CN102597223A - 生产天然杀伤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
生产含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，其特征是涉及在存在生物应答修饰剂和已经受处理而丧失增殖能力的细胞的情况下，对含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的细胞群进行扩增培养的步骤等。
Description
技术领域
本发明涉及获得用于医学领域的高纯度天然杀伤细胞群的方法。
本申请要求基于于2009年9月11日提交的日本专利申请号2009-210178的优先权，其完整内容并入到本文中。
背景技术
天然杀伤细胞（NK细胞）是在免疫反应中发挥作用的淋巴细胞。由于天然杀伤细胞具有多种功能，特别是具有强的杀伤肿瘤细胞的活性，因而认为该细胞是免疫学监督机制的重要成员，所述机制用于去除在活体内已变得肿瘤性或正变得肿瘤性的异常细胞。因此，对于在肿瘤治疗中有效利用该细胞已进行了长时间的研究。
例如，当向外周血单核细胞（PBMC）的培养基中添加大量的白介素（IL）-2（一种淋巴因子）时，所谓的淋巴因子激活性杀伤淋巴细胞（LAK细胞）在人中增殖约一周。普遍已知LAK细胞包括许多NK细胞。在肿瘤的过继性免疫疗法中普遍使用LAK细胞。也已知LAK细胞在感染性疾病中有效，并作为治疗难以用抗生素治愈的感染性疾病的对策引起注意。
迄今为止，已报道了多种离体培养NK细胞的方法（例如，非专利文献1），其分为使用辅助细胞的方法和不使用辅助细胞的方法。不使用辅助细胞的方法是包括用IL-2或IL-15刺激PBMC的方法。然而，该方法通常导致低的细胞扩增率（cell expansion rate）和培养后低的NK细胞含有率，因此，可能不能获得根据PBMC供体的治疗必需量的NK细胞。此外，已报道当为了获得大量的NK细胞而延长培养期时，细胞毒性活性降低。
另一方面，使用辅助细胞的方法是例如包括使用已经受放射线的K562细胞（其为B淋巴细胞株）、Daudi细胞（其为恶性淋巴细胞株）或HFWT细胞（其为肾母细胞瘤细胞株）的方法。此外，也已经报道了这样的方法，所述方法包括使用转染了细胞因子表达基因的上述肿瘤细胞作为辅助细胞。然而，由于这些辅助细胞是肿瘤细胞、异源细胞和基因转染的细胞，因而从向活体内注射与辅助细胞混合培养的NK细胞的观点出发，必需大量地注意来确保安全性。此外，也已经报道了包括使用放射线照射的PBMC作为辅助细胞的方法（专利文献1）。然而，该方法必需去除CD3阳性细胞作为含有NK细胞的细胞群的步骤，并且还必需从供体制备大量的PBMC。在开始培养22天后，该方法的细胞扩增率最大是约140倍。
生物应答修饰剂是调节活体的免疫机制的物质，预期对多种疾病具有治疗效果，且用于癌症的免疫疗法中。然而，已知所述试剂不活化淋巴细胞功能至预期的这种程度。出于该原因，在目前情况下，向需要活化淋巴细胞功能的患者直接施用所述试剂以活化该功能的这种治疗一般不进行，并且仅用于有限的情况。生物应答修饰剂的作用机制不包括对肿瘤细胞的直接作用，并且认为生物应答修饰剂活化施用该试剂的活体固有的免疫细胞，并通过免疫细胞的作用施加抗肿瘤效果。因此，施用生物应答修饰剂的效果受接受生物应答修饰剂施用的活体的天然免疫学状态的极大影响，并受活体的背景因子的影响。因而，认为通常存在个体之间的抗肿瘤效果差异以及取决于患者的临床状态的作用强度差异。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO2007/103901
非专利文献
非专利文献1：Cho D和Campana D，Korean J Lab Med，2009，第29卷，第89-96页。
发明内容
发明要解决的问题
对于预期具有高治疗效果的NK细胞，在目前的情况下尚未建立有效获得高纯度NK细胞的方法。因此，需要开发其他的细胞增殖方法用于制备NK细胞。
解决问题的手段
本发明人持续地深入研究各种培养条件，特别是淋巴细胞的扩增培养（expansion culture），结果发现了有效扩增培养NK细胞的方法。因而完成了本发明。
换言之，本发明涉及：
[1]用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的细胞群的步骤，
[2]根据[1]的方法，其中生物应答修饰剂是细菌来源的制剂，
[3]根据[2]的方法，其中生物应答修饰剂是选自OK-432、BCG、化脓性链球菌（Streptcoccus pyogenes）、短棒杆菌（Corynebacterium parvum）及其细胞壁骨架的细菌来源的制剂，
[4]根据[1]-[3]的任一项的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是选自已经受消除增殖能力处理的外周血单核细胞、T细胞、T细胞子集和B细胞的细胞，
[5]根据[4]的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是已经受消除增殖能力处理的人工扩增培养的T细胞，
[6]根据[1]-[5]的任一项的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是源自与天然杀伤细胞或者能够分化成天然杀伤细胞的细胞相同的个体的细胞，
[7]根据[1]-[6]的任一项的方法，其中在存在已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下扩增培养的步骤包括实施多次的细胞添加，
[8]根据[1]-[6]的任一项的方法，其中外周血单核细胞用作天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞，
[9]通过根据[1]-[8]的任一项的方法获得的细胞群，
[10]含有从根据[9]的细胞群分离的NK细胞的细胞亚群，
[11]含有根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群的药物，
[12]根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群在生产药物中的用途，
[13]治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用有效量的根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群的步骤，
[14]用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群和/或细胞亚群的方法，包括冷冻根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群、解冻冷冻的细胞群和/或细胞亚群、然后在存在细胞因子的情况下培养细胞群和/或细胞亚群的步骤，和
[15]用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在生物应答修饰剂的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的分离的和/或纯化的细胞群的步骤。
发明的效果
根据本发明，提供了用于制备NK细胞的新方法。由于本发明的方法可以提供具有高的细胞增殖率和强的细胞毒性活性的细胞，本发明获得的NK细胞可以优选用于例如过继性免疫疗法。因此，预期本发明的方法大大有助于医学领域。
具体实施方式
如本文中使用的，“NK细胞”意指含有大颗粒淋巴细胞的细胞群，所述大颗粒淋巴细胞在没有抗原敏化的情况下非MHC限制性地损伤肿瘤细胞和感染病毒的细胞，并用于维持活体的稳态。NK细胞的代表性表面标志物已知CD56、CD94和CD16。此外，NK细胞是CD3阴性的。
如本文中使用的，“外周血单核细胞（PBMC）”意指包含源自外周血的淋巴细胞和单核细胞的细胞群，并包括T细胞、B细胞和NK细胞。
如本文中使用的，“具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽”意指在分子中含有源自纤连蛋白的氨基酸序列或其一部分的多肽，并且其实例包括纤连蛋白或纤连蛋白的片段。纤连蛋白或纤连蛋白的片段可以是天然来源的分离多肽、人工合成多肽或通过遗传工程制备的重组多肽中的任一种。纤连蛋白可以从天然存在的物质中以基本纯的形式制备，例如基于Ruoslahti E.等人，J. Biol. Chem., vol. 256，No. 14，第7277-7281页 (1981)的公开内容。在本文中，用于本发明中的纤连蛋白或具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽基本不含自然界中与纤连蛋白共存的其他蛋白质。上述多肽在本发明中可以单独使用或作为多种的混合物使用。
此外，有许多纤连蛋白的已知剪切变体。本发明中使用的多肽可以是具有源自任何变体的氨基酸序列的多肽，只要它产生本发明所需的效果。例如，在源于血浆的纤连蛋白的情况下，已知缺失了在细胞结合结构域上游存在的被称为ED-B的区域，和在细胞结合结构域与肝素结合结构域之间存在的被称为ED-A的区域。具有此类血浆来源的纤连蛋白的氨基酸序列的多肽也可用于本发明中。
关于可用于本发明中的纤连蛋白片段和片段制备的有用信息可自J. Biochem., vol.110, p.284-291 (1991)、EMBO J., vol.4, No.7, p.1755-1759 (1985)、Biochemistry, vol.25, No.17, p.4936-4941 (1986)、WO2007/142300等获得。此外，编码纤连蛋白的核酸序列和纤连蛋白的氨基酸序列公开在Genbank登录号NM002026和NP002017中。
纤连蛋白的结构域结构分为7个结构域。纤连蛋白的氨基酸序列含有三种相似的序列，且其整体由每种这些序列的重复构成。三种相似序列分别被称为I型、II型和III型。其中，III型由71至96个氨基酸残基构成，且这些氨基酸残基的匹配率是17%至40%。纤连蛋白中有14个III型序列，其中，第8、第9和第10个序列（在后文中，分别被称为III-8、III-9和III-10）包含在细胞结合结构域中，且第12、第13和第14个序列（在后文中，分别被称为III-12、III-13和III-14）包含在肝素结合结构域中。此外，被称为IIICS的区域存在于肝素结合结构域的C端侧。在IIICS中，存在被称为CS-1的区域，该区域由25个氨基酸残基组成，且具有结合VLA-4的活性。可用于本发明中的纤连蛋白片段可以是包括III-7、8、9、11、12、13或CS-1的任何结构域的片段，或进一步地，可以是其中重复连接了复数个结构域的片段。可用于本发明中的纤连蛋白片段的实例包括含有细胞粘附结构域、肝素结构域或作为VLA-4的配体的CS-1结构域的片段，所述细胞粘附结构域包括VLA-5的配体。片段的实例包括在J. Biochem.，第110卷，第284-291页 (1991)中描述的CH-271、CH-296、H-271和H-296，及其衍生物或修饰物。CH-296是以名称RetroNectin（注册商标）可商购的。
在本文中，“生物应答修饰剂”也被称为生物学应答修饰剂（BRM），意指一类改善活体内的非特异性免疫学应答能力的物质。作为生物应答修饰剂，已知细菌来源的制剂（OK-432、BCG（卡介苗）、化脓链球菌、短棒杆菌及其细胞壁骨架）、担子菌来源的多糖（香菇多糖、裂裥菌素、PSK等）、合成物质（吡喃共聚物、左旋咪唑）和细胞因子。“OK-432”意指通过用青霉素处理A类3型溶血性化脓链球菌的减毒天然突变菌株（Su菌株）而获得的细菌来源的制剂的一般名称。该制剂以Picibanil（注册商标）作为商标名销售。
本发明具体说明如下。
如本文中使用的，“消除增殖能力的处理”没有特别的限制，只要所述处理使细胞丧失或降低其增殖能力。处理的实例包括化学处理和/或物理处理。化学处理的实例包括用化学药物（***等）处理和用抗癌剂（有丝***抑制剂，例如丝裂霉素C等）处理。物理处理的实例包括放射处理、温和加热（加热/加温）处理、冷冻/解冻处理或超声处理。例如，当通过放射实施处理时，可以使用例如γ射线和X射线。
由于已经受消除增殖能力的处理的细胞丧失或降低了涉及增殖的能力，例如细胞***和DNA合成，因而相比未处理过细胞，细胞的增殖能力是降低的。例如，虽然已经受放射处理的细胞降低了增殖能力，但细胞表现出与刚处理过的活细胞相同的形式和特征，并维持分泌例如细胞因子等蛋白质的代谢能力。
1、制备NK细胞的方法
本发明的制备NK细胞的方法包括在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的步骤。根据本发明的制备NK细胞的方法，相比常规的方法，可以稳定地制备具有极高扩增培养率、极高NK细胞含有率和极高的NK细胞细胞毒性活性的细胞群。在本文中，扩增培养率意指相对于培养开始的时间的增殖率，并且该倍率是通过用培养结束时的细胞数除以培养开始时的细胞数、然后用所获得的值除以传代培养时使用的细胞数的比率来计算的。
本发明方法的一个特征是使用已经受消除增殖能力处理的细胞。已经受消除增殖能力处理的细胞没有特殊的限制。在本发明的优选的方面，使用PBMC、T细胞、T细胞子集（例如，CD4阴性T细胞、CD8阳性T细胞等）、B细胞或通过培养这些细胞制备的细胞群。
制备PBMC的方法没有特殊的限制。可以从血液或血细胞组分制备PBMC，所述血细胞组分是通过分离来自血液的血浆获得的，其通过已知的方法例如密度梯度离心法进行。可以通过已知的方法，从PBMC或另一种生物学样品（外周血、骨髓液、脐带血等）中分离B细胞、T细胞或T细胞子集。此外，通过培养上述细胞而增加细胞数所获得的细胞群也可用于本发明中。例如，还使用通过扩增培养含有T细胞或T细胞前体细胞的细胞群获得的T细胞群。在T细胞群配制中，通过共存具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽，改善了T细胞的增殖效率。换言之，可以从少量的材料（血液或PBMC）中获得大量的T细胞。
如下实施在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下T细胞的扩增培养。
在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下培养的细胞群可以是含有T细胞或T细胞的前体细胞的细胞群，并可以使用体液，例如外周血、骨髓液、脐带血和淋巴液。可选地，可以使用从这些体液或各种身体部分或器官分离的细胞群，例如PBMC、T细胞、T细胞子集或其混合物。在制备用于治疗目的移植到活体中的NK细胞中，这些细胞或细胞群可以源自相同的个体，即，与后文所述的“NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞”相同的供体。特别优选地，期望“NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞”和“已经受消除增殖能力处理的细胞”都源自患者本身。
在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下细胞群的培养可以参考WO 03/080817的详细描述来实施。当在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下培养细胞群时，扩增培养率变得极高，且可以容易地制备大量的细胞。
用于T细胞扩增培养的培养开始时的细胞浓度是例如1-1×108细胞/mL，优选10-5×107细胞/mL，更优选1×102-2×107细胞/mL，但并非特别限制于此。
用于T细胞扩增培养的培养基可以是用于细胞培养的已知培养基，且培养基可进一步含有各种细胞因子、合适的蛋白质或其他组分。细胞因子的实例包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等。优选地，使用含有IL-2的培养基。培养基中的IL-2的浓度没有特殊的限制，且培养基可优选含有0.01-1×105 U/mL，更优选1-1×104 U/mL的IL-2。合适的蛋白质的实例包括抗CD3抗体和抗IL-4抗体。用于本发明的抗CD3抗体的实例包括但不限于优选地抗人CD3单克隆抗体，更优选OKT3（Science，1979，第206卷，第347-349页）。还可以向培养基中添加淋巴细胞刺激因子，例如凝集素等。此外，可以使用包括下列的培养基：基于双聚羧酸乙基次膦酸（bisphosphinic acid）的化合物例如帕米膦酸（pamidronate）或唑来膦酸（zoledronate）、基于焦磷酸单酯的化合物例如异戊烯焦磷酸或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸、磷酸卤代醇、磷酸环氧化物等。培养基中的组分浓度没有特别的限制，只要获得所需的效果。
