CN102978218B

CN102978218B - 苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用

Info

Publication number: CN102978218B
Application number: CN201210579251.0A
Authority: CN
Inventors: 郝玉金; 由春香; 曹忠慧; 王荣凯
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN102978218A

Abstract

本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用；本发明利用同源克隆和RACE技术从苹果嘎啦中获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYB2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。将该基因转入番茄，转基因番茄株系抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力提高；该MdSIMYB2基因在苹果中过量表达能提高转基因苹果的表达水平，同时增强转基因苹果株系的抗旱、抗盐和抗冷等逆境能力。

Description

苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用

一、技术领域

本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫种类众多，包括干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。其中，MdSIMYB2基因对非生物胁迫具有抵抗能力。

苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，苹果基因组的测序（Velasco等，2010）的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。

MYB转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色（刘蕾等，2008）。MYB基因在植株中的过量表达能够显著提高植物的抗非生物胁迫能力，在植物抗逆反应过程中，当植物收到外界环境胁迫时植物通过信号转导途径调控体内相关基因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，降低或消除给植株带来的伤害。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻，大豆上等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低温、干旱、土壤盐渍化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果MYB基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。

随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重要任务，因此苹果育种在世界各国果树研究工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆方法及核苷酸序列，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗旱、抗盐、抗低温的转基因番茄和苹果中的应用，并可应用于生产改良其他粮食作物或经济作物。

本发明利用同源克隆和RACE技术从苹果嘎啦中获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYB2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

经NaCl处理24h的嘎啦苹果组培苗提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）。将所得PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认；再通过5′-RACE和3′-RACE技术分别获得5′和3′端序列，拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以嘎啦苹果组培苗的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列。

利用RACE方法克隆该基因得到1401bp,其开放阅读框（open reading frame,ORF）为1095bp。该基因编码364个氨基酸，预测分子量约为39.10kDa，等电点PI为8.17。将其氨基酸序列在NCBI中检索，发现与已公布的AtMYB5（拟南芥，NM_112200.2）、AtMYB17（拟南芥，NM_115989.3）、AtMYB25（拟南芥，NM_129546.1）、PhPH4（矮牵牛，AY973324.1）有较高的同源性，其氨基酸同源性分别为69.23%、66.35%、65.38%、64.42%。由此表明，经过上述克隆步骤得到了一个苹果中MYB基因，该基因与盐胁迫有关，又因我们已鉴定出MdSIMYB1参与响应非生物胁迫（见专利201210197919.5），所以将该基因命名为MdSIMYB2。

该基因序列如下：

序列表：

（1）SEQ.ID.NO.1的信息

（a）序列特征

长度：1401bp

类型：核酸

拓扑结构：线性

（b）分析类型：cDNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：苹果（Malus domestica）

