CN103421104A - OsLEA3-2提高作物抗逆性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胚胎晚期丰富蛋白OsLEA3-2多肽及其编码序列在提高植物对非生物胁迫抗性的用途，以及利用重组载体在植物中表达该酶的方法。具体地说，本发明涉及通过转入所述编码序列来改进植物对非生物胁迫的抗性的方法。

Description

OsLEA3-2提高作物抗逆性的应用

技术领域

本发明涉及一种胚胎晚期丰富蛋白OsLEA3-2多肽及其编码序列在提高植物对非生物胁迫抗性的用途，以及利用重组载体在植物中表达该酶的方法。具体地说，本发明涉及通过转入所述编码序列来改进植物对非生物胁迫的抗性的方法。

背景技术

高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响农作物生长发育并最终导致作物减产甚至绝收的主要逆境因子。保障粮食生产，改善和提高农作物对逆境胁迫的抗性一直是农业生产的目标之一。因此培育具有抗逆性的新品种对世界粮食生产将产生重要影响[1,2,3]。然而，由于作物的胁迫抗性多数为多遗传位点控制的复杂数量性状[4]，采用传统的育种方法培育抗逆性作物进展缓慢。随着现代分子生物学技术的发展，本领域已鉴定到一些与植物抗逆性相关的基因，并且可能利用转基因技术将这些基因转入植物中以改善抗逆性，这为抗逆性植物品种的培育开辟了新的途径。

我国农业面临的严重问题是由于长期灌溉导致的盐渍化胁迫、由于全球气候变化导致的淹水胁迫和干旱胁迫等。因此，分离并阐明调控植物抗逆性的关键基因，并通过转基因技术培育抗逆性作物，将产生巨大的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的正是明确OsLEA3-2多肽及其编码序列与植物对非生物胁迫的抗性之间的关系，为增强作物对非生物胁迫的抗性提供了一种新的途径。

本发明的另一目的是提供具有增强的非生物胁迫抗性的转基因植物及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供OsLEA3-2多肽或其编码序列在增强植物对非生物胁迫的抗性中的用途。

在一个优选例中，所述OsLEA3-2多肽是水稻OsLEA3-2多肽。

在另一优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。

在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、玉米、小麦、大麦或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、小麦、拟南芥或棉花。

在本发明的一个实施方式中，所述OsLEA3-2多肽包含下述序列或由其组成：

(a)SEQ ID NO：2；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的序列。

在本发明的另一个实施方式中，所述OsLEA3-2多肽的编码序列是编码本发明所述OsLEA3-2多肽的序列，包括编码本发明所述OsLEA3-2多肽的cDNA序列、mRNA序列或基因序列。

在本发明的另一个实施方式中，所述OsLEA3-2多肽的编码序列包含选自下组的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3；

(ii)与(i)对应的RNA序列；或

(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交且具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，所述非生物胁迫包括但不限于：盐胁迫、渗透胁迫和干旱胁迫。

在本发明的另一个实施方式中，所述盐胁迫指植物在含有一定浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象，例如由以下物质或情况引起的胁迫：钠离子、钾离子、氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠。在另一个优选例中，干旱胁迫指土壤含水量低于植物生长含水量下限(一般是植物生长饱和含水量的60－70％)而引起植物生长发育受到抑制，甚至死亡的胁迫。在另一个优选例中，渗透胁迫是植物在渗透压改变的土壤或者环境中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象，例如甘露醇、蔗糖等引起的胁迫。

在一个优选例中，所述盐胁迫包括氯化钠胁迫、氯化钾胁迫、硝酸钠胁迫、硫酸钠胁迫、碳酸钠胁迫或碳酸氢钠胁迫，例如，可以指100mM或200mM NaCl处理引起的胁迫。

在本发明的第二方面中，提供了一种载体，所述载体含有OsLEA3-2多肽的编码序列。

在一个优选例中，所述载体中含有水稻OsLEA3-2多肽的编码序列。

在一个优选例中，所述OsLEA3-2多肽的编码序列包含选自下组的序列：

(1)编码如SEQ:2所示多肽的多核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的核苷酸序列；

(4)与(1)、(2)或(3)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在一个优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，优选pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301或pHB。

在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明所述的载体。

在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆菌，所述农杆菌包括但不限于：EHA105、SOUP1301或C58。

在本发明的第四方面中，提供一种制备转基因植物的方法，所述方法包括：

(1)将含有OsLEA3-2多肽的编码序列的构建物导入植物细胞、组织或器官；

(2)将步骤(1)中的植物细胞、组织或器官再生成植株；

(3)筛选出与非转基因植株相比，对非生物胁迫的抗性增强的转基因植物。

在一个优选实施方式中，上述步骤(1)可包括：

(i)用含有OsLEA3-2多肽的编码序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

(ii)选择转入OsLEA3-2多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官。

本发明所述的构建物可包含荧光蛋白(包括但不限于，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白)或抗生素抗性(包括但不限于，卡那霉素抗性、新霉素抗性)等序列；因而本发明所述的选择步骤可通过荧光蛋白或抗生素抗性等方式进行。