此外，还可以向培养基中添加血清或血浆。添加到培养基中的血清或血浆的量没有特殊的限制，为按体积计大于0至20%，优选大于按体积计0至10%。例如，可以使用自体来源的血清或血浆。
用于培养的细胞培养仪器没有特殊的限制，可以使用例如培养皿、摇瓶、袋子、生物反应器等。袋子可以使用例如可渗透CO2气体的袋子用于细胞培养。当工业制备大量的淋巴细胞时，使用生物反应器是有利的。尽管培养可以在开放***或密闭***的任一中进行，从得到的淋巴细胞的安全性的观点看来，优选在密闭***中进行培养。
可以在已知的培养条件下实施培养，并且可以应用在正常细胞培养中使用的条件。例如可以在37℃、5% CO2等的条件下实施培养。可以通过在合适的时间间隔下向细胞培养液中添加新鲜的培养基来稀释细胞，培养基可以用新鲜的培养基交换，或者可以更换细胞培养仪器。如下文所述，根据制备的淋巴细胞的种类，可以恰当地选择所使用的培养基、同时使用的其他组分等。培养期是例如1至40天，优选2至35天，更优选3至30天，从实现更高的扩增培养率的观点出发，3至25天的培养期是优选的。
用于培养中的包括具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的组分可以溶解并存在于培养基中，或者可以固定在合适的固相上，例如用于细胞培养的载体，如细胞培养仪器、珠子、膜或载玻片。例如，可以根据WO 97/18318描述的方法实施抗CD3抗体的固定，并且可以根据WO 00/09168描述的方法实施具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的固定。
对于消除增殖能力的处理，可以使用抗癌剂，例如丝裂霉素C。用于抗癌剂处理的条件没有特殊的限制，只要受处理细胞的增殖能力丧失或降低。丝裂霉素C的浓度是例如1至100μg/mL，优选2至50 μg/mL，合适的是5至30 μg/mL。处理温度是例如30至40℃，优选35℃至38℃。处理温度是例如0.1至2小时，优选0.5至1小时。
当通过放射线（例如γ-射线或X-射线）照射实施消除增殖能力的处理时，放射线的照射量没有特殊的限制，只要受照射的细胞的增殖能力丧失，例如，所述量是100至20000R（0.88至176 Gy），优选1000至8000 R（8.8至70 Gy）。
当消除增殖能力的处理是通过温热处理实施时，处理温度和处理时间没有特殊的限制，只要细胞的增殖能力丧失。处理温度是例如40至55℃，优选42至50℃，处理时间是例如0.1至8小时，优选0.2至4小时。
在培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群中，已经受消除增殖能力处理的细胞的细胞浓度没有特殊的限制，是例如1至1×108细胞/mL，优选1×101至5×107细胞/mL，更优选1×102至2×107细胞/mL。
本发明的方法的特征是，在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群。
在本发明中，使用含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群。在本文中，能够分化成NK细胞的细胞没有特殊的限制，只要细胞具有分化成NK细胞的能力。作为细胞群，本发明中可以使用体液，例如外周血、骨髓液、脐带血或淋巴液，或者从体液、或各个机体部分或器官分离的细胞群（例如，PBMC、脐带血单核细胞、骨髓细胞、造血干细胞等）。作为细胞或细胞群，可以直接使用或在冷冻保藏后使用从活体收集的细胞或细胞群。此外，本发明中还可以使用通过各种衍生操作或分离操作从该细胞群中获得的细胞群，例如基于特定的细胞表面标志物从细胞例如PBMC中分离的细胞子集，例如分离的NK细胞群或去除了CD3阳性细胞的细胞群。此外，本发明中可使用纯化的NK细胞群或NK细胞株。本发明方法的特征是，例如，即使当从具有低含量NK细胞的PBMC直接开始培养时，也可以有效获得具有高的NK细胞含量和具有强的细胞毒性活性的细胞群。
在本发明的方法中，含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的培养期是例如3至40天，优选5至35天，更优选10至30天，从实现更高的扩增培养率的观点出发，14至25天的培养期是优选的。
在含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的培养中，NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的浓度没有特殊的限制，是例如1至1×108细胞/mL，优选1×101至5×107细胞/mL，更优选1×102至2×107细胞/mL。含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的细胞数与已经受消除增殖能力处理的细胞群的细胞数的比例没有特殊的限制，是例如1:0.1至20，优选1:1至10。
在开始培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群时，向培养基中添加已经受消除增殖能力处理的细胞群。此外，除开始培养时以外，通过一次或多次（例如在培养过程中1次、2次或3次）添加已经受消除增殖能力处理的细胞群，刺激含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群，从而可进一步改善扩增培养率。在没有特殊限制的情况下，例如，在开始培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群后第5至第9天之间的优选时间和/或在第11至第15天之间的优选时间，可以再次添加已经受消除增殖能力处理的细胞。可以通过合适的方法冷冻保存已经受消除增殖能力处理的细胞群，直到使用为止。
作为本发明方法的另一个特征的生物应答修饰剂没有特殊的限制，只要其具有所需的NK细胞增殖诱导活性。在优选的方面，用于本发明中的生物应答修饰剂可以是微生物来源的制剂，特别优选地，使用OK-432、BCG、化脓性链球菌（Streptcoccus pyogenes）、短棒杆菌（Corynebacterium parvum）或其细胞壁骨架。
添加到培养基中的生物应答修饰剂的量没有特殊的限制，其可以根据进行扩增培养的细胞的使用量和共同应用的已经受消除增殖能力处理的细胞群的量来恰当选择。当使用OK-432时，以终浓度0.001至1 KE/mL、优选0.005至0.5 KE/mL、更优选0.01至0.2 KE/mL将OK-432添加到培养基中，本发明中没有特殊的限制。一般地，生物应答修饰剂可以在培养开始时添加到培养基中。
除了使用生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞外，用于本发明方法中的培养基没有特殊的限制。可以使用已知适合培养淋巴细胞的培养基。例如，可以使用用于NK细胞的可商购的培养基（CellGenix 的CellGro SCGM，TAKARA BIO INC.的GT-T50等）。除本发明的活性组分外，培养基可含有合适的蛋白质、细胞因子或其他组分。优选地，含有IL-2的培养基用于本发明中。培养基中的IL-2的浓度没有特殊的限制，是例如0.01至1×105 U/mL，优选0.1至1×104 U/mL。
培养基中可以添加血清或血浆。他们向培养基中添加的量没有特殊的限制，其按体积计大于0至20%，优选按体积计大于0至5%。当含有NK细胞的制备细胞群或从该细胞群分离的细胞亚群转移到活体中时，优选使用与NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞具有相同来源（换言之，来自相同的个体）的血清或血浆。此外，可以向培养基中添加血液来源的蛋白质，例如血清白蛋白。在此情况下，优选使用分离的血液来源的蛋白质，即，基本不含其它源自血液的组分的血液来源的蛋白质。还可以使用可获得的重组的血液来源的蛋白质。
在本发明方法的培养过程中，可以按合适的时间间隔或根据细胞数的增加实施细胞培养液的稀释、培养基的交换或细胞培养仪器的更换。
此外，还可以根据培养NK细胞或LAK细胞的一般条件，实施本发明的方法。例如，该方法可以根据Klin Padiatr，2005，第217卷，第345-350页；Journal of Experimental Medicine，1982，第155卷，第1823-1841页；Current Protocols in Immunology，Supplement 17，UNIT 7.7。
本发明进一步提供了用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，特征是包括在存在生物应答修饰剂的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的分离的和/或纯化的细胞群的步骤。例如，提供了用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在OK-432的情况下培养纯化的CD3阴性CD56阳性细胞。在该方法中，通过在存在已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下培养细胞群，改善含有天然杀伤细胞的细胞群的扩增培养率。
2、通过本发明的方法获得的含有NK细胞的细胞群、含有细胞群的药物、细胞群的用途、和使用细胞群的治疗方法或预防方法
此外，本发明提供了通过用于制备本发明的NK细胞的方法获得的含有NK细胞的细胞群，和从该细胞群分离的细胞亚群。此外，本发明提供了含有细胞群和/或细胞亚群作为活性成分的药物（治疗剂）；细胞群和/或细胞亚群用于生产药物的用途；以及治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用有效量的细胞群和/或细胞亚群的步骤。
相比通过常规方法获得的细胞群，通过本发明的方法获得的含有NK细胞的细胞群和/或细胞亚群（在下文中，简单称为本发明的细胞群）具有极高的NK细胞含量，极高的细胞毒性活性，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），和极高的多功能能力。特别是在本发明的细胞群中，CD3阴性（NK细胞表面标志物）CD56阳性（NK细胞表面标志物）细胞占至少50%或更多。本发明的细胞群含有高比例的具有高细胞毒性活性的CD16 阳性CD56阳性细胞。CD16 阳性CD56阳性细胞占细胞群的至少50%，优选60%或更多，更优选70%或更多。此外，本发明的细胞群含有高比例的CD94和CD56阳性的细胞，所述细胞是成熟的NK细胞。CD94 阳性CD56阳性细胞占细胞群的至少50%，优选60%或更多，更优选70%或更多。本发明的细胞群是高度功能化的NK细胞群，含有高比例的表达下列的细胞：被认为涉及NK细胞的细胞毒性活性的NKp44和NKG2D，NK细胞常见的表面抗原标志物NKp46，在活化的NK细胞中表达的CD25，涉及淋巴细胞归巢的CD62L，也已知作为活化诱导分子（AIM）、在白细胞活化初期阶段表达并涉及NK细胞中的靶向细胞溶解作用的CD69，或者是趋化因子CXCL9和CXCL10的配体并被认为表现出向表达这些趋化因子的癌细胞迁移或在癌细胞中积累的高能力的CXCR3。
NK细胞的多功能能力一般允许生产细胞因子例如干扰素（IFN）-γ或肿瘤坏死因子（TNF）-α，或通过细胞表面抗原例如CD107a评估细胞群的免疫应答。含有通过本发明制备的NK细胞的细胞群含有高比例的生产多数细胞因子或者表现出多种细胞表面抗原的细胞，并且在细胞免疫疗法中作为具有多功能能力的多功能细胞群非常有效。
可以通过本发明的细胞群与合适的细胞因子例如干扰素α（IFN-α）的共存来增强本发明的细胞群的细胞毒性。此类处理的细胞群可以对多种癌细胞施加细胞毒性。
可以将基因转移到本发明的细胞群中。例如，可以导入编码对靶物质具有亲和力的蛋白质（例如，T细胞受体（TCR）、抗体、受体等）、细胞表面抗原、酶、信号转导分子（例如，细胞因子）、其功能结构域（例如，抗体或TCR的可变区、单链抗体、受体的信号结构域）、或具有功能结构域的嵌合蛋白的基因。转移基因的方法没有特殊的限制，合适的方法可选自并可使用已知的基因转移方法。作为基因转移方法，本发明中可使用使用病毒载体的方法或不使用载体的方法。关于此类方法的细节，许多文献都已公开。
本发明的细胞群可以冷冻保存。当本发明的细胞群冷冻/解冻时，通过在解冻后再培养细胞群，细胞可以恢复为保留冷冻前的细胞毒性活性的细胞。细胞群的培养可以实施例如一天（过夜）。通过在再培养中共存细胞与合适的细胞因子、例如IL-2，可以进一步增强细胞毒性能力。
从本发明的含有NK细胞的细胞群分离的细胞亚群的实例包括使用NK细胞的至少一种表面标志物作为指标从NK细胞分离的细胞亚群，所述表面标志物选自CD16、CD56、NKp44、NKG2D、NKp46、CD25、CD62L、CD69、CXCR3和CD94。
含有本发明的细胞群的药物（治疗剂）适合用于过继性免疫疗法。在过继性免疫疗法中，适合患者治疗的本发明的细胞群例如向患者静脉内施用。该药物非常有效地用于后文所述的疾病和供体淋巴细胞输注。可以根据制药领域已知的方法制备药物，例如通过混合作为活性成分的本发明的细胞群与已知的适合胃肠外施用的有机或无机载体、赋形剂、稳定剂等。可以根据已知的过继性免疫疗法，恰当确定本发明的细胞群在药物中的含量、药物的剂量和关于药物的各种条件，并且没有特殊的限制。例如，药物剂量优选是本发明的细胞群每个成人1×105至1×1012细胞/天，更优选5×105至5×1011细胞/天，更优选1×106至1×1011细胞/天。一般地，含有NK细胞的细胞群可以通过注射、输注等施用到静脉、动脉、皮下、腹腔、肿瘤等中。
本发明的药物还可以与例如可作为针对待治疗疾病的疫苗发挥作用的成分一起施用，没有特殊的限制。例如，对于治疗癌症，还可以施用肿瘤抗原、能够呈递抗原的细胞、抗原呈递细胞、源自肿瘤组织的通过人工操作而丢失了增殖能力的细胞、来自肿瘤组织的提取物等。与药物施用组合，还可以恰当地施用淋巴细胞刺激因子，例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、细胞因子（IL-2、IL-15、IL-7、IL-12、IFN-γ、IFN-α、IFN-β等）、趋化因子等。本发明的药物可含有用这些淋巴细胞刺激因子处理的本发明的细胞群作为活性成分。如本文中使用的，淋巴细胞刺激因子包括淋巴细胞生长因子。
对其施用本发明的细胞群的疾病的实例包括但不特别限于恶性肿瘤病例如癌症和白血病、肝炎、流感，和由病毒例如HIV、细菌或真菌（例如，结核、MRSA、VRE或深部真菌病）引起的感染性疾病。含有通过本发明方法制备的NK细胞的细胞群可以与常规治疗方法组合利用，例如在骨髓移植或放射线照射后的感染性疾病预防、出于缓解复发性白血病目的的供体淋巴细胞输注、抗癌剂治疗、放射治疗、抗体治疗、温热治疗、其他免疫疗法等。
本发明的细胞群用于生产药物的用途，例如生产用于治疗癌性疾病或感染性疾病的药物的用途，也包括在本发明中。
用于治疗疾病的本发明的细胞群也包括在本发明中。
本发明的另一个方面提供了使用药物治疗疾病的方法。治疗疾病的方法的特征是使用本发明的细胞群，并且根据已知的过继性免疫疗法或本文的施用药物的公开内容，可以确定施用药物的各种条件。
下面通过实施例将进一步具体、详细地解释本发明，但本发明并不限于此。
实施例
实施例1：使用OK-432和自体照射细胞（AIC）培养NK细胞
（1）PBMC的分离和保存
在已获得知情同意书的健康人供体中，实施组分血液收集（在本文中，组分血液收集是出于收集单核细胞的目的的血液收集）。在用Dulbecco PBS（由Invitrogen公司生产或由NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.生产；在后文中称为DPBS）或含1%人血清白蛋白（产品名Buminate，由Baxter生产；在后文中称为HSA）的生理盐水（在后文中称为1% HSA/生理盐水）稀释组分收集的血液后，每30 mL稀释的组分收集的血液在15 mL的Ficoll-Paque PREMIUM或Ficoll-Paque PLUS（都由GE Healthcare Bioscience生产）上分层，再在700×g和室温下离心20分钟。在离心后，用移液器回收分离的层中的PBMC层，并用RPMI1640培养基或1% HSA/生理盐水补充至45 mL。在650×g和4℃下离心10分钟后，去除上清液。相似地，顺序实施离心操作，同时逐步降低离心G，例如600×g、然后500×g，重复洗涤共计3次，收集PBMC。