（f）序列描述：SEQ.ID.NO.1

TTTTTTTTTG AACACTGAAA AAGCTTTACA AGGAACC CATCGTCTTC GTCGAAAGCA 60

GCAGCAGCAG CAAGTGCTAA GATGCAAACG ACGATAACAG CGCCGTCCTC GTCGAGCAAG 120

GCGGCTGGGG TTGCTGGAGG GACCAAGACG CCGTGTTGCG CAAAGGTGGG TTTGAAGAGA 180

GGGCCTTGGA CTCCCGAAGA GGACGAGCTG CTGGCAAATT ACATCAAGAA AGAAGGGGAG 240

GGACGGTGGC GGACCCTTCC CAAGCGGGCT GGGTTGCTCC GCTGCGGTAA GAGCTGCCGC 300

CTCCGCTGGA TGAACTATCT CCGCCCTTCT GTCAAGCGCG GCCAGATCGC CCCCGATGAA 360

GAAGATCTTA TCCTTCGCCT CCATCGCCTT CTGGGCAATC GGTGGTCTTT GATAGCTGGG 420

AGGATTCCAG GCCGTACGGA CAATGAGATA AAGAACTACT GGAACACACA CCTGAGCAAG 480

AAGCTGATAA GCCAAGGCAT AGATCCCAGA ACCCACAAGC CTCTCAATTC AGATCATCAC 540

TCTGCTGCTG ATGATGCTGA CGTGGACAAC ACAAACAAAT CAACTGCTGT TGCTTCTTCT 600

TCCAAAGCCA ATGATCGGTT CTTAAACCCT AACCCTAGTC CCCCTTCTGA TCGTCTTGTC 660

CATAAAGAAG GGGATCCAAA TAACAGCCGT AATGATGGAA ACATCGCAAT TGCTGATCAT 720

GATCTGGGCA CTATAGTCCA TGGCTTTGCA AATATGATCA CGTCCATCAA CAATCCCGAT 780

GCTTCTTCTT CGGCCGCGGC AACGGGTACT TTGAGTTTGA GGAGCAACAA CAGCCACGGT 840

GGAGTACTAC TTGGGGGAGG AGGAAATGAA GAGGACGACG TCTTCTCTTC GTTTCTGAAT 900

TCGTTGATCA ATGAGGATCC ATTTCCTGGA CAACACCAAT TGCAACAAGT ACTGCAGAAT 960

GGGAATGTTA GTGCACACGC AGCTGCTGCT CGTTCCGAGA ACCTTCCTTT GATTACTATG 1020

ACTAGTACTA CGGCGCCATC AACATTTGGC TGGGAGTCTG CCGTGCTCAT GTCTTCTGCT 1080

TTCATCCAAA ATGATCACCA GAGCGTTAAT GATCAAACGG AG CAGCT AGCCACCTGT 1140

TTGATTGATC AGTCGCACTG TGCATGTTGA ACAAGCAATG CGGTTGCTTA ATTAGTTAAT 1200

TTATATGTAG AAATTAGTCC TAGCTAGGGT TTGAAATATC ATATGAAATG TGATTTTGTG 1260

TGCTATCTCT ATTCTTAATT ATTCGACTAC CCCAACATCG CTCTACGAAT GGGGGCGTAT 1320

ATCAATGTAT TGTCGATCAC GTTTGTAATA TCATCTATCT ATCTATATAT GTTACCGGTA 1380

TTGTAAAACA AACATAAAAA A 1401

说明：透明方框中的表示起始密码子，而黄色方框内的表示终止密码子。

（2）SEQ.ID.NO.2的信息

（a）序列特征

编码区长度：364个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

（b）分析类型：蛋白质

（c）序列描述：SEQ.ID.NO.2

MET Arg Asn Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ser

5 10 15

Ala Lys MET Gln Thr Thr Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Lys

20 25 30

Ala Ala Gly Val Ala Gly Gly Thr Lys Thr Pro Cys Cys Ala Lys

35 40 45

Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Leu

50 55 60

Leu Ala Asn Tyr Ile Lys Lys Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr

65 70 75

Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg

80 85 90

Leu Arg Trp MET Asn Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gln

95 100 105

Ile Ala Pro Asp Glu Glu Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu

110 115 120

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg

125 130 135

Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys

140 145 150

Lys Leu Ile Ser Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu

155 160 165

Asn Ser Asp His His Ser Ala Ala Asp Asp Ala Asp Val Asp Asn

170 175 180

Thr Asn Lys Ser Thr Ala Val Ala Ser Ser Ser Lys Ala Asn Asp

185 190 195

Arg Phe Leu Asn Pro Asn Pro Ser Pro Pro Ser Asp Arg Leu Val

200 205 210

His Lys Glu Gly Asp Pro Asn Asn Ser Arg Asn Asp Gly Asn Ile

215 220 225

Ala Ile Ala Asp His Asp Leu Gly Thr Ile Val His Gly Phe Ala

230 235 240

Asn MET Ile Thr Ser Ile Asn Asn Pro Asp Ala Ser Ser Ser Ala

245 250 255

Ala Ala Thr Gly Thr Leu Ser Leu Arg Ser Asn Asn Ser His Gly

260 265 270

Gly Val Leu Leu Gly Gly Gly Gly Asn Glu Glu Asp Asp Val Phe

275 280 285

Ser Ser Phe Leu Asn Ser Leu Ile Asn Glu Asp Pro Phe Pro Gly

290 295 300

Gln His Gln Leu Gln Gln Val Leu Gln Asn Gly Asn Val Ser Ala

305 310 315

His Ala Ala Ala Ala Arg Ser Glu Asn Leu Pro Leu Ile Thr MET

320 325 330

Thr Ser Thr Thr Ala Pro Ser Thr Phe Gly Trp Glu Ser Ala Val

335 340 345

Leu MET Ser Ser Ala Phe Ile Gln Asn Asp His Gln Ser Val Asn

350 355 360

Asp Gln Thr Glu

364

本发明提供了苹果非生物逆境相关基因MdSIMYB2在番茄、苹果和其它植物中应用的方法，能够提高转基因植物抵抗干旱、低温和盐等逆境的能力。步骤为：

（a）利用如上所述的MdSIMYB2基因，将cDNA序列置于花椰菜病毒CaMV35S启动子之下，构建植物过量表达载体。

（b）用农杆菌（LBA4404）介导法将构建好的表达载体导入植物细胞，获得转基因植株。

本发明涉及一种植物表达载体，包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1，用于提高植物抗逆境能力，尤其是抗干旱、低温和盐的能力。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法是本领域人员熟知的农杆菌（LBA4404）介导法，得到抗干旱、盐和低温的转基因植物。

草本植物番茄SN1是基因工程研究的模式植物之一，具有生活周期短、再生能力强、遗传转化效率高的特点，而木本植物苹果生活周期长，遗传转化效率低，因而在下述实施例中以番茄和苹果两类植物为例对本发明进行详细说明，但本发明中MdSIMYB2基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它提高抗逆境能力的转基因植物。

本发明采用离体叶片接种法对获得的转基因番茄纯合体和苹果进行抗逆能力分析发现，转基因番茄和苹果中MdSIMYB2的过量表达株系，均能显著提高其抗干旱、低温和盐的能力。可把该基因转入桃树、梨树、杨树等木本植物、或小麦、玉米、水稻等农作物上，从而提高转基因植株的抗逆境能力，产生重大的经济效益和社会价值。

本发明从苹果中分离到一个R2R3类型的MYB家族基因MdSIMYB2，通过转基因功能验证表明：它能够抵抗高盐，低温，干旱等非生物逆境；并提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基因苹果砧木中，MdSIMYB2基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的候选基因，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料（包括一年生植物和多年生木本植物）也具有重要的现实意义。

四、附图说明

图1：苹果中MdSIMYB2蛋白结构保守域示意图及不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。

A.苹果的MdSIMYB2蛋白结构保守域示意图；B.不同R2R3类型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比较。其中，AtMYB5(NM_112200.2)、AtMYB17(NM_115989.3)、AtMYB108（NM_111525.3）、PhPH4（AY973324.1），R2、R3分别表示MYB家族基因的特征结构域。

图2：苹果中MdSIMYB2蛋白的进化树分析。

其中，白花紫露草TfMYB6(AY456184.1)，棉花GhMYB1(L04497.1),毛果杨PtMYB180(XM_002327312.1)、PtMYB111（XM_002302716.1）,拟南芥AtMYB5(NM_112200.2)、AtMYB17（NM_115989.3）、AtMYB108(NM_111525.3),矮牵牛PhPH4（AY973324.1），大豆GmW2(AB597932.1)，水稻OsMYB4（D88620.1)，车前草CpMYB10(AF510112.1)，百脉根LjTT2a（AB300033.2），大麦HvMYB2(X70876.1)，红皮云杉PgMYB5(EF601068.1)，大豆GmMYB54(DQ822881.1)，蛇麻草HlMYB1(AB292244.1)。

图3：嘎啦组培苗中MdSIMYB2基因对非生物逆境的响应。

B1～B4．分别用干旱(2%PEG)、NaCl(200mM)、低温(4℃)、ABA(100μM)处理嘎啦苹果组培苗0h、6h、12h、24h、48h后，MdSIMYB2基因的相对表达量。

图4：逆境处理后的MdSIMYB2转基因番茄苗生长状况。

A、野生型番茄和转基因番茄株系的半定量RT-PCR检测；B1、正常管理条件下培养6周番茄生长情况；B2.生长量一致的6周番茄苗，连续10d不浇水做干旱处理的生长情况；B3.生长量一致的6周番茄苗，经300mM NaCl处理12d后的生长情况；B4.生长量一致的6周番茄苗，4℃低温处理4d后的生长情况。其中，WT：对照；OE-1,OE-3,OE-4：过量表达的转基因株系。