本领域技术人员应理解，本文所述的植物细胞、组织或器官不一定再生成完整植株，也可能用培养基连续培养，以生产所述蛋白质。

在一个优选例中，所述构建物为含有OsLEA3-2多肽的编码序列的载体或宿主细胞。

在另一个优选例中，步骤(2)的植物细胞、组织或器官中的染色体上整合了OsLEA3-2多肽的编码序列。

在另一个优选例中，所述方法包括以下具体步骤：

(a)提供含有OsLEA3-2多肽的编码序列的载体；

(b)提供携带步骤(a)中的载体的宿主细胞；

(c)将植物细胞或组织与步骤(b)中的宿主细胞接触，从而使OsLEA3-2多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(d)选择转入OsLEA3-2多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官；和

(e)将步骤(d)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，

其中所述转基因植物对非生物胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。

在另一个优选例中，所述OsLEA3-2多肽为水稻OsLEA3-2多肽。

在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、小麦、拟南芥或棉花。

在一个优选例中，所述制备转基因植物的方法，还包括将用本发明前述任一种方法获得的转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交，从而获得包含OsLEA3-2多肽的编码序列的杂交后代，所述杂交后代对非生物胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。

在一个优选例中，杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植物，优选为同一科植物。所述植物优选为禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、小麦、拟南芥或棉花。

在另一个优选例中，所述杂交后代具有稳定的遗传性状。

在本发明的第五方面中，提供了用本发明所述方法制得的转基因植物，所述转基因植物包含OsLEA3-2多肽的编码序列和/或对非生物胁迫的抗性较非转基因植物有所增强。

在另一个优选例中，所述OsLEA3-2多肽的编码序列包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：2；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的序列。

在一个优选例中，所述OsLEA3-2多肽的编码序列选自：

(1)编码如SEQ:2所示多肽的多核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的核苷酸序列；

(4)与(1)、(2)或(3)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，所述非生物胁迫包括但不限于：盐胁迫、渗透胁迫和干旱胁迫。

在一个优选例中，所述盐胁迫指植物在含有一定浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象，例如由以下物质或情况引起的胁迫：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。在另一个优选例中，干旱胁迫指土壤含水量低于植物生长含水量下限(一般是植物生长饱和含水量的60－70％)而引起植物生长发育受到抑制，甚至死亡的胁迫。在另一个优选例中，渗透胁迫是植物在渗透压改变的土壤或者环境中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象，例如甘露醇、蔗糖等引起的胁迫。

在另一个优选例中，所述盐胁迫优选为：氯化钠胁迫、氯化钾胁迫、硝酸钠胁迫、硫酸钠胁迫、碳酸钠胁迫或碳酸氢钠胁迫。

在另一优选例中，所述作物为拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花。

在另一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。

在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花，最优选为水稻、玉米、小麦、拟南芥或棉花。

应理解的是，本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图简要说明

图1是5’-和3’-RACE的巢式PCR；其中泳道1是DL 2000标记物，泳道2是5’-RACE，泳道3是3’-RACE。

图2是OsLEA3-2的cDNA序列及其相应的氨基酸序列；其中*部分是终止密码子序列，红色下划线部分是寡聚核苷酸序列(AATAAA)。

图3A是OsLEA3-2蛋白与拟南芥、油菜、水稻3组同源体LEA蛋白的氨基酸序列多重同源比对；图3B进化树分析结果；图3C是亲水性分析。

图4A是水稻OsLEA3-2在不同组织中的表达情况；其中泳道1是胚，泳道2是根，泳道3是地上部基部，泳道4是叶。图4B是水稻OsLEA3-2基因在不同胁迫条件下的RT-PCR分析；其中泳道A是对照，泳道B是400mM甘露醇的条件，泳道C是100μM ABA(加0.02%吐温-20)的条件，泳道D是4℃处理，泳道E是200mM NaCl的条件，泳道F是25%PEG-6000处理，1代表根部，2代表地上部基部，3代表叶。

图5是pHB-GFP-OsLEA3-2载体的表达图谱。

图6是OsLEA3-2在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位；其中A-C是pHB-GFP转化洋葱表皮细胞绿色荧光蛋白分布情况，可以看出绿色荧光蛋白在胞质、核都有分布；D-F是pHB-GFP-OsLEA3-2转化洋葱表皮细胞绿色荧光蛋白分布情况，可以看出绿色荧光蛋白只分布于细胞核；图B和E获自激发光视野下；图C和F获自白光视野下；图A和D为图B和C分别与图E和F的叠加图。