将收集的PBMC悬浮在由等量的包含8% HSA 的CP-1（由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.生产）和RPMI1640培养基（由Invitrogen公司、Sigma公司或Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生产）组成的储液（在后文中称为CP1/HSA）中，并保存在液氮中。为了扩增培养NK细胞，在37℃水浴中快速解冻保存的PBMC，并用包含10 μg/mL DNase（由Calbiochem生产）的RPMI1640培养基或含0.5%人AB型血清（由Lonza生产）的GT-T551（由TAKARA BIO INC.生产，在后文中称为0.5HGT-T551）洗涤，并通过台盼蓝染色方法计算活细胞数。该细胞用于每个实验中。
（2）制备PBMC AIC
将必需量的实施例1-（1）中制备的PBMC悬浮在含5%人AB型血清、0.1 mM NEAA混合物、1 mM丙酮酸钠和2 mM L-谷氨酰胺（都由Lonza生产）以及1%青霉素-链霉素（由Gibco BRL生产）或100 μg/mL硫酸链霉素（由Meiji Co., Ltd.生产）的RPMI1640培养基（在后文中称为5HRPMI）中，然后使用X射线照射装置用3400 R（29.8 Gy）的X射线照射（在后文中，X射线照射后的细胞被称为PBMC AIC）。将制备的PBMC AIC悬浮在5HRPMI中至2×106细胞/mL。
（3）扩增培养NK细胞
在将实施例1-（1）中制备的PBMC（源自与PBMC AIC相同的供体）悬浮在5HRPMI中至2×106细胞/mL后，将其用作响应细胞。将响应细胞和PBMC AIC以各自0.5 mL/孔的量添加到24孔细胞培养板（由Becton, Dickinson and Company生产，或由Corning Incorporated生产）中，达到共计1 mL/孔（AIC刺激组）。此时，制备不添加PBMC AIC的组（非AIC刺激组）。
向每个孔添加OK-432（产品名称Picibanil；由Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.生产），终浓度为0.05 KE/mL。向所有孔添加IL-2（产品名称Proleukin；由Chiron生产，或由Novartis生产），终浓度为500 U/mL。在37℃存在5% CO2的情况下开始培养这些平板（培养第0天）。在第二天，向每个孔添加各1 mL的5HRPMI，以500 U/mL终浓度添加IL-2。
在第四天，以500 U/mL终浓度向每个孔添加IL-2。在第七天和第九天，使用5HRPMI将每个孔的细胞液3倍稀释，以500 U/mL终浓度向每个孔添加IL-2，之后将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在开始培养后第11天，将细胞液4倍稀释，将4 mL的稀释细胞液转移到新的12孔细胞培养板（由Becton, Dickinson and Company生产，或由Corning Incorporated生产）中，之后，以500 U/mL终浓度添加IL-2。继续培养直到开始培养后第14天为止。在开始培养后第14天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，以计算扩增培养率。结果显示在表1中。在下表中，“-”意指无添加，“+”意指添加。在实施例中，AIC添加与AIC刺激具有相同的含义，并且AIC无添加与AIC无刺激具有相同的含义。
[表1]
| AIC | 扩增培养率 |
| - | ×11.6 |
| + | ×97.5 |
如表1所示，通过组合OK-432和AIC ，PBMC AIC-添加组（AIC刺激组）相比PBMC AIC-无添加组（AIC无刺激组）表现出更高的扩增培养率。
换言之清楚的是，通过在扩增培养中组合OK-432和AIC，以高的扩增培养率获得NK细胞。
（4）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）含有率
关于在实施例1-（3）中制备的开始培养后第14天的细胞，用流式细胞仪（Cytomics FC500；由Beckman Coulter Inc.生产）分析CD3阴性CD56阳性细胞的含有率（在后文中，称为NK细胞含有率）。即，用DPBS洗涤开始培养后第14天的细胞，然后悬浮在含有1%牛血清白蛋白（由Sigma Corporation生产，在后文中称为BSA）的DPBS（在后文中称为1% BSA/DPBS）中，向其中添加FITC标记的或PC5标记的小鼠抗人CD3抗体和RD1标记的小鼠抗人CD56抗体（都由Beckman Coulter Inc.生产）。相似地，向各种细胞群的一部分中添加作为阴性对照的FITC标记的小鼠IgG1/RD1-标记的小鼠IgG1/PC5-标记的小鼠IgG1（由Beckman Coulter Inc.生产）。在添加各种抗体后，在4℃实施温育30分钟。温育后，用含有0.1% BSA 的DPBS（在后文中称为0.1% BSA/DPBS）洗涤细胞，并再悬浮在DPBS中。这些细胞经过流式细胞仪。计算NK细胞含有率，其中将CD3阴性CD56阳性细胞视为NK细胞。结果显示在表2中。
[表2]
| AIC | NK细胞含有率 (%) |
| - | 49.72 |
| + | 79.09 |
如表2所示，相比PBMC AIC-无添加组，通过在存在OK-432和AIC 组合的情况下培养，获得具有更高NK细胞含有率的细胞群。
（5）测量细胞毒性活性
关于在实施例1-（3）中制备的开始培养后第14天的细胞，测量细胞毒性活性。通过使用钙荧光素-AM（Calcein-AM）的细胞毒性活性测量方法（Lichtenfels R.等人，J. Immunol. Methods，第172卷，第2期，第227-239页(1994)）来评估细胞毒性活性。换言之，将慢性骨髓性白血病细胞株K562细胞（Health Science Research Resources Bank JCRB0019）、Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi细胞（Health Science Research Resources Bank JCRB9071）和Burkitt淋巴瘤细胞株Raji（Health Science Research Resources Bank IFO50046）中的每一种以1至2×106细胞/mL悬浮在含有5%胎牛血清的RPMI1640培养基中。以终浓度25 μM向其中加入钙荧光素-AM（由DOJINDO LABORATORIES生产），并在37℃培养1小时。在用不含钙荧光素-AM的培养基洗涤细胞后，将其采用为钙荧光素标记的靶细胞。
将实施例1-（3）中制备的开始培养后第14天的细胞作为效应细胞用5HRPMI稀释为1×106细胞/mL、3×105细胞/mL或1×105细胞/mL。然后，将每100 μL/孔的稀释液分配在96孔细胞培养板（由Corning Incorporated生产）的每个孔中。以100 μL/孔向其中添加1×105细胞/mL的钙荧光素标记的靶细胞。此时，效应细胞（E）与钙荧光素标记的靶细胞（T）的比例，即E/T比为10、3或1。将含有细胞悬浮液的平板在400×g离心1分钟，然后在37℃存在5% CO2的情况下温育4小时。之后，从每个孔收集100 μL培养上清液。用荧光平板读数器（Mithras LB 940；由Berthold生产）测量释放到培养上清液中的钙荧光素的量（激发485 nm/测量535 nm）。根据下列等式（1）计算“细胞毒性活性（%）”。
[数学式1]
细胞毒性活性（%） = [{（每个孔的测量值）-（最小释放量）}/{（最大释放量）-（最小释放量）}] ×100
等式（1）。
在上述等式中，最小释放量是仅含有钙荧光素标记的靶细胞的孔中的钙荧光素释放量，表示从钙荧光素标记的靶细胞中自发释放的钙荧光素的量。最大释放量表示当向钙荧光素标记的靶细胞中添加0.1%表面活性剂Triton X-100（由Nacalai Tesque, Inc.生产）完全破坏细胞时的钙荧光素释放量。细胞毒性活性的测量结果显示在表3中。
[表3]
如表3所示，通过在存在OK-432和AIC 组合的情况下培养获得的细胞群发挥与没有AIC情况下获得的细胞群等价的细胞毒性活性。
换言之清楚的是，通过在培养中组合OK-432和AIC，有效扩增并大量获得含有发挥高细胞毒性活性的NK细胞的细胞群。
实施例2：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较对AIC的X射线照射量）
（1）制备PBMC AIC
以与实施例1-（2）相同的方式制备PBMC AIC，除了分别使用3400 R（29.8 Gy）和8000 R（70.2 Gy）的X射线照射量制备两种PBMC AIC。
（2）NK细胞的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了产生OK-432无添加组、PBMC AIC无添加组、和添加等量的PBMC（X射线非照射的）代替PBMC AIC的组。在开始培养后的第7天，使用5HRPMI将每个孔的细胞液2倍稀释，向每个孔添加IL-2，其终浓度为500 U/mL，之后，将2 mL的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天和第13天，实施相同的传代培养操作。第9天和第13天的细胞液稀释率分别为4倍和2倍。在每个传代培养日，以终浓度500 U/mL添加IL-2。继续培养直到第14天为止。通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表4中。
[表4]
*添加没有用X射线照射的PBMC作为对照，并且不添加AIC。
如表4所示，OK-432和PBMC AIC 组合时的扩增培养率高于OK-432无添加组、PBMC AIC无添加组和PBMC（无X射线照射）添加组。当组合OK-432和PBMC AIC时，所获得的细胞群的NK细胞含有率也更高。此外，不论在制备PBMC AIC中使用的X射线照射量如何都发挥效果。换言之清楚的是，通过在培养中组合OK-432和AIC，以高的扩增培养率获得了含有高比例的NK细胞的细胞群。
实施例3：使用OK-432和各种AIC培养NK细胞（比较PBMC AIC与RN-T AIC）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
向12孔细胞培养板中添加各0.45 mL/孔的含有终浓度为5 μg/mL的抗人CD3抗体（产品名称：Orthoclone OKT3注射液，由Janssen Pharmaceutical K.K.生产）和终浓度为25 μg/mL 的RetroNectin （注册商标名，由TAKARA BIO INC.生产）的ACD-A液（由TERUMO CORPORATION生产），获得必需的孔数。平板在37℃、存在5% CO2的情况下温育5小时。就在使用前，用DPBS洗涤固定了抗人CD3抗体/ RetroNectin的平板2次，用RPMI1640培养基洗涤1次。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
将实施例1-（1）制备的PBMC按1×106细胞/mL悬浮在含有1%人AB型血清（由Lonza生产）的GT-T551（由TAKARA BIO INC生产）中（在后文中称为1HGT-T551）。向实施例3-（1）制备的固定了抗人CD3抗体/ RetroNectin的平板添加4.77 mL/孔的1HGT-T551，并向平板添加各0.53 mL/孔的细胞悬浮液以产生必需的孔数。随后，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL. 在37℃、存在5% CO2的情况下开始培养这些平板（培养第0天）。在开始培养后第四天，使用1HGT-T551将培养液恰当地稀释，之后转移到T75细胞培养瓶（由Corning Incorporated生产）中。向该瓶中添加IL-2，终浓度为200 U/mL，继续培养直到第7天为止（在后文中，通过用抗CD3抗体/ RetroNectin刺激扩增培养获得的T细胞被称为RN-T）。
（3）使用PBMC和RN-T制备AIC
以与实施例1-（2）相同的方式制备AIC，除了使用3400 R（29.8 Gy）的X射线照射以与实施例1-（1）相同的方式制备的每种PBMC和在实施例3-（2）中制备的开始培养后第7天的RN-T用于制备AIC（在后文中，该X射线照射后的RN-T被称为RN-T AIC）。将所制备的PBMC AIC和RN-T AIC按2×106细胞/mL悬浮在含有1%人AB型血清的CellGro SCGM（由CellGenix 生产）中（在后文中称为1HCellGro）或含有5%人AB型血清的CellGro中（在后文中称为5HCellGro），所述悬浮液用于下列实验。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用1HCellGro或5HCellGro作为培养基、和使用实施例3-（3）中制备的PBMC AIC和RN-T AIC作为AIC。
在开始培养后第2天，向每个孔添加各1 mL 的1HCellGro或5HCellGro，以终浓度为200 U/mL添加IL-2。在第5天，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加。在第7天，使用1HCellGro或5HCellGro将每个孔的细胞液3倍稀释，将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天和第13天，实施相同的传代培养操作。第9天和第13天的细胞液稀释率分别为5倍和4倍。以该方式继续培养直到开始培养后的第16天为止。在每个传代培养日，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在开始培养后第16天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表5中。
[表5]
如表5所示，相比PBMC AIC添加组，通过使用RN-T AIC获得了等价的扩增培养率。在所获得的细胞群的NK细胞含有率中未见差异。换言之，它明确了不论培养基中的血清浓度如何，通过在NK细胞培养中组合OK-432与PBMC AIC或RN-T AIC，都有效获得了含有高比例的NK细胞的细胞群。因而建立了使用低血清浓度的扩增培养方法。
实施例4：使用OK-432和各种AIC培养NK细胞（用AIC-1再刺激）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养，除了培养期为19天、使用1HGT-T551在开始培养后第4天或之后适当稀释细胞、以及在每个传代培养日添加终浓度为200 U/mL的IL-2来继续培养以外。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例3-（3）相同的方式制备AIC。在开始培养后第6、第13和第19天回收实施例4-（2）中培养的RN-T，并使用X射线照射装置用3400 R（29.8 Gy）的X射线照射。将细胞悬浮在1HCellGro中，用于下列实验。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用1HCellGro作为培养基和使用实施例4-（3）中制备的各RN-T AIC作为AIC以外。
在开始培养后第2天，向每个孔添加各1 mL的1HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。