图5：逆境处理后的MdSIMYB2转基因苹果幼苗生长情况。

A、野生型苹果和转基因苹果株系（MdSIMYB2基因过量表达）的半定量RT-PCR检测；其中，WT：对照；T1-T4：过量表达的转基因株系。

B、生长6个月且长势一致的嘎啦苹果生根苗和MdSIMYB2过量表达生根苗，经不同逆境处理后的生长情况。

B1：连续15d不浇水进行干旱处理的情况；B2：干旱处理后复水处理3d后生长情况；C1：经300mM NaCl处理，生长至14d的生长情况；C2：经300mM NaCl处理后，恢复生长至16d的生长情况；D1:4℃低温条件培养16d后的生长情况；D2：4℃低温条件培养后置正常环境25d后的生长情况。其中，WT：对照；T-1，T-2，T-4：过量表达的转基因株系。

五、具体实例方式

以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。

实例1：苹果MdSIMYB2基因的克隆。

一、RNA的提取及反转录：

取经200mM NaCl盐处理24h的嘎啦苹果组培苗叶片，提取其RNA并反转录：

一）利用天根试剂盒RNAplant Plus Reagment提取总RNA，具体方法如下：

1)取1g冷冻的研磨过的苹果叶片，加入5ml提取试剂（4℃），振荡混匀。

2)室温放置5分钟。

3)4℃12,000rpm离心1分钟,上清转入新的无RNase离心管。

4)每10ml上清加2ml5M NaCl,温和混匀。

5)每10ml上清加6ml氯仿，上下颠倒混匀。

6)4℃10,000离心15分钟,取上层水相转入新的无RNase离心管。

7)加入异丙醇（与所得水相等体积），混匀，室温放置10分钟。

8)4℃10,000离心15分钟。弃上清，加5-10ml75%乙醇。

9)4℃5，000rpm离心5分钟。弃上清，室温晾干3-5分钟。

10)加入100μl无RNase水，混匀，充分溶解RNA。得到RNA,-80℃保存备用,或立即进行以下反转录实验。

二）反转录cDNA第一链的合成

1）在0.2ml的微量离心管中配制下列混合液（其RNA为实例1步骤一）提取获得的；如用-80℃储藏RNA，须在冰上缓慢融解）：

2）用枪头轻混，将微量离心管放在PCR仪上（65℃5分钟）变性、退火，冰上急冷；

3）在上述微量离心管中继续加入下列反应液。

4）在PCR仪上进行反转录反应：30℃10分钟，42℃60分钟，70℃15分钟，4℃保存。合成的反转录产物cDNA，用于进行后面的相关实验。

三）cDNA末端加尾

利用TdT末端转移酶，在实例1）步骤二）反转录合成的cDNA3’末端加上Poly(C)尾巴，以此为模板进行5’RACE扩增。

在1.5ml离心管中依次加入下列试剂。

1)37℃反应30分钟；

2)加入50μl苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；离心，取上层至另一新离心管中；

3)加入50μl氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀；离心，取上层至另一新离心管中；

4)依次加入5μl3M NaAC、125μl预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60分钟；

5)4℃、12,000rpm离心15分钟，70%乙醇洗2次；

6)4℃、12,000rpm离心10分钟，风干沉淀；用20μl无菌水溶解DNA，4℃保存。获得的加尾cDNA作为模板用于后面的5′RACE扩增。

二、cDNA全长序列的获得

1）MdSIMYB2同源序列的扩增

根据NCBI查到的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物（JN-F,JB-R），以实例1中步骤一）反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

引物1JB-F：5’-AGKEGEGRTGGCGATCTTCCTAA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

引物2JB-R：5’-CGSVPIVLAATTTCATTATCAGT-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

PCR扩增体系（以下进行的PCR反应均用此体系）：

PCR反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

PCR反应结束，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测适当大小的条带，并进行回收（据Takara公司“Agarose Gel DNA PurificationKit”操作）、载体连接（取5μlSolutionⅠ，4μl PCR 回收产物与1μl pMD18-T载体连接，具体按pMD18-T Vector说明书进行）、转化（连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；挑取白色菌落，PCR扩增筛菌，同时活化，挑取含有目的条带的阳性菌落，在LB液体培养基中培养过夜）、序列测定（将摇好的菌取1ml放到1.5ml离心管中，送样测序）。在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到MdSIMYB2基因的部分片段序列。