图7是拟南芥、水稻过表达载体pHB-OsLEA3-2的质粒图。

图8是转基因拟南芥的PCR鉴定，A图中M是DL2000标记物，WT是野生型拟南芥，P是pHB-OsLEA3-2；B图中M是DL2000标记物，WT是野生型水稻，P是pHB-OsLEA3-2。

图9是在转基因株系中的RT-PCR半定量分析。A图中WT是野生型拟南芥，L35、L48、L69是转基因拟南芥株系，B图中ZH11是野生型水稻，L10、L20、L30、L31是转基因水稻株系。

图10是野生型和转基因拟南芥在不同处理的MS₀平板上的生长情况。其中WT是野生型拟南芥；L48是转基因拟南芥株系。(A)MS₀培养基，(B)MS₀+200mM甘露醇，(C)MS₀+100mM NaCl。

图11是野生型、转基因株系各50粒种子在不同的胁迫处理下的萌发情况。其中WT代表野生型水稻；L10、L20、L30代表转基因水稻株系。A图是水；B图是100mM NaCl水溶液；C图是10μM ABA水溶液；D图是10%PEG6000水溶液。

图12是水稻野生型和转基因株系在不同胁迫处理下生长状况。WT是野生型水稻；L10、L20、L30、L31是转基因水稻株系。A图是水稻野生型和转基因株系在水中萌发、生长5天、2周的状况。B图是水稻野生型和转基因株系在10%20%PEG6000、100 200mM NaCl、10μM ABA中萌发、生长5天的状况。C图是水稻野生型和转基因株系在10%PEG6000、20%PEG6000、100mM NaCl、200mM NaCl、10μMABA中萌发、生长2周的状况。

图13是水稻野生型(ZH11)和转基因株系(L10、L30)在干旱处理、复水后生长情况。A图是处理前的一个月大的水稻苗；B是干旱处理(一直不浇水)20天；C是复水(正常浇水)一个月。

图14是水稻大田种植考种统计结果。ZH11代表野生型水稻；L10、L20、L30是转基因水稻株系。A图是株高；B图是剑叶长；C图是穗长；D图是千粒重。

具体实施方式

I.定义

本文所用术语“包含”指“包括”以及“由…组成”，例如组合物“包含”X可以是仅由X组成或可包括一些附加组分，如X+Y。

对于数值x来说，术语“约”指，例如x±10%。

本文所用术语“编码序列”指编码所提及的蛋白质或多肽的DNA或RNA序列，包括编码所提及的蛋白质或多肽的cDNA序列、mRNA序列、基因序列及其互补序列，也就是说，该序列可能包含翻译区或其互补区5’侧或3’侧的非翻译序列。

本文所用术语“与某DNA序列对应的RNA序列”是指用核糖核苷酸代替脱氧核糖核苷酸，并且用RNA中特有的尿嘧啶(U)代替DNA中特有的胸腺嘧啶(T)形成的对应于所研究DNA序列的RNA序列。

本文所用术语“序列相同性”或“相同性”指比对两条序列以最大程度提高亚基匹配，即考虑缺口和***时，两条序列中相应位置上相同亚基的百分数。两条序列中的亚基位置被同一核苷酸或氨基酸占据时存在序列相同性，例如，若两个DNA分子的某个给定位置都被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位置上相同。例如，若在长度为10个氨基酸的序列中有7个位置与长度为10个氨基酸的第二序列的相应位置相同，则这两个序列具有70%序列相同性。通常采用序列分析软件(例如，位于威斯康星州麦迪逊53705大学大道1710号的威斯康星大学生物技术中心的遗传计算机组(Genetics Computer Group,University ofWisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包)，测定序列相同性。

II.OsLEA3-2多肽及其编码序列

在本发明中，术语“LEA蛋白”或“LEA多肽”可互换使用，指胚胎晚期丰富蛋白(late embroygenesis abundant)，该蛋白为亲水性蛋白，其表达与植物细胞抗逆保护作用有着密切联系。

我们通过同源比对在水稻基因组中发现一个新的编码LEA蛋白的基因(SEQ ID NO：3)，其CDS序列为SEQ ID NO：1，该基因编码的蛋白序列(SEQID NO：2)包含16个ΦΦ(E/Q)XΦK(E/Q)KΦX(E/D/Q)(其中Φ代表疏水性氨基酸残基)的重复序列，是LEA蛋白3族的典型特征，所以命名为OsLEA3-2(BenzeXiao等在水稻中克隆过一个3组的LEA蛋白，命名为OsLEA3-1[5])。应理解，提到OsLEA3-2多肽时，其定义也包括具有提高植物的非生物胁迫抗性的该多肽的变异形式。

所述OsLEA3-2蛋白或多肽可包含选自下组的序列：(a)SEQ ID NO：2；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对干旱胁迫、渗透胁迫或盐胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的序列。