在第5天，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在第7天，用1HCellGro将每个孔的细胞液3倍稀释，将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天、第13天、第16天和第20天，实施相同的传代培养操作。第9、第13、第16和第20天的细胞液稀释率分别为5倍、3倍、5倍和2倍。在每个传代培养日，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。在开始培养后的第7和第13天，添加各1×106细胞/孔的实施例4-（3）中制备的各RN-T AIC。在开始培养后的第16、第20和第22天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表6中。
[表6]
如表6所示，在NK细胞扩增培养期内，通过结合RN-T AIC 刺激，在开始培养后第16、20和22天获得高的NK细胞扩增培养率。
随着NK细胞培养期内RN-T AIC 刺激频率的增加，获得更高的NK细胞扩增培养率。
换言之清楚的是，AIC刺激增加NK细胞的增殖能力。因此清楚的是，通过在NK细胞培养中结合RN-T AIC，以高的扩增培养率获得NK细胞。
实施例5：使用OK-432和各种AIC培养NK细胞（用AIC-2再刺激）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例4-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例3-（3）相同的方式制备AIC。使用X射线照射装置用3400 R（29.8 Gy）的X射线照射在实施例5-（2）中开始培养后第7天和第14天回收的RN-T，将其悬浮在5HCellGro中，用于下列实验。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用5HCellGro作为培养基、和使用实施例5-（3）中制备的各种RN-T AIC作为AIC以外。
在开始培养后第2天，向每个孔添加各1 mL的5HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。
在第5天，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在第7天，用5HCellGro将每个孔的细胞液3倍稀释，将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天、第13天、第16天和第20天，实施相同的传代培养操作，并继续培养直到第22天。第9、第13、第16和第20天的稀释率分别为3倍、2.5倍、4倍和2倍。在每个传代培养日，向每个孔添加各1mL的5HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。在第7天，添加各1×106细胞/孔的实施例5-（4）中制备的RN-T AIC。在开始培养后的第20天和第22天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表7中。
[表7]
如表7所示，相比没有经受再刺激的组，在NK细胞扩增培养期间，通过实施用RN-T AIC再刺激获得更高的扩增培养率。
换言之清楚的是，在NK细胞的培养中，通过组合OK-432和多次的RN-T AIC刺激，以高的扩增培养率获得NK细胞。
（5）分析CD3阴性CD56阳性细胞含有率（NK细胞）
按与实施例1-（4）中相同的方式，对于实施例5-（4）中制备的在开始培养后第22天的细胞，测量NK细胞含有率。结果显示在表8中。
[表8]
如表8所示，在NK细胞扩增培养期间，通过给予RN-T AIC的再刺激，获得了与尚未经受再刺激的组等价的高NK细胞含有率。换言之，即使给予用RN-T AIC多次刺激，NK细胞含有率也不降低。
（6）测量细胞毒性活性
关于在实施例5-（4）中制备的开始培养后第22天的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，除了使用K562和Daudi作为靶细胞以外。细胞毒性活性的测量结果显示在表9中。
[表9]
如表9所示，清楚的是，在NK细胞扩增培养期间，用RN-T AIC再次刺激的细胞组产生了比仅在开始培养后第0天用RN-T AIC刺激的组更高的细胞毒性活性。
换言之清楚的是，在NK细胞培养中，通过组合OK-432与多次的RN-T AIC刺激，有效获得了含有发挥更高细胞毒性活性的NK细胞的细胞群。
实施例6：使用OK-432和各种AIC培养NK细胞（比较X射线照射量）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例4-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养，除了培养期为14天以外。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例3-（3）相同的方式制备AIC。使用X射线照射装置，用1000 R（8.8 Gy）、2000 R（17.6 Gy）、3400 R（29.8 Gy）或5500 R（48.2 Gy）的X射线照射在实施例6-（2）中在开始培养后第7天和第14天回收的RN-T，将其悬浮在5HCellGro中，用于下列实验。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用5HCellGro作为培养基、和使用实施例6-（3）中制备的各RN-T AIC作为AIC以外。
在开始培养后第1天和第3天，向每个孔添加各1 mL的5HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。
在第4天或第5天，向每个孔添加终浓度为200 U/mL的IL-2。在第7天，用5HCellGro将每个孔的细胞液9倍稀释，将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中，并添加各1×106细胞/孔的实施例6-（3）中制备的RN-T AIC。在第11天、第14天、第15天、第17天或第18天，实施上述包括稀释细胞液和转移2 mL稀释的细胞液至新平板中的传代培养操作，继续培养直到开始培养后第21天为止。第11天、第14天、第15天、第17天或第18天的细胞液稀释率分别为5倍、3倍、4倍、4倍和2倍。在每个传代培养日，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。在第7天，添加各1×106细胞/孔的实施例6-（3）中制备的RN-T AIC。在开始培养后第21天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表10中。
[表10]
如表10所示，在NK细胞扩增培养期间，通过给予RN-T AIC的再刺激，获得了相比尚未经受再刺激的组更高的NK细胞扩增培养率。即使当用于制备RN-T AIC的X射线照射量改变为1000、2000、3400或5500 R时，也发挥该效果。
换言之清楚的是，在NK细胞培养中，即使通过组合使用不同的X射线照射量制备的RN-T AIC，也以高的扩增培养率获得NK细胞。
（5）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）含有率
按与实施例1-（4）相同的方式，对于实施例6-（4）中制备的开始培养后第21天的细胞测量NK细胞含有率。结果显示在表11中。
[表11]
如表11所示，在NK细胞扩增培养期间用RN-T AIC再次刺激的细胞组具有与根本未刺激的组等价的高NK细胞含有率。即使当用于制备RN-T AIC的X射线照射量改变为1000、2000、3400或5500 R时，也发挥该效果。
换言之清楚的是，在NK细胞培养中，通过组合OK-432与AIC，以高含有率获得了含有高比例NK细胞的细胞群。
实施例7：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较基础培养基-1）
（1）使用PBMC制备AIC
按与实施例1-（2）相同的方式，制备PBMC AIC。
（2）NK细胞的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用含有5HRPMI、5%人AB型血清和0.2% HAS的GT-T503（由TAKARA BIO Inc.生产）（在后文中称为5H0.2%HSA/GT-T503）或5HCellGro作为基础培养基以外。
在开始培养后第7天，使用各基础培养基将每个孔的细胞液3倍稀释，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2，之后，将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天，将2 mL已类似3倍稀释的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。此外，在第11天，将4 mL已5倍稀释的细胞液转移到新的12孔细胞培养板中。在每个传代培养日，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。继续培养直到开始培养后第15天为止。在开始培养后第15天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表12中。
[表12]
如表12所示，相比其他培养基，当组合了OK-432、PBMC AIC和CellGro时，获得了更高的扩增培养率。
（3）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）含有率
关于实施例7-（2）中制备的开始培养后第15天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表13中。
[表13]
如表13所示，使用任何培养基都获得了含有70%或更多的NK细胞的细胞群。然而，在所使用的培养基中，使用CellGro的组具有最高的NK细胞含有率。
实施例8：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较基础培养基-2）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例6-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备AIC
使用实施例8-（2）中制备的RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备AIC，除了将X射线照射后的RN-T AIC悬浮在1HCellGro；含有1%人AB型血清的GT-T502（由TAKARA BIO Inc.生产）（在后文中称为1HGT-T502）；或含有1%人AB型血清和0.2% HSA的GT-T503（由TAKARA BIO Inc.生产）（在后文中称为1H0.2%HSA/GT-T503）中，并用于下列实验。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了在开始培养时使用1HCellGro作为基础培养基、和在开始培养后第7天或第9天及之后将一些组的培养基改变为1HGT-T502或1H0.2%HSA/GT-T503以外。此外，设定在开始培养后第14天将培养基变为1HGT-T502的组、和从开始培养至培养结束使用通过按1:1的比例混合1HCellGro和1HGT-T502而获得的基础培养基（在后文中称为1HCellGro/GT-T502）的组。
在开始培养后第4天，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。在第7天，使用各培养基将每个孔的细胞液3倍稀释，将2 mL的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天、第14天和第18天实施相同的传代培养，并继续培养直到第22天为止。第9天、第14天和第18天的细胞液稀释率分别是5倍、3倍和2倍。在每个传代培养日，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。在开始培养后第7天，加入各1×106细胞/孔的实施例8-（3）中制备的RN-T AIC。
在开始培养后第14天、第18天和第21天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表14中。
[表14]
如表14所示，通过在NK细胞扩增培养的最初阶段组合OK-432、RN-T AIC和CellGro，即使在培养期间改变基础培养基，也在开始培养后第14天、第18天和第21天获得高的扩增培养率。即使使用由两种基础培养基组成的混合培养基（稀释的CellGro），例如1HCellGro/GT-T502时，也相似地获得了高的扩增培养率。
（5）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）含有率
关于实施例8-（4）中制备的开始培养后第21天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表15中。
[表15]
如表15所示，通过在NK细胞扩增培养的最初阶段组合OK-432、RN-T AIC和CellGro，即使在培养期间改变基础培养基，也在开始培养后第14天、第18天和第21天获得了高的NK细胞含有率。同样，当使用由两种基础培养基组成的混合培养基（稀释的CellGro），例如1HCellGro/GT-T502时，也相似地获得了高的NK细胞含有率。
如上所述，根据本发明清楚的是，即使在培养过程中改变培养基时，也有效地获得了含有高比例的NK细胞的细胞群。
实施例9：使用可透气的培养袋培养NK细胞。
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化CultiLife（注册商标）215
密封可透气的培养袋CultiLife 215（由TAKARA BIO INC.生产），使得培养面积为86 cm2。向袋内加入10.4 mL含有终浓度为5 μg/mL的抗人CD3抗体和RetroNectin的ACD-A液，在37℃、存在5% CO2的情况下温育5小时。在使用前不久，用1%HSA/生理盐水对固定了抗CD3抗体/RetroNectin的CultiLife 215洗涤3次。
（2）从新鲜血液中分离PBMC
对已获得知情同意书的健康人供体实施30 mL份的肝素化的血液收集。所获得的血液在700×g和室温下离心20分钟，然后分成血浆级分，它是离心后的上清液和包括PBMC的细胞级分。血浆级分在56℃经受失活处理30分钟，在900×g和4℃下离心30分钟。其上清液用于之后的步骤，作为失活的自体血浆（在后文中称为血浆）。
将含有PBMC的细胞级分装满20 mL，并使用1% HSA//生理盐水稀释。所获得的稀释细胞液在20 mL的Ficoll-Paque PREMIUM上分层，并在700×g和室温下离心20分钟。在离心后，用移液器回收分离层中的PBMC层，用1% HSA/生理盐水补充至20 mL，并在650×g和4℃下离心10分钟以去除上清液。相似地，顺序实施离心操作，同时逐步降低离心G至600×g和500×g。重复洗涤共计3次，并将得到的PBMC悬浮在1HGT-T551中。通过台盼蓝染色方法计算活细胞数和存活率，并将PBMC用于每个实验。
（3）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
将1.2×107细胞的实施例9-（2）中分离的PBMC悬浮在120 mL 的1HGT-T551中，并将悬浮液添加到实施例9-（1）中制备的固定了抗CD3抗体和RetroNectin的CultiLife 215中。以终浓度为200 U/mL添加IL-2，并在37℃、存在5% CO2的情况下开始培养（培养第0天）。在开始培养后第四天，悬浮每个CultiLife 215中的细胞液，并将40 mL悬浮液转移到可透气培养袋CultiLife（注册商标）Eva（由TAKARA BIO INC.生产）中，所述培养袋上没有固定任何物质并且已密封使得培养面积为430 cm2。同时，加入292.6 mL的1HGT-T551，使得CultiLife Eva中含有的总液体量变为336 mL，以终浓度为200 U/mL添加IL-2，之后，将其在5% CO2中37℃培养。继续培养直到第7天为止。在第7天，取出必需量的培养RN-T（将其用于后续步骤，作为AIC材料），之后，添加与袋内剩余的细胞液等量的无血浆GT-T 551，并以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第11天，使用无血浆GT-T 551将CultiLife Eva中的细胞液2倍稀释，之后以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第14天，将必需量的RN-T分级，并在后续步骤中用作AIC材料。
