转基因烟草叶片GUS酶活性的荧光定量分析，(两个并排的柱子中，左边的柱子是0h，右边的柱子是12h)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：花生小GTP结合蛋白基因启动子AhRabG3f-P的克隆和序列分析

根据GenBank中已报道的AhRabG3f基因(GenBank：ES752601)序列，设计启动子引物，扩增其上有启动子区域；并在引物两端添加酶切位点Hind III(小写字体所示)和Nco I(小写字体所示)和保护碱基(下划线所示)(下同)，将其构建到pMD18-T载体中。

上游引物：3f-P：ATAaagcttTATATCTCATCCGACTT(SEQ ID NO.2)

下游引物：3f-R：ATAccatggCCGATCGGGAAAAAAAAGTGTAACC(SEQ ID NO.3)

所用引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。

以花生基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备AhRabG3f基因启动子片段。PCR反应体系为：

PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火50秒，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；4℃保温。

得到的扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果显示：在约1900bp处有特异条带，大小与预计理论值相符(附图1)。用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化该PCR产物；将纯化产物与pMD18-T载体连接，获得重组质粒命名为pMD18-T-AhRabG3f-P，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行Amp、蓝白斑筛选，选取重组质粒经PCR及Hind III/Nco I双酶切鉴定均为阳性(附图1)的克隆菌液送大连宝生物(TaKaRa)公司测序；获得启动子的序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1

将测序结果在peanutbase搜索比对，确证所得序列为AhRabG3f基因的上游调控序列(AhRabG3f-P)，长度为1930bp。利用PLACE(Plant cis-acting regulatory DNA-elements，PLACE)软件对AhRabG3f-P的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID NO:1)进行序列分析，结果表明在AhRabG3f-P启动子上游存在ABA响应元件(ABRE)、干旱胁迫响应元件(MBS)、防御和胁迫响应元件(TC-rich repeat)以及热胁迫响应元件HSE等(附图2)。

实施例2：启动子功能验证

2.1重组表达载体的构建

从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA1301(该菌株从生物公司或CAMBIA购买)，用HindⅢ/NcoⅠ对pCAMBIA1301质粒进行双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。将实施例1制备的质粒pMD18-T-AhRabG3f-P，用HindⅢ/NcoⅠ双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳回收AhRabG3f-P启动子片段。将上述回收的AhRabG3f-P启动子片段与pCAMBIA1301酶切后的大载体片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA1301载体上的AhRabG3f-P∷GUS融合基因构建，重组质粒命名为pCAM-RabG3f-P。

连接体系：

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，对重组质粒进行PCR及HindⅢ/NocⅠ双酶切鉴定。用冻融法将鉴定的阳性克隆质粒转化农杆菌Gv3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

2.2植物遗传转化

用含有pCAM1301-RabG3f-P质粒的根癌农杆菌菌液叶圆盘法转化烟草叶片(大小0.5×0.5)，共培养2天，随后移至分化培养基(含50mg/L潮霉素)进行抗性筛选，抗性愈伤每两周继代一次，直至出现抗性小苗，移至生根培养基(含50mg/L潮霉素)中生根，炼苗移栽，直至收获T₁代种子。获得的抗性植株用PCR法进行阳性检测，引物为gus基因内部引物，产物大小为220bp。

2.3 RabG3f-P驱动转基因植株的GUS表达

取转基因烟草T0代叶片进行GUS组织化学染色。利用X-Gluc反应液处理植物叶片，样品材料加入X-Gluc反应液37℃反应24小时，将反应液吸出，用75％乙醇脱色2-3次，至阴性材料呈白色，肉眼观察或显微照相，结果表明：本发明的启动子能够驱动GUS蛋白在叶片组织表达，虽然表达较弱，但说明由SEQ ID NO:1所示序列具有启动子活性。(附图5)。

实施例3、截短的启动子活性分析

3.1系列缺失表达载体的构建

根据软件对AhRabG3f-P启动子功能元件的分析预测结果，以pCAM1301-RabG3f-P质粒为模板，设计缺失引物依次对顺式作用元件进行缺失，PCR扩增，获得了5个启动子5’端渐变缺失片段，利用HindⅢ和NocⅠ进行双酶切后，将缺失片段构建到酶切后的pCAMBIA1301的载体上，获得系列缺失表达载体，分别命名为pCAM-RabG3f-P₁、pCAM-RabG3f-P₂、pCAM-RabG3f-P₃、pCAM-RabG3f-P₄和pCAM-RabG3f-P₅，重组载体分别进行HindⅢ/NocⅠ双酶切鉴定(附图4)。具体操作过程可参照实施例2，缺失引物序列如下：