2）MdSIMYB25’RACE扩增

据实例1步骤二中1）获得的部分片段序列，在N端设计嵌套PCR引物（5RACE1、5RACE2）和通用引物(AAP、AUAP)，进行5’RACE扩增（2轮PCR扩增）。第一轮PCR：模板为实例1步骤一获得的加尾cDNA，引物AAP和5RACE1；第二轮PCR：模板为第一轮的PCR产物，引物AUAP和5RACE2；两轮的PCR扩增反应程序相同：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

AAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.5所示；

5RACE1：5’-GAAGGCGATGGAGGCGAAGGATAAG-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.6所示；

AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.7所示；

5RACE2：5’-CTTCTTGCTCAGGTGTGTGTTCCAGT-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.8所示；

第2轮PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序，具体方法同实例1步骤二中1），得到MdSIMYB2基因的5′序列。

3）MdSIMYB23’RACE扩增

据实例1步骤二中1）获得的中间片段序列，在C端设计嵌套PCR引物（3RACE1、3RACE2）和通用引物（B26、B25），进行3’RACE扩增(2轮PCR扩增)。第一轮：模板为实例1步骤一得到的反转录cDNA，引物3RACE1和B26；第二轮：模板为第一轮PCR产物，引物3RACE1和B25；两轮的PCR反应程序相同：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

3RACE1：5’-ACTATCTCCGCCCTTCTGTCAA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.9所示；

B26：5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.10所示；

3RACE2：5’-GATAAGCCAAGGCATAGATCCCA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.11所示；

B25：5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.12所示；

得到MdSIMYB2基因的3′序列（具体过程同实例1步骤二中2））。

4）cDNA全长序列的获得

运用DNAMAN软件，将实例1步骤二之1）、2）、3）所得的测序序列进行拼接，拼出目的基因的全长cDNA，据此拼接序列设计引物MdSIMYB2-F和MdSIMYB2-R，以实例1步骤一中的反转录cDNA为模板，PCR扩增完整的cDNA全长。PCR反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性60秒、56℃退火60秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

MdSIMYB2-F：5’-ATGAGGAACCCATCGTCTTC-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.13所示；

MdSIMYB2-R：5’-CTACTCCGTTTGATCATTAA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.14所示；

反应结束后，进行电泳、产物回收、载体连接、转化、测序，从而获得MdSIMYB2的cDNA全长，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。碱法提取得到pMD18-T-MdSIMYB2的质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实例2：苹果MdSIMYB2氨基酸序列分析

一）MdSIMYB2与AtMYB5、AtMYB17、AtMYB108、PhPH4氨基酸序列比对

1）MdSIMYB2基因编码区有1095bp核苷酸，用软件DNASTAR进行序列分析发现，该基因编码364个氨基酸，蛋白大小为39.10kD，pI为8.17。利用expasy网站（http://www.expasy.org/）的分析软件和NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的数据库，对MdSIMYB2蛋白进行功能结构域和保守域比较分析，发现MdSIMYB2预测蛋白包含MYB家族特有的两个保守功能域R2R3(其中R2包括50-103位氨基酸，R3包括108-161位氨基酸)，结果见附图1A。

2)从NCBI数据库中搜索出AtMYB5(NM_112200.2)、AtMYB17(NM_115989.3)、AtMYB108（NM_111525.3）、PhPH4（AY973324.1）的氨基酸序列。

3）运用DNAMAN软件，将MdSIMYB2（SEQ.ID.NO:2）与AtMYB5、AtMYB17、AtMYB108、PhPH4的氨基酸序列进行比对。发现MdSIMYB2与AtMYB5（NM_112200.2）、AtMYB17（NM_115989.3）、AtMYB108（NM_111525.3）、PhPH4（AY973324.1）具有较高的同源性，尤其在N端具有典型MYB家族的R2R3结构域（附图1B），属于MYB家族，为苹果中调控逆境的基因。