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中OsLEA3-2多肽或多肽优选由水稻LEA基因、拟南芥LEA基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸，它们仍然具有本发明蛋白质的活性。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的OsLEA3-2蛋白或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有增强植物盐胁迫抗性、干旱胁迫抗性，和/或渗透胁迫抗性的活性。在另一个实施方式中，本发明蛋白质或多肽包含与SEQ ID NO：2的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的氨基酸序列。

在本文中，“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明蛋白质或多肽还包括OsLEA3-2多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsLEA3-2多肽编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗OsLEA3-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含OsLEA3-2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsLEA3-2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有OsLEA3-2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续氨基酸，更佳地至少约150个连续氨基酸，更佳地至少约200个连续氨基酸，更佳地至少约250个连续氨基酸，最佳地至少约300个连续氨基酸。

如本文所用，术语“OsLEA3-2多肽的编码序列”指一种核苷酸序列，其包含编码本发明所述的OsLEA3-2蛋白或多肽的序列，与SEQ ID NO：1或3高度同源的序列或在严格条件下与SEQ ID NO：1或3杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对植物的非生物胁迫抗性具有一定的改善作用。提到核苷酸序列时，本文所用的“高度同源”可以指与所提及序列的相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。编码OsLEA3-2蛋白或多肽的序列可以与SEQ ID NO：1或3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1或3所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明所述蛋白或多肽的序列包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明OsLEA3-2多肽的多核苷酸。

本发明的OsLEA3-2多肽的编码序列可选自：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3；或(ii)与(i)对应的RNA序列；(iii)在严格条件下与(i)或(ii)限定的序列杂交且具有改良作物种子性状的活性的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列，或者可以是与(a)中所限定序列的互补性为至少50%、优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上的序列。

本发明的OsLEA3-2多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的OsLEA3-2多肽的编码序列优选获自水稻或拟南芥，获自其它植物的与拟南芥LEA基因高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

植物及其对非生物胁迫的抗性

如本文所用，术语“植物”没有特别的限制，包括但不限于：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物等。优选所述植物为作物。

如本文所用，术语“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物，其经济价值可体现在该植物的种子、果实、根、茎、叶等有用部位上。作物包括但不限于：双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于：锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优选棉花、油菜等。

如本文所用，术语“非生物胁迫”是指植物在一些非生物因素的影响下，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。这些非生物因素主要包括但不限于：干旱、高盐、高碱、低温、强光、压力等。

如本文所用，术语“盐胁迫”是指：指植物在含有一定浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成盐属胁迫的盐类包括(但不限于)：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。本发明的OsLEA3-2多肽或其编码序列可增强植物对盐胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在高浓度盐分存在下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在更高的盐浓度下存活。

如本文所用，术语“渗透胁迫”是指：植物在渗透压改变的土壤或者环境中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。高盐、高碱、干旱过程中都伴随着渗透胁迫的过程。渗透胁迫包括实验室渗透胁迫和大田渗透胁迫，其中实验室渗透胁迫包括：甘露醇、蔗糖胁迫(用于模拟大田渗透胁迫，因为它们的分子量等本身的特质能够模拟一个高渗的水环境)；大田渗透胁迫包括：高盐、高碱、干旱胁迫。本发明的OsLEA3-2多肽或其编码序列可增强植物对渗透胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在渗透压改变的条件下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在渗透压改变程度更高的条件下存活。

如本文所用，术语“干旱胁迫”是指：当土壤含水量低于植物生长含水量下限(一般是植物生长饱和含水量的60－70％)时，植物生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。本发明的OsLEA3-2多肽或其编码序列可增强植物对干旱胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在缺水条件下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在更干旱的条件下存活。

载体、宿主及转基因植物

本发明还涉及包含OsLEA3-2多肽的编码序列的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达OsLEA3-2多肽的转基因植物。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的OsLEA3-2多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码OsLEA3-2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本文所用术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含LEA编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301或pHB。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用农杆菌作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明中术语“转基因植物”、“转化子”或“转化植物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明OsLEA3-2蛋白或多肽的编码序列并稳定高表达OsLEA3-2蛋白或多肽的细胞、器官、组织或植株。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点在于：

(1)提供了OsLEA3-2多肽及其编码序列的新用途，其可用于有效提高植物对非生物胁迫的抗性，从而改善农作物的产量和优良性状；

(2)提供了具有改良非生物胁迫抗性的转基因植物，为粮、棉、油等生产和加工提供了优良原料和产品；

(3)提供了改善植物对非生物胁迫的抗性的新途径，因而具有巨大的应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，1989)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)(科学出版社，2008)；朱检等，生物化学实验[M](上海科学技术出版社，1995)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。

实施例1基因的鉴定

1.比对

通过比对水稻基因组发现一个新的编码胚胎晚期丰富蛋白的基因。

具体是，利用大豆LEA蛋白(PM2)比对水稻基因组(tBLASTn，参见http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=OGP_4530_9512&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn)，发现一个新的编码胚胎晚期丰富蛋白的基因。