表1缺失引物序列

所用引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。

3.2农杆菌介导的遗传转化

具体操作过程可参照实施例2

3.3GUS活性分析

3.3.1GUS组织化学染色

具体操作过程可参照实施例2。

GUS染色结果如图5所示，对于上述6个重组表达载体(pCAM-RabG3f-P、pCAM-RabG3f-P1、pCAM-RabG3f-P2、pCAM-RabG3f-P3、pCAM-RabG3f-P4、pCAM-RabG3f-P5)转化的转基因烟草而言，幼叶均能被GUS染色，但不同缺失长度启动子转化的植株叶片染色深浅不同，其中缺失启动子P1与P3转化的烟草叶片GUS染色较深，说明启动能力比较强，即使最短的P5缺失启动子(长度为186bp)也具有驱动能力。相对而言，全长启动子AhRabG-3f-P转化的烟草幼叶染色最浅，启动能力相对较弱。

3.3.2GUS活性荧光定量分析

利用荧光定量法进行测定GUS基因活性，GUS基因以4-MUG作为作用的底物产生有荧光的产物4-MU，通过检测产物的荧光强度来检测GUS基因的活性大小。GUS活性以每毫克可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-MU为单位。

具体方法为：取6叶期的转基因烟草幼苗进行NaCl(250mmol/L)胁迫处理，在处理的不同时间段，取叶片保存在-70℃。取叶片100mg，加入100μL提取缓冲液，8000g离心10分钟，取20μL上清液加入预热的200μL反应缓冲液(含有1mmol/L MUG)，混匀，37℃反应1小时后，取100μL加入900μL终止液终止反应，用荧光分光光度计测定各样品Ex340/Em465值。以4-MUP作标准物制作标准曲线。样品蛋白含量的测定使用Bradford法，用BSA制作标准曲线，结合每个样品的蛋白含量，计算出酶活性，单位是4-MU pmol/mg/蛋白质/min。

结果如图6所示，未受胁迫处理时，在转入AhRabG3f启动子各长度片段驱动GUS基因的转基因烟草中，都能检测到GUS蛋白的表达，且GUS荧光定量分析结果与组织化学染色结果一致(附图5、6)，各结构相比，全长启动子AhRabG-3f-P的转基因烟草中，GUS表达活性最低，缺失结构P₁与P₃都保持了很高的启动子活性，推测在SEQ ID NO.1第1930至1829位，第1395与682位之间的序列中存在抑制启动子活性的顺式元件。最短结构P5仍保持了一定的活性，表明其中包含了启动子的核心元件。经盐胁迫诱导后，除P5外，其他长度片段启动子的转基因烟草中，GUS活性都有所提高，说明该启动子是受NaCl诱导，其中，全长启动子AhRabG-3f-P的转基因烟草中，GUS活性提高了约3.3倍。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种诱导型启动子及其应用