二）与不同物种中MYB家族的蛋白聚类分析

1）NCBI数据库中搜索出不同物种中MYB家族的氨基酸序列，具体包括：白花紫露草TfMYB6(AY456184.1)，棉花GhMYB1(L04497.1),毛果杨PtMYB180(XM_002327312.1)、PtMYB111（XM_002302716.1）,拟南芥AtMYB5(NM_112200.2)、AtMYB17（NM_115989.3）、AtMYB108(NM_111525.3),矮牵牛PhPH4(AY973324.1),大豆GmW2(AB597932.1),水稻OsMYB4（D88620.1）,车前草CpMYB10(AF510112.1)，百脉根LjTT2a（AB300033.2），大麦HvMYB2(X70876.1)，红皮云杉PgMYB5(EF601068.1)，大豆GmMYB54(DQ822881.1)，蛇麻草HlMYB1(AB292244.1)。

2）进化树分析：利用DNAMAN5.0软件，将搜索得到的不同物种中MYB家族的蛋白进行聚类分析，构建***进化树，发现苹果MdSIMYB2与矮牵牛PhPH4和拟南芥AtMYB5的亲缘关系最近（附图2）。

实例3：MdSIMYB2基因对非生物逆境的响应

1）生长状况一致的苹果嘎啦组培苗进行逆境处理（未处理的作对照），分别用干旱（PEG2%）、NaCl（200mM）、低温（4℃）、ABA(100μM)处理0h、6h、12h、24h、48h。处理好的材料于液氮中固定，-80℃保存，最后一起提取RNA并反转录得到cDNA。

2）设计MdSIMYB2基因的特异引物（MdSIMYB2-BDL-R）和苹果内参引物（Md18S-F、Md18S-R）。

Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.15所示；

Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.16所示；

MdSIMYB2-BDL-R：5’-GATAGTTCATCCAGCGG-3’ 其序列如SEQ.ID.NO.17所示；

3）以Md18S-F和Md18S-R为引物、实例3步骤1）中的cDNA为模板进行PCR反应，调整模板cDNA，使其浓度一致。

反应程序：94℃预变性4分钟；循环参数为94℃变性25秒、56℃退火25秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；72℃后延伸l0分钟。扩增产物进行凝胶电泳分析，借助仪器分析（LabAssistant TM Gel3000Series凝胶成像分析仪），将cDNA稀释至适当倍数，反复进行几次，最后使其浓度一致。

4）以浓度一致的cDNA为模板、MdSIMYB2-F（SEQ.ID.NO.13）和MdSIMYB2-BDL-R（SEQ.ID.NO.17）为引物进行半定量RT-PCR，检测逆境处理后MdSIMYB2基因的表达差异。

反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性25秒、58℃退火25秒、72℃延伸35秒，运行32个循环；72℃后延伸10分钟。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果显示MdSIMYB2基因经干旱、盐、低温、ABA胁迫处理后表达上调，表明该基因受干旱、盐、低温和ABA胁迫诱导（附图3）

实例4：MdSIMYB2基因载体的构建

一）MdSIMYB2基因过量表达载体的构建

为研究MdSIMYB2基因的功能，将包含有MdSIMYB2基因编码区在内的共1095bp片段正确***表达载体PBI121上。

1）利用DNAMAN等软件，根据分离出的MdSIMYB2基因的核苷酸序列（SEQ.ID.NO:1），设计带酶切位点的引物EMdSIMYB2-F和EMdSIMYB2-R，并以实例1步骤二4）中所保存的pMD18-T-MdSIMYB2的质粒DNA为模板，进行PCR反应。

EMdSIMYB2-F：5’-GCTCTAGAGCTTTACAATGAGGAACCCATCG-3’其序列如SEQ.ID.NO.18所示；

划横线部分为XbaⅠ酶切位点;

EMdSIMYB2-R：5’-GCGTCGACCAACCGCATTGCTTGTTCAAC-3’其序列如SEQ.ID.NO.19所示；

划横线部分为SalⅠ酶切位点;

2）PCR反应结束，进行电泳、产物回收、载体连接、转化、测序，选取正确的阳性克隆，LB液体培养基培养阳性克隆及PBI121空载体的菌株，碱式法提取其质粒DNA及PBI121空载体质粒，并用内切酶Xba Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切。

3）用T4连接酶将回收片段MdSIMYB2和pBI121载体进行连接，筛选阳性克隆测序，确认得到正确的大肠杆菌重组子pBI121-MdSIMYB2，转化农杆菌LB4404感受态细胞。