2.扩增

利用引物OSLEAF和OSLEAR(表1)PCR扩增水稻cDNA，获得1050bp的片段。根据测序结果设计RACE引物OLEA5R、OLEA5RN、OLEA3F和OLEA3FN(表1)，分别扩增水稻RACE模板，得到5’-和3’-RACE产物(图1)。RACE产物克隆后经测序拼接，获得全长为1298bp基因，5’和3’非翻译区(UTR)分别为96和167bp，ORF编码344个氨基酸。通过比对水稻基因组发现该基因由2个外显子和1个内含子组成(图2)。

表1引物序列

3.等电点预测

用本领域常见的ProtParam工具(参见http://web.expasy.org/protparam/)预测的等电点为6.39(理论pI)，分子量大小36.8kD。

4.进化树分析

用DNAman软件对拟南芥AtLEA3、油菜BnLEA3、水稻OsLEA3以及我们克隆到的基因编码蛋白进行多重比对发现该LEA蛋白与LEA3具有较高的同源性，并且在进化上相对其他几个LEA3蛋白出现更早。同时发现该LEA蛋白包含16个ΦΦ(E/Q)XΦK(E/Q)KΦX(E/D/Q)(其中Φ代表疏水性氨基酸残基)的重复序列。此11个氨基酸的重复序列是LEA3蛋白的标志性序列。所以该基因被命名为OsLEA3-2(图3)。

用DNAman软件对拟南芥AtLEA3、油菜BnLEA3、水稻OsLEA3以及我们克隆到的OsLEA3-2进行多重比对发现OsLEA3-2与拟南芥和水稻LEA3的同源性分别为42%和36%。同时发现OsLEA3包含16个ΦΦ(E/Q)XΦK(E/Q)KΦX(E/D/Q)(其中Φ代表亲水性氨基酸残基)的重复序列(图3A)。进化树分析结果表明OsLEA3-2在进化上早于其他3个LEA3蛋白(图3B)。亲水性分析发现OsLEA3-2是一个亲水蛋白(图3C)。该蛋白富含丙氨酸Ala、苏氨酸Thr、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、赖氨酸Lys、精氨酸Arg及甘氨酸Gly氨基酸残基，分别占20.6、10.2、10、9.3、9.3、9.3和7.3%。

实施例2OsLEA3-2的表达模式

材料：供试水稻中花11来自中国科学院上海生化细胞所人工气候室。

方法：水稻灌浆结束后将种子取下收集胚，根、地上基部、叶取自一个月水稻苗。材料置于-70℃以备提取RNA。

分别用200mM NaCl、400mM甘露醇、25%PEG-6000、100μM ABA(溶于0.02%吐温20)及4℃低温处理一个月水稻苗(中花11)，6h后分别取根、茎、叶组织，液氮速冻后，保存于-80℃待用。

RNA提取方法：RNA提取用上海英骏生物技术有限公司提供的Trizol试剂。步骤为：取所需的组织用液氮磨成细粉，加1ml Trizol，混匀并室温静置5min；加入200μl氯仿混匀，室温静置10min(混合液明显分层)；12000g离心15min，上清转至新管加400μl氯仿混匀再纯化一次，取上清加等体积异丙醇室温静置10min以沉淀RNA，12000g离心10min。沉淀用70%乙醇洗涤，晾干后溶于一定体积的DEPC处理水中，保存于-80℃。

结果：

以水稻泛素基因作为内参，用引物OSLEA2F和OSLEA2R(表1)进行半定量RT-PCR分析发现在水稻胚中可以得到预期146bp的条带，在根、地上基部及叶中没有扩增产物(图4A)。

RT-PCR半定量分析发现NaCl、甘露醇和PEG-6000处理可以诱导OsLEA3-2基因表达，而ABA和低温处理并不诱导OsLEA3-2基因表达(图4B)。其中NaCl和甘露醇可以诱导OsLEA3-2基因在根和叶中表达，而PEG-6000诱导OsLEA3-2基因在根、茎、叶中都表达。甘露醇胁迫诱导OsLEA3-2基因在茎中有较高的表达水平，而NaCl和PEG-6000诱导OsLEA3-2基因在根中有较高的表达水平(图4B)。