<130> 2018

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1930

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

tatatctcat ccgacttgaa gaataagtaa ctgttctttc actattatta atattgtcca 60

cttaatgaat aactgctaca atataggtta atttcttata tatttagaaa agaaatcgcc 120

cactattttc atagatgaaa gattcaagag taatatcata atatgctgct ttgccatcat 180

atgctaaaga taccagcata tgctgctttg ccatccttat aaattgaact gtccaagttt 240

agcaaaatgt tatttgtgaa agtgtcaatg aatttgtctt tcttaaattc accaattttt 300

ctttttgttt gagagaattt tgtttggacc aaataatagt ctttagctaa gtaatatgac 360

tccacctcca aggcgttgga tctgtcaaaa atgaatttgt tacaatagaa ccatatagta 420

ctcatacaaa aataagaggc tacaaaactc ctttaaagag agattgggca gatatatatt 480

cttcactaac caagctaaga gaggtttgtt gaagaaatta tcacaattca atctaacatc 540

caagttcttt catagtttca tgttctatga gcaatcatgc aattgcagag gacgattaac 600

aaatacttga aattactaca agcaacacaa ctattatctt gagtcatatg tcttctgcaa 660

caaaagatga aaaatatttt tatatttttt attaattaat tttttaaatt aaaaataaaa 720

aatttattta tcatcttctc tatataaata ataattattc agcttgttta aactttatat 780

tttgaatttt atattttaaa atgactccta taaatagatt ttataacctc caatagaaat 840

agagactaat tgttaatcct taaacatggt gacattagat tatacctttt tttttctatc 900

aaatataagg agactcgaac ccataatttc taagtgaata tgagaaaatt atgccattaa 960

actataattc attgacaata ttaaattata ttatttgaac tataattcat tagaacaaat 1020

atttttataa ttaaatttaa ctaagttaca caaatttaac aaaaaaatgt gtgcatgtat 1080

cacttttttt gtatttttca acacataatc ttttattaaa aagtacaaaa ttttattaat 1140

atagtacata aatttttatg aacaatacaa aaaaatttat acaaaaaaca ttttatcaat 1200

ataacataat tttttacata acacaaaatt ttttatttat aacataactt ttgttgtaaa 1260

aacttaggta caattaattt tatgtaaaat tgataattaa aaattattaa aaaaattgag 1320

taatttaatt aaattattat ctaaaactct cgattatcaa tttcacatca aattaactac 1380

aactaaattt tcaccaatat ttatacatga cacataaatt tgcataactc atgcgaagtt 1440

acttaatcac gtagttttct tgtccggaaa atgcacgata gactttatct acataatttg 1500

ttaattagct cgtttcgtgt tcttaggtct tacaagttac aacagtgaac tgcagaaata 1560

ggattagggc aaaaaaaaaa agagaaagtt ggaaatttgt actaatttgt aatttgccat 1620

ttaagtgaag tttatttatt aaattagtgt gtgaatcagc tacagctgtc agcaggggaa 1680

tattcttctc aatattagaa gaaaaaaaat aaaaaagaag aagaaaaaag attgggggtt 1740

gtgttgtgtg tgtgctttga tttgaggagg actagaaagc tcgccccaag tctcaactct 1800

caacgcaact gctttgctga gactctcaac agaaagcggt tacacctttt tccgatctct 1860

ctaacagaac aacaacaaca acaaaaagcg gttacacttt tttttcccga tcggtgaaaa 1920

agtaaccatg 1930

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

ataaagcttt atatctcatc cgactt 26

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 3

ataccatggc cgatcgggaa aaaaaagtgt aacc 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 4

ataaagcttt ttagaaaaga aatcgcccac tat 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 5

ataaagctta catcaagttc tttcatagtt tca 33

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 6

ataaagcttt ttgttgtaaa aacttaggta 30

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 7

ataaagctta catgacacat aaatttgcat aact 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 8

ataaagcttg ggttgtgttg tgtgtgtgct ttga 34

Claims

1.启动子，选自以下具有启动子功能的核酸序列：

SEQ ID NO.1所示的核酸序列或SEQ ID NO.1所示的核酸序列的103bp～1914bp、536bp～1914bp、1250bp～1914bp、1405bp～1914bp、1736bp～1914bp中的至少一段。

2.含有权利要求1所述启动子的重组载体、转化子或表达盒。

3.根据权利要求2的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在克隆载体或表达载体的多克隆位点处***权利要求1所述启动子的重组质粒。

4.根据权利要求3的重组载体，其特征在于：所述的载体为pMD18-T或pCAM1301。

5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所示启动子序列***克隆载体或表达载体的HindⅢ和NcoⅠ酶切识别位点间得到的重组质粒。

6.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的核酸序列，所要启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述具有启动子功能的核酸序列与所述目的基因连接，所述目的基因与所述转录终止序列连接；所述具有启动子功能的核酸序列与所述目的基因序列来源相同或者不同。

7.根据权利要求2所述的转化子，其特征在于：所述转化子为转化入重组载体的重组菌或转基因细胞系。

8.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：所述启动子为诱导型启动子。

9.权利要求1所述启动子在NaCl胁迫条件下启动或促进目的基因表达中的应用。

10.扩增权利要求1所述启动子的引物对为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4-8中的任意一条和SEQ ID NO.3的组合。