（4）使用RN-T制备AIC
使用实施例9-（3）中制备的RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备AIC。将使用开始培养后第7天的RN-T制备的RN-T AIC按2×106细胞/mL悬浮在含有0.8%血浆的CellGro中（在后文中称为0.8%血浆/CellGro）。将使用开始培养后第14天的RN-T制备的RN-T AIC按4×106细胞/mL悬浮在0.8%血浆/CellGro中。
（5）NK细胞群的扩增培养
向可透气的培养袋CultiLife（注册商标）Spin（由TAKARA BIO INC.生产）中添加各3 ×107细胞的实施例9-（2）中制备的PBMC和实施例9-（4）中制备的RN-T AIC（使用开始培养后第7天的RN-T制备的）。以终浓度为200 U/mL 添加IL-2，并且以终浓度为0.05 KE/mL添加OK-432。使用0.8%血浆/CellGro将总液体量最终调节为30 mL。在存在5% CO2的情况下、在37℃开始培养添加细胞液的培养袋（培养第0天）。在开始培养后第2天，向培养袋添加30 mL的0.8%血浆/CellGro，并以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第4天，以终浓度为200 U/mL 向培养袋添加IL-2。在第7天，在通过台盼蓝染色方法计算培养袋内的总细胞数之后，将30 mL细胞液转移到CultiLife 215，并添加实施例9-（4）中制备的RT-T AIC（使用开始培养后第14天的RT-T制备的），使得细胞数比例变成1:1。在以终浓度为200 U/mL 向该培养袋添加IL-2后，使用0.8%血浆/CellGro将总液体量调节为180 mL。在第11天，将CultiLife 215中的90 mL细胞液转移到CultiLife Eva中，并使用含有0.8%血浆和0.2% HAS的GT-T503（在后文中称为0.8%血浆/0.2% HSA/GT-T503）稀释5倍，调节总液体量为450 mL。之后，以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第13天，使用包含0.26%血浆和0.2% HAS的GT-T503（在后文中称为0.26%血浆/0.2% HSA/GT-T503）3倍稀释CultiLife Eva中的225 mL细胞液，调节总液体量为675 mL。之后，以终浓度为200 U/mL 添加IL-2，之后，将其转移到CultiLife Eva。继续培养直到第16天为止。在开始培养后第13天和第16天，对于每个取样的细胞，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表16中。
[表16]
如表16所示清楚的是，即使使用可透气的培养袋实施培养时，也获得了高的扩增培养率。
（6）分析CD3阳性CD56阴性细胞（T细胞）、CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）和CD16阳性CD56阳性细胞含有率
对于实施例9-（5）中制备的开始培养后第16天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方式分析NK细胞含有率，除了组合使用PC5标记的小鼠抗人CD16抗体（由Beckman Coulter Inc.生产）、以及还分析CD3阳性CD56阴性细胞（T细胞）和CD16阳性CD56阳性细胞含有率以外。结果显示在表17中。
[表17]
如表17所示，即使使用可透气的培养袋实施使用OK-432和RN-T AIC的培养时，也获得了高的NK细胞含有率。并且验证了培养后获得的NK细胞以高比率表达CD16，因此含有高比例的表达CD16分子的高功能性NK细胞，所述CD16分子在发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。在所获得的细胞群中，仅识别非常少数的T细胞。
（7）测量细胞毒性活性
对于实施例9-（5）中制备的开始培养后第16天的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，除了使用下表显示的K562、Daudi、食道扁平上皮癌细胞株T. Tn、乳腺癌来源的细胞株MCF7、肺癌细胞株A549、黑色素瘤细胞株A375、胃癌细胞株MKN45和结肠癌细胞株HT29作为靶细胞，并在E/T比为30、10、3或1下实施测量以外。细胞毒性活性的测量结果显示在表18中。
[表18]
如表18所示清楚的是，通过使用OK-432、RN-T AIC和可透气培养袋获得的细胞群对多种靶细胞表现出高的细胞毒性活性。活性不仅在已知为NK细胞敏感性细胞株的K562和已知为不表达MHC I类的细胞株Daudi上确认，而且在表达各种MHC I类的细胞株上确认。确认了细胞群是对多种癌细胞株发挥细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
换言之，根据本发明，可以以高纯度获得表现出CD3阴性CD56阳性CD16阳性表型并具有高细胞毒性的细胞群。
实施例10：使用OK-432和AIC培养NK细胞（与异源照射细胞（allogeneic-irradiated cell）比较）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例6-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养，除了RN-T是从与NK细胞培养时提供PBMC作为材料的供体相同的供体来源的PBMC培养的（在后文中称为自体RN-T）、并且RN-T是从源自不同供体的PBMC培养的（在后文中称为异源RN-T）。
（3）使用RN-T制备X射线照射的细胞
使用实施例10-（2）中制备的自体RN-T和异源RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备X射线照射的细胞。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用5HCellGro作为培养基、和使用实施例10-（3）中制备的自体RN-T X射线照射的细胞（具有与RN-T AIC相同的含义）和异源RN-T X射线照射的细胞作为AIC以外。
在开始培养后第2天，向每个孔添加各1 mL的5HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。在第4天，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在第7天，用5HCellGro将每个孔的细胞液3倍稀释，并将2 mL的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第9天，将每个孔的细胞液相似地3倍稀释，并将2 mL的稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。此外，在第11天，将每个孔的细胞液相似地2.5倍稀释，并将4 mL的稀释细胞液转移到新的12孔细胞培养板中。在每个传代培养日，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。继续培养这些细胞直到第15天。对于开始培养后第11天和第15天采样的细胞，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表19中。
[表19]
如表19所示，不论所使用的RN-T是自体的或异源的，都获得了等价的扩增培养率。
一般已知，当混合来自不同供体的两种淋巴细胞时，淋巴细胞识别异源抗原并由于异源混合的淋巴细胞反应（在后文中称为Allo-MLR）而增殖，这在混合自体细胞时不发生，因此，X射线照射的异源细胞被广泛用作滋养层细胞。然而，令人惊讶的是，即使在NK细胞培养中使用X射线照射的自体细胞RN-T AIC替代X射线照射的异源细胞时，也获得相似的NK细胞扩增培养效果。此外，从医学护理的安全性的观点出发，当培养后的NK细胞施用于供体时，在NK培养中使用自体来源的RN-T AIC导致安全性显著的改善。
（5）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）和CD16阳性CD56阳性细胞含有率
对于实施例10-（4）中制备的开始培养后第15天的细胞，按与实施例9-（6）相同的方式分析NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表20中。
[表20]
如表20所示，相比异源RN-T X射线照射的细胞添加组，当使用自体RN-T AIC时，获得更高的NK细胞含有率和更高的CD16阳性NK细胞含有率。
换言之清楚的是，在存在OK-432和自体RN-T AIC的组合的情况下培养NK细胞的方法提供了具有更高的NK细胞含有率和更高的CD16阳性NK细胞比率、并具有高的安全性的NK细胞。
实施例11：使用OK-432和AIC培养NK细胞（培养NK细胞的分化阶段）
（1）使用PBMC制备X射线照射的细胞
使用实施例1-（1）中制备的PBMC，按与实施例3-（3）相同的方式制备PBMC AIC。将制备的PBMC AIC悬浮在5HCellGro中，并用于下列实验。
（2）扩增培养NK细胞群
按与实施例1-（3）相同的方式，实施NK细胞的扩增培养，除了使用5HCellGro作为培养基和实施例11-（1）中制备的PBMC AIC作为AIC。
在开始培养后第7天，使用5HCellGro将每个孔的细胞液8倍稀释，并将2 mL的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。此时，向每个孔添加1×106的实施例11-（1）中制备的PBMC AIC，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。在第10天和第15天实施相同的传代培养操作。在第10天和第15天的细胞液的稀释率分别是6倍和3倍。此外，在第18天，将每个孔的细胞液相似地4倍稀释，并将4 mL的稀释细胞液转移到新的12孔细胞培养板中。在每个传代培养日，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。继续培养这些细胞直到开始培养后第22天。对于一部分培养物，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果（扩增培养率）显示在表21中。
[表21]
| 开始培养后第22天 |
| ×334.08 |
（3）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）、CD16阳性CD56阳性细胞、CD34阴性CD117阴性细胞和CD94阳性CD56阳性细胞的含有率
对于实施例11-（2）中制备的开始培养后第22天的细胞，按与实施例9-（6）相同的方式分析NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞比率，除了使用FITC标记的小鼠抗人CD34抗体（由Becton, Dickinson and Company生产）、PE标记的小鼠抗人CD117抗体（由R&D Systems, Inc.生产）和FITC标记的小鼠抗人CD94抗体（由eBioscience, Inc.生产）相似地分析CD34阳性CD117阳性细胞和CD94阳性CD56阳性细胞的含有率以外。结果显示在表22中。
[表22]
如表22所示，在通过使用OK-432和PBMC AIC的组合的方法获得的细胞群中，CD56阳性、CD16阳性、CD34阴性、CD117阴性和CD94阳性细胞占大部分。
已知NK细胞根据其表面抗原的表达分为四个分化阶段。其中，特别是CD56阳性、CD16阳性、CD34阴性、CD117阴性和CD94阳性细胞是最后的分化阶段中可见的表型，并且已知是发挥高的细胞毒性活性的成熟NK细胞。
换言之清楚的是，通过本发明有效获得了成熟的NK细胞，以及通过本发明提供了用于制备成熟NK细胞的有效方法。
实施例12：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较OK-432和AIC有效性）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例6-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养，除了在开始培养后第7天和其后使用不含血浆的GT-T551之外。
（3）使用RN-T制备AIC
使用实施例12-（2）中制备的RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备RN-T AIC，除了将开始培养后第7天的RN-T悬浮在含有0.8%人AB型血清的CellGro（在后文中称为0.8HCellGro）中、和将第14天的RN-T悬浮在含有0.8%人AB型血清的GT-T502（在后文中称为0.8HGT-T502）中，并且之后将所述悬浮液用于下列实验以外。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了还设立OK-432-或RN-T AIC不添加组以外。作为基础培养基，从开始培养至第4天使用0.8HCellGro，在第7天使用0.8HGT-T502，和在第13天使用含有0.29%人AB型血清的GT-T502（在后文中称为0.29HGT-T502）。在开始培养后第1天，向每个孔添加1 mL的0.8HCellGro，并以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在第4天，以终浓度为200 U/mL向每个孔添加IL-2。在第7天，用0.8HGT-T502将每个孔的细胞液6倍稀释，并将2 mL的细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第11天和第13天实施相同的传代培养操作，并继续培养直到第17天。在第10天和第15天对细胞液的稀释分别是使用0.8HGT-T502进行5倍稀释、和用0.29HGT-T502进行3倍稀释. 在开始培养后第7天，根据一部分条件，添加各1×106细胞/孔的实施例12-（3）中制备的RN-T AIC。
在开始培养后第11天、第13天和第17天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表23中。
[表23]
如表23所示，相比OK-432-无添加组、AIC-无添加组和OK-432与AIC-无添加组，通过组合OK-432和RN-T AIC，在第11天、第13天和第17天获得了更高的扩增培养率。
（5）分析CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）含有率、CD3阳性CD56阴性细胞（T细胞）含有率和CD16阳性CD56阳性细胞（NK细胞）的含有率
对于实施例12-（4）中制备的开始培养后第17天的细胞，按与实施例9-（6）相同的方式分析NK细胞含有率、CD3阳性CD56阴性细胞比率和CD16阳性CD56阳性细胞。结果显示在表24中。
[表24]
如表24所示，相比OK-432-无添加组、AIC-无添加组和OK-432与AIC-无添加组，通过组合OK-432和RN-T AIC，获得了更高的NK细胞含有率。此外，在OK-432-无添加组、AIC-无添加组和OK-432与AIC-无添加组中，NK细胞含有率低。特别是在AIC-无添加组和OK-432与AIC-无添加组中，CD3阳性CD56阴性细胞、即T细胞主要增殖。与这些组相反，在使用OK-432和RN-T AIC组合的组中，NK细胞以极高的比率增殖，且所获得的NK细胞高表达对于发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性是重要分子的CD16。换言之清楚的是，通过组合OK-432和AIC，获得了具有高的NK细胞含有率和高的CD16阳性率的NK细胞。