4）PCR鉴定，挑取阳性菌落。得到正确的农杆菌重组子pBI121-MdSIMYB2单克隆，用于后面番茄和苹果的转化。

实例5：获取转基因番茄

1）播种：先把番茄种子进行消毒处理：分别用70%酒精消毒1min、0.7%次氯酸钠消毒23-25min，无菌水冲洗3次，吸干水。处理好的种子平铺在种子萌发培养基上，暗培养至胚根长出（4d），光培养（5-7d）至子叶完全展开。

2）预培养：剪下完全展开的子叶，去两端、留中间（约0.5cm）,摆放（叶片向光面向上）于预培养基上，倒置培养2d。

3）侵染菌液的准备：挑取农杆菌单克隆菌落于10mL YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养48h（OD600：0.6-0.8)；取lmL菌液加入新鲜的20mL YEP液体培养基内，振荡培养5h(OD600:06-0.8）。离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，备用；

4）侵染：将经预培养的番茄叶片浸入菌液10min（期间多次摇晃），弃菌液，并用无菌滤纸吸净，转移至共培养基上，封口，28℃暗培养2d。

5）共培养后的番茄叶用含羧苄青霉素(250mg/L)的无菌水洗涤3次，灭菌滤纸吸干，移至分化培养基上光下培养。每隔15d更换一次培养基。

6）待芽分化长至1cm左右时，切下，部分继代培养，部分移入生根培养基上生根。根系发育好后，炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理。

注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行；

番茄种子萌发培养基：1/2MS；

番茄预培养、共培养培养基：MS+IAA0.5mg/L+ZT2mg/L；

番茄分化培养基：MS+IAA0.5mg/L+ZT2mg/L+Kana30mg/L+Cb250mg/L；

番茄生根培养基：MS+IAA0.1mg/L；

培养条件：25-28℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux。

实例6：获取转基因苹果

1）预培养：取培养4周左右的嘎啦组培苗上部3-4片展开的嫩叶，在垂直叶脉方向轻划2道，摆放（叶片正面朝上）在预培养基上，暗培养2d；准备好侵染用的农杆菌菌液（具体步骤同实例5中的3）。

2）侵染：用农杆菌菌液侵染预培养的苹果叶片20min(期间摇晃几次)，无菌滤纸吸干菌液，移至MS基本培养基上共培养，暗培养2d。

3）分化培养：共培养后的苹果叶片用含羧苄青霉素(250mg/l)的无菌水洗涤3次，用含羧苄青霉素(250mg/l)的MS液体培养基洗1次，灭菌滤纸吸干，移至分化培养基上暗培养3周。更换新的分化培养基，进行光培养。抗性再生芽分化出后，切下小芽，在增殖培养基上扩繁（每4周继代1次）。

注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行。

嘎啦苹果组培苗预培养基：MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.15mg/l；

嘎啦苹果分化培养基：MS+TDZ2.0mg/l+IAA0.2mg/l+Cb250mg/L；

嘎啦苹果组培苗增殖培养基：MS+6-BA0.7mg/l+NAA0.15mg/l+Cb250mg/L。

培养条件：25-28℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux。

实例7：对转基因番茄进行抗干旱、低温和盐能力分析

对纯合体转基因番茄株系进行抗逆境能力分析，以确定转基因植株的功能。

1）MdSIMYB2基因在不同株系转基因番茄的相对表达量。

以经抗生素筛选的番茄转化株系DNA为模板,以35S和MdSIMYB2-R（SEQ.ID.NO.14）为引物进行PCR反应筛选转基因株系；提取其中4个转基因株系的RNA，进行半定量RT-PCR（具体方法见实例3，番茄的内参引物为：leACTIN-F,LeACTIN-R），检测转基因株系中MdSIMYB2基因的表达水平。MdSIMYB2基因在不同株系中的表达量不同，其中OE-4表达量最高（附图4A），选取表达量较高的3个株系OE-1,OE-3,OE-4，几代单株收种子，获得纯合体种子进行后续转基因功能验证。