实施例3OsLEA3-2的亚细胞定位

材料：市场上常规购得的洋葱。

方法：

1.载体构建

根据载体质粒pHB(中科院上海植物生理生态研究所杨洪全研究员构建，具体方法如下：将PCR扩增的潮霉素磷酸转移酶Ⅱ片段***质粒pCAMBIA3301(CAMBIA)Australia的Nco Ⅰ和BstE Ⅱ酶切位点之间，取代其上的β-葡萄糖醛酸酶cDNA片段。然后将两个CaMV 35S启动子及多克隆位点(MCS)和多聚腺嘌呤(polyA)***pCAMBIA3301的EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点构建成pHB质粒载体)及OsLEA3-2基因限制性内切酶酶切位点分布情况，设计两对用于构建亚细胞定位的融合蛋白载体的特异引物，其中第一对上下游引物的5′端分别***HindIII和BamHI限制性内切酶酶切位点。引物序列如下：

pHB-GFPF：5’-CCCAAGCTTATGGTAGATCTGACTAGTAA-3’(SEQ IDNO:12)

pHB-GFPR：5’-CGCGGATCCCACGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’(SEQ IDNO:13)

另一对上下游引物的5′端分别***Xba I和Pst I限制性内切酶酶切位点，序列是：

pHB-LEAF：5’-TGCTCTAGATCACATCTTGCCGTGGCG-3’(SEQ ID NO:14)

pHB-LEAR：5’-CCCCTGCAGATGGCGTCGAGGCAGGACA-3’(SEQ IDNO:15)

上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

分别以带有GFP基因的pCambia1302质粒(购自金维克(中国)生命科学技术中心)、水稻胚cDNA为模板，通过PCR扩增得到GFP、OsLEA3-2序列。采用宝生物工程(大连)有限公司的pMD-19-T简单载体(Simple Vector)试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)对PCR产物进行克隆，得到pMD-19-T-GFP和pMD19-T-OsLEA3-2两个中间载体。用HindIII和BamHI限制性内切酶从测序正确的pMD-19-T-GFP载体上切下GFP片段，连接到pHB载体上，得到载体pHB-GFP。将OsLEA3-2用Xba I和Pst I从pMD19-T-OsLEA3-2载体上切下，连到经同样酶切过的pHB-GFP载体上得到pHB-GFP-OsLEA3-2过表达载体。

2.打基因枪

质粒DNA的金粉包埋按照生物射弹(Biolistic)PDS-1000/He颗粒递送***的方法。取金粉悬液50μl(60g/L)，离心去酒精后依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl₂和20μl 0.1M亚精胺；振荡3min，10000rpm离心10-20sec，弃上清；加250μl无水乙醇，振荡重悬，10000rpm离心10-20sec，弃上清；用60μl无水乙醇定容；取10μl点于微粒载膜中央，使其平铺，凉至完全干燥。采用伯乐(Bio-Rad)PDS-1000/He基因枪进行轰击，样品室真空度26Pa，压力1300psi，洋葱(约2cm×2cm的小块)放在1%-琼脂固化1/2MS-培养基上，至可裂膜距离为6cm。转化后继续暗培养16-24h，制片，于蔡司(ZEISS)激光共聚焦荧光显微镜(LSM 510 META，德国)下观察细胞中的绿色荧光(图6)。

实验结果：

发现转化了pHB-GFP-OsLEA3-2的洋葱细胞荧光信号只存在于细胞核中(图6的D叠加图、E荧光、F白光)，而转化了pHB-GFP的洋葱细胞在整个细胞中都存在绿色荧光信号(图6的A叠加图、B荧光、C白光)，因此确定该蛋白是核定位蛋白。

实施例4过量表达OsLEA3-2的转基因水稻和拟南芥

材料：拟南芥(哥伦比亚生态型)种植环境为人工气候室：温度22℃，16h/8h光照周期，光强为120μmol m^-2s^-1，相对湿度60-80%。

水稻品种为中花11。大肠杆菌(E.coli)DH5α和根癌农杆菌EHA105。

方法：

1拟南芥转化

拟南芥的转化参照Clough等(Clough and Bent,1998)的方法。将生长状况良好的植株用于转化，转化前一天浇足营养液。含目的基因的根癌农杆菌EHA105在28℃过夜培养至OD₆₀₀=2.0，5000g离心10min，沉淀溶于新鲜配制的1/2MS+5%蔗糖溶液中至OD₆₀₀=0.8。再加入0.02%Silwet L-77混匀。用小喷壶均匀喷洒于花絮上，确保全部的花苞都被浸湿。转化过的植株平放于一个密封的小室内以保持湿度，黑暗过夜。第二天即可在正常条件下生长。得到的T0代种子经75%乙醇2min，10%漂水10min清洁消毒，水洗数遍后，铺于含50mgL^-1潮霉素的MS固体平板上(0.8%琼脂固化)。4℃春化48h，移至人工气候室(22℃，16h/8h光照/黑暗)生长一周，抗性苗移到土壤中继续生长。取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗。

2水稻转化(成熟胚转化法)