（6）分析NK细胞扩增培养率
对于开始培养前的PBMC和实施例12-（4）中制备的在开始培养后第17天的细胞，按与实施例9-（6）相同的方式分析NK细胞含有率。使用实施例12-（4）中获得的扩增培养率（按总细胞计），将总细胞与开始培养时的NK细胞数相比，计算在开始培养后第17天的NK细胞扩增培养率（参见下列等式（2））。结果显示在表25中。
[数学式2]
NK细胞扩增培养率（-倍）
= {扩增培养率（按总细胞计）}×{（在开始培养后第17天的NK细胞含有率）/（在开始培养时的NK细胞含有率）}
等式（2）。
[表25]
如表25所示清楚的是，相比OK-432-无添加组、AIC-无添加组和OK-432与AIC-无添加组，通过组合OK-432和RN-T AIC，获得了更高的NK细胞扩增培养率。
实施例13：分析扩增培养后的NK细胞群的表面抗原
（1）NK细胞群的扩增培养
以与实施例9-（5）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了在开始培养后第13天，使用包含0.29%血浆和0.2% HSA 的GT-T503（在后文中称为0.29%血浆/0.2% HSA/GT-T503）将225 mL CultiLife Eva中的细胞液3倍稀释，使得总液体量为675 mL，之后以终浓度为200 U/mL添加IL-2，并将细胞液转移到CultiLife Eva以外。在开始培养后第15天，以终浓度为200 U/mL向培养袋添加IL-2。在培养的第18天，使用0.29%血浆/0.2% HSA/GT-T503将CultiLife Eva 中的338 mL细胞液调节至675 mL的总液体量，之后以终浓度为200 U/mL添加IL-2，并将细胞液转移到CultiLife Eva。继续培养直到第20天。对于在开始培养后第18天和第20天采样的细胞，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表26中。
[表26]
（2）在培养后分析NK细胞的表面抗原
对于实施例13-（1）中制备的开始培养后第20天的细胞，以与实施例9-（6）相同的方式分析T细胞含有率、NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞含有率，除了还使用FITC-标记的小鼠抗人NKp44抗体（由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Inc.生产）、FITC-标记的小鼠抗人NKp46抗体（由R&D Systems, Inc. 生产）、FITC-标记的小鼠抗人CD25抗体（由DakoCytomation Co., Ltd. 生产）和PC5-标记的小鼠抗人CD62L抗体（由Beckman Coulter Inc. 生产）分析NKp44阳性CD56阳性细胞、NKp46阳性CD56阳性细胞、CD25阳性CD56阳性细胞和CD62L阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表27中。
[表27]
如表27所示，通过使用OK-432和RN-T AIC组合的方法获得的细胞群表达CD56、CD16、NKp44、NKp46、CD25和CD62L。
NKp44和NKp46属于天然细胞毒性受体（NCR）家族，并被称为涉及NK细胞引起的细胞毒性活性。NKp44不在静止阶段的NK细胞上表达，且仅在活化的NK细胞上表达。NKp46是NK细胞共同的表面抗原，其仅在NK细胞上表达。CD25被IL-2刺激，且在活化的NK细胞上表达。CD62L在淋巴细胞归巢中扮演重要的角色，且已知涉及从血流积累到炎性位点。
换言之清楚的是，根据本发明的方法有效地获得了成熟且活化的NK细胞，并且根据本发明提供了用于制备成熟NK细胞的有效方法。
实施例14：使用可透气的培养袋培养NK细胞
（1）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
将1.2×107细胞的按与实施例9-（2）相同的方式制备的PBMC悬浮在120 mL 的1HGT-T551中，将悬浮液添加到按与实施例9-（1）相同的方式制备的固定了抗CD3抗体和RetroNectin的CultiLife 215中，以终浓度为200 U/mL添加IL-2，并且在37℃、存在5% CO2的情况下开始培养（培养第0天）。在开始培养后第四天，悬浮每个CultiLife 215中的细胞液，将30 mL悬浮液转移到可透气培养袋CultiLife Eva中，所述培养袋上没有固定任何物质并已密封使得培养面积为320 cm2。此时，加入220 mL的1HGT-T551，使得CultiLife Eva中的总液体量变为250 mL，以终浓度为200 U/mL添加IL-2，之后，将其在5% CO2中在37℃培养。继续培养直到第7天为止。在第7天，取出必需量的培养RN-T（将其用于后续步骤，作为AIC材料）。之后，添加与袋内剩余的细胞液等量的无血浆GT-T 551，并且以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第11天，使用无血浆GT-T 551将CultiLife Eva中的细胞液2倍稀释，之后以终浓度为200 U/mL 添加IL-2。在第14天，将必需量的RN-T取出，然后在后续步骤中用作AIC材料。
（2）使用RN-T制备AIC
使用实施例14-（1）中制备的RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备AIC。将使用开始培养后第7天的RN-T制备的RN-T AIC按2×106细胞/mL悬浮在0.8%血浆/CellGro中，并将使用开始培养后第14天的RN-T制备的RN-T AIC按4×106细胞/mL悬浮在0.8%血浆/CellGro中。
（3）NK细胞群的扩增培养
按与实施例9-（5）相同的方式实施NK细胞群的扩增培养，除了在开始培养时使用CultiLife 215和在第14天而非第13天实施稀释操作以外。继续培养直到第18天。对于在开始培养后第18天采样的细胞，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表28中。
[表28]
| 扩增培养率 |
| 开始培养后第18天 |
| ×393.8 |
如表28所示清楚的是，即使在开始培养时使用可透气的培养袋CultiLife 215，也获得了高的扩增培养率。换言之清楚的是，不论在开始培养时使用可透气的培养袋的种类如何，都发挥所需的效果。
（4）分析CD3阳性CD56阴性细胞（T细胞）、CD3阴性CD56阳性细胞（NK细胞）和CD16阳性CD56阳性细胞的含有率
对于实施例14-（3）中制备的开始培养后第18天的细胞，按与实施例9-（6）相同的方式分析T细胞含有率、NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞含有率，除了还使用PE-标记的小鼠抗人NKG2D抗体（由Beckman Coulter Inc.生产）分析CD56阳性NKG2D阳性细胞含有率以外。结果显示在表29中。
[表29]
如表29所示，即使在开始培养时使用可透气的培养袋CultiLife 215实施使用OK-432和RN-T AIC的培养时，也获得了高的NK细胞含有率。确认了在培养后获得的NK细胞高比率表达CD16和NKG2D，且含有高比例的表达CD16分子的高功能性NK细胞和通过NKG2D表现出高细胞毒性活性的高功能性NK细胞，所述CD16分子在发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要的作用。
（5）测量细胞毒性活性
对于实施例14-（3）中制备的在开始培养后第18天的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，除了使用K562和A549作为靶细胞并在10、3、1和0.3的E/T比下实施测量以外。细胞毒性活性的测量结果显示在表30中。
[表30]
如表30所示清楚的是，通过在开始培养时使用OK-432、RN-T AIC和可透气的培养袋CultiLife 215培养所获得的细胞群对各种靶细胞表现出高的细胞毒性活性。不仅在已知作为NK细胞敏感性细胞株的K562上、而且还在表达I类MHC的细胞株A549上确认了它的活性。确认了这些细胞群是对多种癌细胞株发挥细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
换言之，根据本发明，可以以高纯度获得表现出CD3阴性CD56阳性CD16阳性表型且具有高细胞毒性的细胞群。
实施例15：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较细胞毒性活性）
（1）使用PBMC制备AIC
按与实施例1-（2）相同的方式制备PBMC AIC，除了将所制备的PBMC AIC按2×106细胞/mL悬浮在0.8HCellGro中、并用于下列实验之外。
（2）NK细胞群的扩增培养
以与实施例1-（3）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用0.8HCellGro作为培养基和使用实施例15-（1）中制备的PBMC AIC作为AIC以外。
在开始培养后第1天，向每个孔添加各1 mL的0.8HCellGro，并以终浓度为200 U/mL添加IL-2。在第3天，以终浓度为200 U/mL的IL-2向每个孔添加IL-2。在第7天，使用0.8HCellGro将每个孔的细胞液6倍稀释，并将1.674 mL稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在第10天，使用0.8HGT-T502将每个孔的细胞液5倍稀释，并将2 mL稀释细胞液转移到新的24孔细胞培养板中。在每个传代培养日，向每个孔添加IL-2，终浓度为200 U/mL。使用5HRPMI将开始培养后第14天的细胞调节至1×106细胞/mL，以终浓度为1000 U/mL向其中添加干扰素（IFN）α（产品名称Sumiferon：Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.；在后文中称为IFN-α），允许其保持在37℃的5% CO2温箱中1小时。在洗涤该细胞液后，将其悬浮在5HRPMI（IFNα处理）中。此时，还产生IFNα无添加组（IFNα未处理的）。
（3）测量细胞毒性活性
对于实施例15-（2）中制备的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，除了使用K562、A549和HT29作为靶细胞并在E/T为10、3、1和0.3下实施测量以外。细胞毒性活性的测量结果显示在表31中。
[表31]
如表31所示清楚的是，通过用IFN-α处理使用OK-432和RN-T AIC培养所获得的细胞群，增强了对各种靶细胞的细胞毒性活性。此外，确认了该细胞群是高功能性的NK细胞，其不仅对已知作为NK细胞敏感性细胞株的K562、而且对多种癌细胞株发挥活性。
实施例16：使用OK-432和温热处理的细胞培养NK细胞（比较温热处理的细胞数）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备温热处理的细胞
用5HRPMI将实施例16-（2）中培养的RN-T调节至5×106细胞/mL，将各0.6 mL的悬浮液转移至1.5 mL管（由WATSON Co., Ltd.生产，或由Treff AG生产），然后使用45℃水浴温热处理1小时。在回收并离心处理的细胞液后，去除上清液，并用0.8HCellGro将细胞液调节至2、4或10×106细胞/mL（在后文中，温热处理后的RN-T细胞被称为温热处理的RN-T）。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例12-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了在开始培养时，向12孔培养板中添加各0.95 mL/孔的响应细胞和调节至实施例16-（3）中各细胞浓度的温热处理的RN-T、使得共计1.9 mL/孔之外。此时，设立了温热处理RN-T条件和仅添加OK-432的组（在后文中称为对照组）。在本实施例中的第14天，实施在实施例12-（4）中第13天实施的操作，并继续培养直到第18天。作为基础培养基，使用0.8HCellGro直到开始培养后第7天，在第11天使用0.8HGT-T502，并在第14天使用0.3HGT-T502。在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表32中。
[表32]
如表32所示，相比对照组，通过使用OK-432和温热处理的RN-T，在温热处理的RN-T添加组中，获得了更高的扩增培养率和更高的NK细胞含有率。这些效果不限于开始培养时的温热处理RN-T与响应细胞的比例，并且在广泛的条件下确认所述效果。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中组合OK-432和温热处理的RN-T，以高的扩增培养率获得了高纯度的NK细胞。
实施例17：测量NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）
（1）NK细胞群的扩增培养
以与实施例16-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了在开始培养时，添加各0.95 mL/孔的响应细胞和以与实施例5-（3）相同的方式制备的AIC、使得共计1.9 mL/孔以外。继续培养直到第20天，使用不含血清的GT-T502将细胞液2倍稀释，之后，以终浓度为200 U/mL添加IL-2。
（2）测量NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）
对于实施例17-（1）中制备的开始培养后第20天的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，只是使用乳腺癌细胞株BT-474和SKBR3以及胃癌细胞株NCI-N87，向每个细胞株添加终浓度为10 μL/mL的曲妥珠单抗制剂（产品名，Herceptin注射用；由Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.生产），所述细胞株已用1% BSA/DPBS调节至1×106细胞/mL，并在4℃温育30分钟。将细胞离心、洗涤，并用含有5%胎牛血清的RPMI1640培养基调节至2×106细胞/mL，并将所获得的细胞液用作靶细胞。此时，E/T比为10、3或1，还制备不向其中添加曲妥珠单抗制剂的组。测量细胞毒性活性的结果显示在表33中。
[表33]
曲妥珠单抗制剂是与作为癌基因的Her2（人表皮生长因子2型受体）结合的抗体，并通过NK细胞的Fc受体（CD16分子等）激发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。如表33所示清楚的是，使用OK-432和RN-T AIC培养获得的细胞群对各种用曲妥珠单抗制剂处理的靶细胞表现出进一步高的细胞毒性活性。用于本实施例中的细胞株是高表达Her2的株，并且确认这些细胞群是对多种表达Her2的癌细胞系产生高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的高功能性NK细胞。
实施例18：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较添加的AIC量）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例3-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板，除了在使用前立即用DPBS洗涤固定了抗人CD3抗体/ RetroNectin的平板2次和用GT-T551洗涤1次以外。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备AIC