35S:5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3' 其序列如SEQ.ID.NO.20所示

LeACTIN-F:5'-CTTCAGTCCACAATCGGTGG-3' 其序列如SEQ.ID.NO.21所示；

LeACTIN-R:5'-CATTCCGAGTTGAGCTGCTG-3' 其序列如SEQ.ID.NO.21所示；

2）转基因番茄的抗干旱、低温和盐能力分析：

将纯合转基因番茄种子OE-1,OE-3,OE-4和野生型对照WT，种在装有无菌土的花盆中，正常管理生长6周。对状态一致的转基因番茄和对照，分别进行干旱、盐、冷逆境处理，观察各自生长状况。B1：正常生长至6周番茄苗作对照；B2：生长量一致的6周番茄苗，连续10d不浇水做干旱处理的生长状况:B3:生长量一致的6周番茄苗，用300mM NaCl处理12d后的生长状况；B4：生长量一致的6周番茄苗，4℃低温处理4d后的生长状况。结果显示：经干旱处理后转基因植株生长较好，而野生型萎蔫；经300mM NaCl处理后野生型萎蔫，叶片变黄，老叶落叶严重，转基因株系叶片变黄较轻，生长状态较好；经4℃冷处理后转基因株系也明显比野生型生长状态好，野生型株系萎蔫、有冻伤。以上结果说明：MdSIMYB2基因转入番茄中，提高了转基因番茄植株的抗盐、抗旱及抗低温能力。

实例8：对转基因嘎啦苹果幼苗的抗性分析

1）MdSIMYB2基因在转基因苹果不同株系的相对表达量。

利用筛选培养基（含30mg/L卡那霉素）筛选抗卡那霉素阳性的候选转基因株系，共获得4个35S：MdSIMYB2阳性株系(T1-T4)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养时，每株系各取0.1g左右的组培苗，提取相应的RNA，反转录并进行半定量RT-PCR检测（具体方法见实例3），以确定这些株系中MdSIMYB2基因的表达水平。结果显示，MdSIMYB2基因在T-1,T-2,T-3及T-4中过量表达（附图5A）。选择T-1,T-2,T-4部分继续扩繁，部分进行移入生根培养基上进行生根培养。根系长好（约4周），经炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理。

2）逆境处理：选生长状态一致的3个转基因株系（T-1,T-2,T-4）和对照，进行干旱、盐及冷条件下逆境处理。B1：连续15d不浇水,干旱处理后的生长状态；B2：干旱处理后，正常浇水管理3d后的恢复生长状况；C1：用300mM NaCl处理3次（3d处理1次）后在14d的生长状况；C2：盐处理后至16d的生长状况；D1：4℃低温条件培养16d后的生长状况；D2：低温处理后，在22℃正常温度培养至25d的恢复生长状况。

3）对苹果幼苗非生物逆境处理后观察对照和转基因株系生长情况。B1～B2：干旱处理后对照萎蔫，转基因株系也发生萎蔫，但复水后转基因株系能部分或完全恢复生长，而对照没有恢复生长，因过度干旱而死亡；C1～C2：在盐处理后，对照叶片干枯，几乎不能正常生长，而过量表达株系虽受盐害严重，但基本能生长；D1～D2：冷处理16d后对照幼叶萎蔫严重，叶片因冷而几乎完全变红，几乎不能恢复生长；而转基因株系虽然叶片也因冷而变红，停止生长，但进行正常温度管理恢复生长后，基本能恢复正常生长。这些结果充分说明了MdSIMYB2基因是一个抗逆相关的基因，该基因的过量表达可以提高转基因苹果的抗逆能力。

嘎啦苹果生根培养基：1/2MS或MS+IAA0.2mg/l。

根据上述技术，从苹果中分离到了一个R2R3类型的MYB基因MdSIMYB2，通过在番茄和苹果中转基因功能分析看出：它在抵抗外界干旱、低温和高盐中有明显作用，说明MdSIMYB2基因能参与到植物抵抗非生物胁迫过程中。可将该基因转化小麦、玉米、棉花等一年生农作物，或苹果、梨等多年生木本植物，提高其抗逆境能力，尤其是抗盐、干旱和低温的能力，提高产量，产生重要的经济效益和社会效益。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

Claims

1.一种苹果MdSIMYB2基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.如权利要求1所述的苹果MdSIMYB2基因在提高转基因苹果抗干旱、抗盐和抗低温能力中的应用。