诱导愈伤

a.消毒：

取水稻成熟种子，按如下步骤消毒：

(1)将种子剥壳。

(2)将种子倒入烧杯中，用70%乙醇消毒5min。

(3)倒掉乙醇，加入2.5%次氯酸钠(NaClO)溶液，浸泡30min，中间轻轻搅拌，消毒充分。

(4)倒掉NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍。

b.成熟胚愈伤组织诱导与继代培养：

28℃暗培养4个星期。

把小愈伤组织剥下来换到继代培养基中，28℃光培养7天。

c.农杆菌培养：

提前2-3天YEB平板上划线活化农杆菌，将农杆菌接至AAM液体培养基中，28℃下200rpm震荡培养0.5-1小时将农杆菌打散、混匀，调OD600至0.1-0.15(0.125最宜)。

d.感菌共培养：

(1)长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入已调好OD值(OD600至0.1-0.15)的菌液中浸染15分钟；

(2)将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；

(3)将愈伤组织置于共培养基上，22℃暗培养4天。

e.选择：

(1)将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的震荡。再用含500mg/L羧苄的无菌水浸泡15min。最后置于无菌的滤纸上沥干2min；

(2)晾干的愈伤组织转入含500mg/L羧苄和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃暗培养14天；

(3)长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/L羧苄和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃暗培养10天。

f.抗性愈伤组织的预分化：

在超净台上挑取颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有预分化培养基的培养皿中，用封口膜封好，28℃暗培养7天。

g.抗性愈伤组织的分化:

在超净台上挑取同一愈伤来的颜色鲜黄的愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿中，用封口膜封好，放入恒温培养室中，(15-30天)。待芽长至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。

h.转基因苗的锻炼和移栽:

转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的广口瓶取出(苗长至广口瓶顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。

3.为了进一步研究OsLEA3-2基因的功能，我们构建了OsLEA3-2的过表达载体pHB-OsLEA3-2(图7)，通过农杆菌介导的转化方法获得了过量表达OsLEA3-2的转基因拟南芥和水稻植株。以T₀代的转化植株叶片的基因组DNA为模板，用潮霉素引物做基因组PCR，鉴定得到阳性的转基因植株(图8A和B)。获得了70个拟南芥转基因株系，45个水稻转基因株系。然后用RT-PCR鉴定OsLEA3-2在转基因水稻和拟南芥植株中表达情况(图9A和B)，根据结果挑取OsLEA3-2高表达的转基因株系，连续播种到T₃代筛选获得纯系转基因植株。

实施例5胁迫处理过表达OsLEA3-2基因水稻、拟南芥

材料：过表达OsLEA3-2的水稻种子，野生型中花11种子；过表达OsLEA3-2的拟南芥中子，野生型拟南芥种子。

方法：

1拟南芥处理

我们将野生型(哥伦比亚生态型)和转基因株系L48、L69种子灭菌后铺于MS₀(对照)、MS₀+200mM甘露醇、MS₀+100mM NaCl的琼脂糖平板，4℃冰箱放置两天后取出放入温室生长9天，观察结果。

2水稻处理

我们将野生型中花11和转基因株系L10、L20、L30、L31各50粒种子分别在水(对照处理)，或者含有100mM NaCl、200mM NaCl、10%PEG6000、20%PEG6000、10μM ABA的水溶液中萌发生长，5天或者2周后观察水稻苗的生长情况。

将生长一个月的水稻野生型和两个转基因株系(各6株)进行干旱处理20天后复水，观察结果。

结果：

在野生型水稻中花11中，OsLEA3-2受胁迫刺激而表达上调(图4B)。那么过量表达OsLEA3-2的转基因拟南芥、水稻对胁迫刺激响应又如何呢？

结果发现，生长9天后，野生型拟南芥(WT)和过量表达OsLEA3-2的拟南芥(L48)小苗在MS₀培养基中萌发、生长并无明显差异；在含有200mM甘露醇、100mMNaCl的MS₀平板上，L48萌发及长势明显优于对照(图10)。因此，过表达OsLEA3-2基因可以提高拟南芥小苗对非生物胁迫(盐胁迫、渗透胁迫)的抗性。

水稻处理结果显示在水中萌发生长的野生型和转基因株系没有差异，都在第三天达到最高萌发率(图11A)。而在100mM NaCl、10μM ABA、10% PEG6000水溶液中萌发时，转基因株系比野生型对照萌发快，其中ABA处理时转基因株系在第四天达到最高萌发率，而对照在第五天萌发率达到最高(图11C)。100mM NaCl处理时对照比转基因株系萌发慢，但都在第五天达到最高萌发率(图11B)。10%PEG6000处理时萌发的最慢，第五天仍有未萌发的种子，尽管如此，转基因株系在每天的统计中萌发率都高于对照。图12显示野生型和过量表达OsLEA3-2的转基因水稻苗在水(ddH₂O)、盐(NaCl)、模拟干旱胁迫(PEG6000)以及外源ABA处理情况下，5天、2周后生长状态。由图可以看出在水处理时对照和转基因株系无差异，而在胁迫下转基因株系比对照长势好(图12B和C)。