使用实施例18-（2）中制备的RN-T，按与实施例3-（3）相同的方式制备AIC，除了将开始培养后第7天回收的RN-T悬浮在X射线照射后的0.8HCellGro中并用于下列实验以外。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例12-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了添加的RN-T AIC的细胞数设置为相对于响应细胞为1倍、5倍或10倍、并向所有组添加OK-432以外。作为基础培养基，使用0.8HCellGro直到开始培养起第11天，并且分别在本实施例中的第5天、第8天和第15天实施实施例12-（4）中第4天、第7天和第13天的操作。在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表34中。
[表34]
| 响应细胞和AIC的比例 | 扩增培养率 | NK细胞含有率（%） |
| 1:1 | ×260.5 | 96.5 |
| 1:5 | ×333.1 | 99.0 |
| 1:10 | ×339.8 | 99.5 |
如表34所示，通过使添加的RN-T AIC的比例增加5倍或10倍，获得高的扩增培养率和高的NK细胞含有率（%）。
换言之清楚的是，NK细胞的增殖力是增加的RN-T AIC量依赖性的，并且清楚的是，在NK细胞培养中优选使用RN-T AIC。
实施例19：测量使用OK-432和AIC培养的NK细胞在冷冻/解冻后的细胞毒性活性
（1）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例14-（1）相同的方式，实施抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞的扩增培养。
（2）使用RN-T制备AIC
使用实施例19-（1）中制备的RN-T，按与实施例14-（2）相同的方式制备AIC。
（3）NK细胞群的扩增培养
以与实施例14-（3）相同的方式实施NK细胞群的扩增培养。
（4）NK细胞的保存
以与实施例1-（1）相同的方式，使用CP-1/HSA将实施例19-（3）中制备的第16天的细胞调节至1×108细胞/小瓶并保存在液氮中。
（5）NK细胞的解冻
在37℃水浴中快速解冻实施例19-（4）中冷冻保存的细胞，并使用GT-T502洗涤。使用0.2HGT-T503将这些细胞调节至约2×106细胞/mL，并向12孔细胞培养板添加各4 mL悬浮液。以0（无添加组）、200或1000 U/mL的量向平板添加IL-2，并将平板在37℃、存在5% CO2的情况下温育过夜。
（6）测量NK细胞的细胞毒性活性
使用在实施例19-（3）和（5）中制备的细胞，按与实施例1-（5）相同的方式测量在冷冻保存前后对靶细胞A549和A375的细胞毒性活性，除了E/T比为10以外。结果显示在表35中。
[表35]
如表35所示，NK细胞在冷冻/解冻后即刻瞬时表现出降低的细胞毒性活性。然而，在培养过夜后，NK细胞表现的细胞毒性活性与冷冻/解冻后即刻比较是相等的。通过添加IL-2培养，进一步增强了活性，并且表现出超过冷冻前的活性的细胞毒性活性。
换言之清楚的是，通过在冷冻和解冻后培养NK细胞过夜，恢复了活性，并通过添加IL-2进一步增加了细胞毒性活性。
实施例20：使用OK-432和温热处理的细胞培养NK细胞（比较温热处理条件1）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备温热处理的细胞
按与实施例16-（3）相同的方式，温热处理实施例20-（2）中制备的RN-T，以制备温热处理的RN-T，条件是用于温热处理的温度是45℃和48℃，处理时间为0.5、1、2或4小时，并且用0.8HCellGro将用于处理的细胞浓度调节至2×106细胞/mL。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例12-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了设立应用温热处理的RN-T代替AIC和添加OK-432的组、和仅添加OK-432的组（在后文中称为对照组）。分别在本实施例中的第2天和第14天实施实施例12-（4）中第1天和第13天的操作。在开始培养后第16天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表36中。
[表36]
如表36所示，相比未添加温热处理的细胞的组（对照组），通过使用了OK-432和温热处理的RN-T，获得了更高的扩增培养率和更高的NK细胞含有率（%）。用于温热处理的温度和时间没有特殊的限制，并且在广范围的处理情况下确认了所需效果。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中组合OK-432和RN-T温热处理的细胞，以高的扩增培养率获得了高纯度NK细胞。
实施例21：使用OK-432和温热处理的细胞培养NK细胞（比较温热处理条件2）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备温热处理的细胞
用GT-T551将实施例21-（3）中制备的RN-T悬浮为1或2×106细胞/mL。将制备的细胞液（50 mL）转移到200 mL分离袋（由TERUMO CORPORATION生产），并使用45℃的水浴实施温热处理0.25或0.5小时，条件是在2×106细胞/mL的细胞浓度下，仅在45℃实施温热处理0.5小时。将温热处理后的细胞液回收到50 mL锥形管（由Corning Incorporated生产）中，在440×g和室温离心5分钟。离心后，去除上清液，将细胞按2×106细胞/mL悬浮在0.8HCellGro中。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例12-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了在开始培养时，向12孔细胞培养板添加各0.95 mL/孔的响应细胞和温热处理的RN-T，使得共计1.9 mL/孔。在第3天，向每个孔添加1.9 mL的0.8HCellGro。在第7天，使用0.8HCellGro将每个孔的细胞液6倍稀释，将1.4 mL细胞液转移到新的T25细胞培养瓶（由FALCON生产，或由Corning Incorporated生产），并将瓶竖立实施培养。在第11天和第14天实施相同的传代培养操作，继续培养直到第17天。对第11天和第14天的细胞液的稀释分别是用0.8HGT-T502稀释5倍和用0.29HGT-T502稀释3倍。在开始培养后第17天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表37中。
[表37]
如表37所示，相比仅添加OK-432而未添加温热处理的细胞的对照组，在添加了OK-432和温热处理的RN-T的组中，在不特殊限制温热处理的时间和细胞浓度的情况下，在广泛的处理条件下确认了所需效果。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中组合OK-432和RN-T温热处理细胞，获得了高的扩增培养率和高纯度的NK细胞。
实施例22：使用NK细胞测量多功能能力
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备AIC
按与实施例18-（3）相同的方式，实施AIC的制备。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例21-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用实施例22-（3）中制备的AIC替代温热处理的细胞、在本实施例的第2天实施实施例21-（4）中第3天的操作并继续培养直到第22天。
（5）测量NK细胞的多功能能力
在用5HRPMI将实施例22-（4）中制备的开始培养后第22天的细胞稀释至3×106细胞/mL作为效应细胞后，向96孔细胞培养板的每个孔中分配各100 μL/孔的稀释液。向每个板中加入调节至1×106细胞/mL的各100 μL/孔的靶细胞（K562）。此时，效应细胞（E）与靶细胞（T）的比例，即E/T比是3。加入各1 μL/孔的PE/Cy5-标记的小鼠CD107a抗体（由abcam plc.生产），并在37℃温育平板1小时。此外，在添加终浓度为10 μg/mL的Brefeldin A（由Sigma Corporation生产）后，在37℃温育平板3小时。在250×g离心温育后的平板5分钟，去除上清液，并将细胞悬浮在1% BSA/DPBS中，添加ECD-标记的小鼠抗人CD3抗体和PC7-标记的小鼠抗人CD56抗体（都由Beckman Coulter Inc.生产）。相似地，作为阴性对照，向各细胞群的一部分添加FITC-标记的小鼠IgG1/RD1-标记的小鼠IgG1/PC5-标记的小鼠IgG1（由Beckman Coulter Inc.生产）。在添加每种抗体后，在4℃温育细胞30分钟，之后，用0.1% BSA/DPBS洗涤。为了测量细胞内细胞因子，使用IntraPrep（由Beckman Coulter Inc.生产）。在出于细胞的固定化和膜透化处理的目的使用IntraPrepReagent后，添加FITC-标记的小鼠抗人TNF-α抗体（由BD Biosciences生产）和PE-标记的小鼠抗人IFN-γ抗体（由Beckman Coulter Inc. 生产）。在添加每种抗体后，在室温温育细胞15分钟。在250×g离心温育后的平板5分钟，去除上清液，之后将细胞用0.1% BSA/DPBS悬浮。将这些细胞经受流式细胞仪分析，计算NK细胞中的CD107a、TNF-α和IFN-γ阳性比例，其中，CD3阴性和CD56阳性细胞组被视为NK细胞，并分析多功能能力。在多功能能力的分析中，同时表达CD107a、TNF-α和IFN-γ的三种的细胞被视为“+++”，表达其中两种的细胞被视为“++”，表达其中一种的细胞被视为“+”，而不表达任何一种的细胞被视为“-”。结果显示在表38中。
[表38]
如表38所示，确认通过混合NK细胞和靶细胞增加了多功能能力。
换言之清楚的是，通过本发明的培养方法培养的NK细胞具有高的多功能能力，并且所述功能在与肿瘤细胞混合时进一步增加，且显示NK细胞是具有高的多功能能力的NK细胞。
实施例23：使用OK-432和丝裂霉素处理的细胞培养NK细胞
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备丝裂霉素C处理的细胞
使用5HRPMI将实施例23-（2）中制备的RN-T按2×106细胞/mL悬浮。将制备的细胞液（5 mL）转移到15 mL锥形管（由Corning Incorporated生产），添加终浓度为10或20 μg/mL的丝裂霉素C（产品名称：Mitomycin Kyowa S，由Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.生产），并将其在37℃温育0.5或1.0小时。在反应后，在440×g和室温下实施离心5分钟。在离心后，去除上清液，并用5HRPMI相似地洗涤细胞2次，并使用0.8% HCellGro调节至2×106细胞/mL。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例21-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了设立丝裂霉素C处理的细胞条件组替代温热处理的细胞以外。并且在对照组中，仅添加OK-432。在本实施例的第1天实施实施例21-（4）中第3天的操作，继续培养直到第18天。在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表39中。
[表39]
如表39所示，相比仅添加OK-432和未添加丝裂霉素C处理的细胞的对照组，在不特别限制丝裂霉素C处理的浓度和时间的广泛处理情况下，在添加OK-432和丝裂霉素C处理的RN-T的组中确认了所需的效果。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中组合OK-432和丝裂霉素C处理的RN-T细胞，以高的扩增培养率获得了高纯度的NK细胞。
实施例24：使用OK-432和AIC培养NK细胞（比较AIC处理的细胞）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。还生产仅固定了抗人CD3抗体的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞和抗CD3抗体刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。相似地，使用实施例24-（1）中制备的其上仅固定了抗人CD3抗体的平板，还制备了通过抗CD3抗体刺激扩增培养的T细胞（在后文中称为OKT3-T）。
（3）使用RN-T和OKT3-T制备AIC
按与实施例18-（3）相同的方式，实施RN-T AIC的制备。此时，使用实施例24-（2）中制备的OKT3-T，相似地制备AIC（在后文中称为OKT3-T AIC）。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例23-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了还设立在第一天添加实施例24-（3）中制备的RN-T AIC或OKT3-T AIC或与以实施例1-（2）相同的方式制备的PBMC AIC的组。此外，在开始培养后第7天，添加各1×106细胞/瓶的RN-T AIC、OKT3-T AIC或PBMC AIC。使用仅添加OK-432的组作为对照组。在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例1-（4）相同的方式，分析NK细胞含有率。结果显示在表40中。
[表40]
| 使用的AIC | 扩增培养率 | NK细胞含有率（%） |
| RN-T AIC | ×268.9 | 98.3 |
| OKT3-T AIC | ×270.0 | 96.3 |
| PBMC AIC | ×200.2 | 90.6 |
| 对照组 | ×111.4 | 71.7 |
如表40所示，相比使用PBMC AIC的情况，在使用RN-T AIC或OKT3-T AIC的组中，获得了更高的扩增培养率和更高的NK细胞含有率。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中使用OKT3-T或RN-T作为AIC，以高的扩增培养率获得了高纯度的NK细胞。
PBMC用于制备AIC的用途必需大量的血液。然而，通过使用从少量血液扩增培养的OK-432或RN-T，可以大量地获得具有更高纯度的高功能性NK细胞，同时降低对患者自身的生理负担。因而，根据本发明，能够利用具有较小生理负担的NK扩增培养技术。
实施例25：使用OK-432和温热处理的细胞培养NK细胞（比较温热处理的细胞）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例24-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板，还生产其上仅固定了抗人CD3抗体的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞和抗CD3抗体刺激的T细胞
按与实施例24-（2）相同的方式，实施RN-T和OKT3-T的扩增培养。
（3）使用RN-T和OKT3-T制备温热处理的细胞
按与实施例16-（3）相同的方式，实施温热处理的细胞的制备。此时，使用实施例25-（2）中制备的OKT3-T，相似地制备温热处理的细胞（在后文中称为温热处理的OKT3-T细胞）。
（4）NK细胞群的扩增培养
以与实施例24-（4）相同的方式实施NK细胞的扩增培养，除了使用实施例25-（3）中制备的温热处理的RN-T细胞和温热处理的OKT3-T细胞、或者还设立仅添加OK432的组作为对照组。在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以实施例9-（6）相同的方式，分析NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表41中。