将生长一个月的水稻野生型和两个转基因株系(各6株)进行干旱处理20天后复水，复水一个月后发现野生型中花11全部干枯、死亡，而转基因株系有部分存活并抽穗结实(L10存活4株、L30存活5株)。所以说OsLEA3-2能够提高水稻的抗旱性(图13)。

实施例6水稻大田考种数据

材料：

过表达OsLEA3-2的水稻种子，野生型中花11种子。

方法：将野生型中花11和几个转基因株系栽种到本所在上海松江的五厍农场，按照正常的管理模式育苗、移栽、施肥、浇灌，成熟后考种(测量株高、剑叶长、穗长以及统计千粒重)，考察转基因水稻的在大田的生长和结实情况。

结果：

如图14所示，转基因株系与对照相比株高没有明显差异，但L10、L20略微比对照高一点；叶长无显著差异，但转基因株系比对照略短；转基因株系穗长比对照略长但没有显著差异；千粒重的统计结果也没有明显差异。由此在水稻中花11中过表达OsLEA3-2对水稻在正常生长环境下的生长和生产不会产生显著影响。

综上所述，我们用RACE法得到了编码OsLEA3-2多肽的基因的全长，构建了双35S:GFP:OsLEA3-2过表达载体，通过打基因枪的方法转化洋葱表皮细胞，发现OsLEA3-2定位在细胞核中。正常生长情况下OsLEA3-2只在水稻胚胎晚期表达，非生物胁迫(如盐、渗透、干旱)条件可以诱导该基因高表达。在拟南芥和水稻中过表达OsLEA3-2基因都可以提高转基因植株对非生物胁迫的抵抗性，所以说OsLEA3-2具有功能上的保守性。具体地，构建双35S:OsLEA3-2过表达载体转化水稻，发现在含有100、200mM NaCl，10%、20% PEG，10μM ABA的水溶液中，转基因株系发芽比对照快，生长速度也优于对照。干旱处理一个月大的水稻苗20天后复水，转基因苗能够部分存活而野生型全部死亡。正常生长环境下过表达OsLEA3-2基因的转基因株系与对照在株高、叶长、穗长、千粒重方面都没有差异，所以通过转基因的手段在植物体中过表达OsLEA3-2能够提高植物对非生物胁迫的抗性，增加植物在恶劣环境中的生物产量。

参考文献

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2.赵凤云,张慧(2007)耐非生物胁迫转基因水稻的培育——现在和未来.生物工程学报23:1-6.

3.Seo YS,Chern M,Bartley LE,Han M,Jung KH,et al.(2011)Towardsestablishment of a rice stress response interactome.PLoS Genet 7:e1002020.

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5.Xiao BZ,Huang YM,Tang N,Xiong LZ(2007)Over-expression of a LEA genein rice improves drought resistance under the field conditions.Theoretical and AppliedGenetics 115:35-46.

Claims (10)

1.一种分离的OsLEA3-2多肽或其编码序列在增强植物对非生物胁迫的抗性中的用途，其特征在于，所述OsLEA3-2多肽包含选自下组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的氨基酸序列。

(c)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的相同性≥90%(较佳地≥95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%)的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述OsLEA3-2多肽的编码序列包含选自下组的多核苷酸序列：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的核苷酸序列；

(4)与(1)、(2)或(3)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非生物胁迫包括盐胁迫、渗透胁迫和/或干旱胁迫。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大麦、玉米或高粱，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、拟南芥或棉花。

5.一种载体，所述载体含有权利要求1所述的OsLEA3-2多肽的编码序列。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体。

7.一种提高植物对非生物胁迫抗性的方法，其特征在于，该方法包括：使植物表达OsLEA3-2多肽，或提高植物中OsLEA3-2多肽的表达或活性，所述OsLEA3-2多肽选自下组的序列：

(a)SEQ ID NO：2；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有增强植物对非生物胁迫的抗性的活性的由(a)衍生的序列。

(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的相同性≥90%(较佳地≥95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%)、由(a)衍生的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将编码OsLEA3-2多肽的多核苷酸转入到植物中，所述的OsLEA3-2多肽的编码序列选自下组：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列；

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)用含有OsLEA3-2的编码序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

(2)选择转入OsLEA3-2多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官；和

(3)将步骤(2)中的植物细胞、组织或器官再生成植株；

其中，所得的转基因植物对非生物胁迫的抗性较未转化的植物有所增强。

10.一种制备具非生物胁迫抗性的转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)用含有OsLEA3-2多肽的编码序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

(2)将步骤(1)中的植物细胞、组织或器官再生成植株；

(3)筛选出与非转基因植株相比，对非生物胁迫的抗性增强的转基因植物；

其中非生物胁迫抗性可选自：盐胁迫、渗透胁迫和/或干旱胁迫。

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