[表41]
| 使用温热处理的细胞 | 扩增培养率 | NK细胞含有率（%） | CD16+CD56+细胞含有率（%） |
| 温热处理的RN-T | ×185.6 | 83.5 | 77.0 |
| 温热处理的OKT3-T | ×189.0 | 72.6 | 68.2 |
| 对照组 | ×111.4 | 71.7 | 64.9 |
如表41所示，相比使用温热处理的OKT3-T细胞的情况，在使用温热处理的RN-T细胞的组中，获得了更高的扩增培养率和更高的NK细胞含有率，以及更高的CD16阳性CD56阳性细胞含有率。
换言之清楚的是，通过在NK细胞培养中使用RN-T作为温热细胞，以更高的扩增培养率获得了高纯度和高功能性的NK细胞。
实施例26：使用免疫缺陷小鼠异源肿瘤模型评估人NK细胞的抗肿瘤活性
（1）小鼠和组的构成
制备7周龄的雌性16 NOD/scid小鼠（由CLEA Japan, Inc.生产），使其具有下表42显示的组构成。施用人NK细胞的组是B至D组。在每个组中，N=4。
[表42]
（2）施用抗脱唾液酸（anti-asialo）GM1抗体
已知用抗脱唾液酸 GM1抗体处理去除小鼠NK细胞并增强人细胞在NOD/scid小鼠中的植入。在接种A549前一天和第一次施用人NK细胞前一天，用0.38 mL含0.4% HAS的生理盐水（由Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.生产）稀释20 μL抗脱唾液酸 GM1抗体溶液（由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生产），并且所有的量都腹膜内施用于小鼠。
（3）NOD/scid-A549的异源肿瘤模型
用X射线（3 Gy）照射所有的NOD/scid小鼠组，在麻醉下，将右腹股沟区的毛发剔去约9平方厘米，并皮下接种已调节至5×107细胞/mL 的0.1 mL 的在RPMI1640培养基中的A549。
（4）培养/制备待施用的人NK细胞
按与实施例14-（3）相同的方式，实施人NK细胞的扩增培养，除了在开始培养后第16天添加终浓度为200 U/mL的IL-2、和在第18天使用0.2% HSA/GT-T503将CultiLife Eva 中的338 mL细胞液调节至675 mL的总液体量，之后，以终浓度为200 U/mL添加IL-2，并将细胞液转移至CultiLife Eva。继续培养直到第21天。
（5）施用人NK细胞
在接种肿瘤后第7天、第9天和第12天共计3次，实施下列处理。
向A组的尾静脉中施用0.3 mL含4% HAS的生理盐水。向B组的尾静脉中施用0.3 mL用含4% HAS的生理盐水调节至3.33×107细胞/mL的人NK细胞。用含4% HAS的生理盐水将按与实施例15-（2）相同的方式将IFNα处理的人NK细胞调节至3.33×107细胞/mL，向C组的尾静脉中施用0.3 mL细胞液。向D组瘤内施用0.1 mL用含4% HAS的生理盐水调节至1.00×108细胞/mL的人NK细胞。
（6）在NOD/scid-A549的异源肿瘤模型中施用人NK细胞后评估抗肿瘤活性
在接种肿瘤后第42天，使用电子游标卡尺测量每个个体的肿瘤体积。其结果显示在表43中。
使用下列等式（3）计算肿瘤体积：
[数学式3]
肿瘤体积（mm3）=R1×R1×R2×0.5 等式（3）
其中R1代表短直径，R2代表长直径。
[表43]
此外，测量每个个体中接种肿瘤后第42天的肿瘤重量。结果显示在表44中。
[表44]
如表43和44所示清楚的是，在施用通过本发明的培养方法扩增培养的人NK细胞的组中，相比对照组（A组），肿瘤体积和肿瘤重量都较小，且表现出更高的抗肿瘤活性。通过用IFNα处理待施用的人NK细胞增强了该效果。当实施瘤内施用时，表现出更显著的抗肿瘤活性，并识别了通过本发明方法扩增培养的人NK细胞的高有效性。
根据上述结果，确认了通过施用由本发明的培养方法培养的人NK细胞的处理非常有效。
实施例27：使用免疫缺陷小鼠异源肿瘤转移模型评估人NK细胞的转移抑制活性
（1）小鼠和组的构成
制备7周龄的雌性20 NOD/scid小鼠，使其具有下表45显示的组构成。施用人NK细胞的组是B至E组。在每个组中，N=4。
[表45]
（2）施用抗脱唾液酸 GM1抗体
在接种A549前一天，用0.38 mL含0.4% HAS的生理盐水稀释20 μL抗脱唾液酸 GM1抗体溶液，并且所有的量都腹膜内施用于小鼠。
（3）NOD/scid-A549的异源肿瘤转移模型
用X射线（3 Gy）照射所有的NOD/scid小鼠组，并将0.3 mL在RPMI1640培养基中已调节至6.6×106细胞/mL 的A549施用于尾静脉中。
（4）培养人NK细胞
按与实施例26-（4）相同的方式，实施人NK细胞的扩增培养，除了在开始培养后第21天，使用0.2% HSA/GT-T503将CultiLife Eva 中的338 mL细胞液调节至675 mL的总液体量，之后，以终浓度为200 U/mL添加IL-2以外。继续培养直到第23天。
（5）制备用于施用的细胞
按与实施例15-（2）相同的方式，产生用IFNα处理开始培养后第18天、第21天或第23天的细胞的组（IFNα处理的NK细胞），除了使用用GT-T503调节至5×107细胞/mL的细胞液实施IFNα处理以外。相似地，设立这样的条件，在所述条件下添加终浓度为1000 U/mL的IL-2（IL-2处理的NK细胞）或添加终浓度各为1000 U/mL的IFN-α和IL-2（IFNα+IL-2处理的NK细胞），并允许每个组在5% CO2温箱中在37℃下静置1小时。此外，设立仅允许细胞在5% CO2温箱中在37℃下静置的条件。
使用含4% HAS的生理盐水将人NK细胞和每种处理的人NK细胞调节至3.33×107细胞/mL。
（6）人NK细胞的施用
在施用肿瘤后3天、6天和8天后共计3次，实施下列处理。
向A组的尾静脉中施用0.3 mL含4% HAS的生理盐水。向B组的尾静脉中施用0.3 mL人NK细胞，向C组的尾静脉中施用0.3 mL IFNα-处理的人NK细胞，向D组的尾静脉中施用0.3 mL的IL-2-处理的人NK细胞，向E组的尾静脉中施用0.3 mL的IFNα+IL-2-处理的人NK细胞。
（7）在NOD/scid-A549的异源肿瘤转移模型中评估施用人NK细胞后的抗肿瘤活性
测量每个个体在施用肿瘤后第31天的肝重。其结果显示在表46中。
[表46]
如表46所示清楚的是，相比对照组，施用通过本发明的培养方法扩增培养的人NK细胞的组具有较低的肝重量和更高的转移抑制活性。根据上述结果，确认通过施用由本发明的培养方法培养的人NK细胞来治疗是非常有效的。
实施例28：比较使用OK-432和AIC的NK细胞扩增培养方法与使用OKT-3的NK细胞扩增培养方法
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例18-（3）相同的方式，制备RN-T AIC。
（4）使用OK-432和AIC扩增培养NK细胞群
按与实施例1-（1）相同的方式，分离PBMC，并在没有冷冻保存的情况下用于扩增培养NK细胞。用0.8HCellGro将分离的PBMC调节至2×106细胞，并向48孔细胞培养板（Corning Incorporated制造）添加各0.25 mL细胞液。添加各0.25 mL实施例28-（3）中制备的RN-T AIC，添加终浓度为0.05 KE/mL的OK-432，添加终浓度为200 U/mL的IL-2，开始培养。
在开始培养后第2天，向平板的每个孔添加各0.25 mL的0.8HCellGro，添加终浓度为200 U/mL的IL-2。在第4天，添加终浓度为200 U/mL的IL-2。在第7天，使用0.8HCellGro将每个孔的细胞液6倍稀释，并将1.596 mL稀释的细胞液转移到新的24孔细胞培养板。在第11天，使用0.8HGT-T502将每个孔的细胞液5倍稀释，并将1.330 mL稀释的细胞液转移到新的24孔细胞培养板。在第14天，使用0.3HGT-T502将细胞液3倍稀释，并将2.0 mL稀释的细胞液转移到新的24孔细胞培养板，继续培养直到第18天。在本实施例中，后文中将本方法称为A方法。
（5）使用OKT-3扩增培养NK细胞群
（参考出版物：Alici等人，BLOOD，2008，第111卷，第3155-3162页，和美国公开号2003/0068306）
按与实施例1-（1）相同的方式，分离PBMC，并在没有冷冻保存的情况下用于扩增培养NK细胞。用5HCellGro将分离的PBMC调节至0.5×106细胞，向48孔细胞培养板添加各1 mL细胞液。添加终浓度为10 ng/mL的OKT-3，添加终浓度为500 U/mL的IL-2，开始培养。
在开始培养后第5天，在500×g离心细胞5分钟后，弃去上清液，并用2 mL的5HCellGro悬浮细胞。在将所有的量添加到新的24孔细胞培养板后，添加终浓度为500 U/mL的IL-2。在开始培养后第7天、第9天、第11天、第13天和第15天，将1 mL细胞液转移到新的24孔细胞培养板，添加1 mL的5HCellGro，之后添加终浓度为500 U/mL的IL-2。继续培养直到第18天。在本实施例中，后文中将本方法称为B方法。
（6）分析表面抗原
在实施例28-（4）和实施例28-（5）的NK细胞群的扩增培养中，以与实施例14-（4）相同的方式分析T细胞含有率、NK细胞含有率、CD16阳性CD56阳性细胞含有率和NKG2D阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表47中。
[表47]
如表47所示，在A方法中，培养后的NK细胞比率显著更高，且以进一步更高的比例表达CD16和NKG6D，并且确认，以高比例含有表达在发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用的CD16分子的高功能性NK细胞和通过NKG2D表现出高细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
（7）测量细胞毒性活性
对于实施例28-（4）和实施例28-（5）中制备开始培养后第18天的细胞，以与实施例14-（5）相同的方式测量细胞毒性活性。结果显示在表48中。
[表48]
如表48所示清楚的是，通过A方法获得的细胞群对各种靶细胞表现出比通过B方法获得的细胞群更高的细胞毒性活性。在表达I类MHC的细胞株A549中显著的确认了活性的差异，并确认了细胞群是对多种癌细胞株发挥细胞毒性活性的的高功能性NK细胞。
换言之清楚的是，相比其他培养方法，通过本发明方法扩增培养的NK细胞群具有更高纯度的CD3阴性CD56阳性细胞，并以更高的比例表达CD16和NKG2D，且是具有更高细胞毒性的NK细胞群。
实施例29：扩增培养纯化的CD3阴性CD56阳性细胞
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例18-（3）相同的方式，制备RN-T AIC。
（4）纯化CD3阴性CD56阳性细胞
按与实施例1-（1）相同的方式，分离PBMC，并在没有冷冻保存的情况下用于纯化CD3阴性CD56阳性细胞。然后，将PBMC按5×107细胞悬浮在含有0.4 mL的0.5% BSA和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA，由Nacalai Tesque, Inc.生产）的 DPBS（在后文中称为选择缓冲液）中，添加0.1 mL CD3微珠（由Miltenyi Biotec, Inc.生产），在4℃温育悬浮液15分钟。在添加5 mL选择缓冲液后，在300×g离心10分钟，去除上清液，将细胞悬浮在0. 5 mL选择缓冲液中。将细胞悬浮液通过LS柱（由Miltenyi Biotec, Inc.生产），所述LS柱预先固定在磁场中并通过了3 mL选择缓冲液，并用3 mL选择缓冲液洗涤柱子3次，从而收集未与柱子结合的级分，获得3.5×107 CD3阴性细胞。
将获得的CD3阴性细胞悬浮在0.28 mL选择缓冲液中，添加70 μL CD56微珠（由Miltenyi Biotec, Inc.生产），在4℃温育悬浮液15分钟。在添加选择缓冲液（5 mL）后，在300×g离心10分钟，去除上清液，将细胞悬浮在0.5 mL选择缓冲液中。将细胞悬浮液通过LS柱（由Miltenyi Biotec, Inc.生产），所述LS柱预先固定在磁场中并通过了0.5 mL选择缓冲液，用0.5 mL选择缓冲液洗涤柱子3次。从磁场中移出柱子，将1 mL选择缓冲液通过柱子，获得7.2×106 CD3阴性CD56阳性细胞。
（5）使用OK-432和AIC扩增培养NK细胞群
用0.8HCellGro将实施例29-（4）中纯化的CD3阴性CD56阳性细胞调节至2×106细胞，向48孔细胞培养板添加各0.25 mL悬浮液。设立AIC添加条件和AIC非添加条件。在AIC添加情况下，添加各0.25 mL实施例29-（3）中制备的RN-T AIC。在AIC非添加情况下，添加各0.25 mL的0.8HCellGro。添加终浓度为0.05 KE/mL的OK-432，添加终浓度为200 U/mL的IL-2，并开始培养。
在开始培养后第2天和之后，按与实施例28-（4）相同的方式实施培养。在本实施例中，后文中将本方法称为A’方法。
（6）使用X-VIVO 10培养基（由Lonza生产）扩增培养NK细胞群
（参考出版物：Koehl等人，BLOOD Cells，Molecules, and Diseases，2004，第33卷，第261-266页）
用含有10%人AB型血清的X-VIVO 10培养基（在后文中称为10HX-VIVO）将实施例29-（4）中纯化的CD3阴性CD56阳性细胞调节至1×106细胞/mL，并向48孔细胞培养板添加各0.5 mL悬浮液。添加终浓度为1000 U/mL的IL-2，开始培养。
在开始培养后第3天，添加0.5 mL的10HX-VIVO，并添加终浓度为1000 U/mL的IL-2。在开始培养后第6天，将所有量的细胞液转移到新的24孔细胞培养板，添加1 mL的10HX-VIVO，添加终浓度为1000 U/mL的IL-2。在第9天、第12天和第15天，去除1 mL培养上清液，添加1 mL的10HX-VIVO，然后添加终浓度为1000 U/mL的IL-2。继续培养直到第18天。在本实施例中，后文将本方法称为C方法。
（7）测量细胞数和分析表面抗原
在实施例29-（5）和实施例29-（6）的NK细胞群的扩增培养中，在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。此外，以与实施例14-（4）相同的方式，分析T细胞含有率、NK细胞含有率、CD16阳性CD56阳性细胞含有率和NKG2D阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表49中。
[表49]
如表49所示，在使用OK-432的扩增培养方法（A’方法）中，使用纯化的外周血CD3阴性CD56阳性细胞的培养中的扩增培养率显著高于使用X-VIVO 10培养基的扩增培养方法（C方法）。在A’方法中，在使用AIC的情况下的扩增培养率更高。此外，A’方法和C方法之间的培养后的NK细胞率和NKG2D表达率是等价的。然而，不论存在或缺少AIC，A’方法中在发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用的CD16分子的表达更高，并且确认以高比例含有表现出高细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
（8）测量细胞毒性活性
对于实施例29-（5）和实施例29-（6）中制备开始培养后第18天的细胞，以与实施例1-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，条件是使用A549作为靶细胞和在E/T比为10、3、1和0.3下实施测量。细胞毒性活性的测量结果显示在表50中。
[表50]
如表50所示清楚的是，不论存在或缺少AIC的使用，通过A’方法获得的细胞群对表达I类MHC的细胞株A549中表现出比C方法更高的细胞毒性活性。
换言之清楚的是，相比其他培养方法，在根据本发明NK细胞的扩增培养中，即使使用纯化的外周血CD3阴性CD56阳性细胞作为培养开始细胞时，也表现出显著更高的扩增培养率，并可以以高纯度培养具有更高细胞毒性的NK细胞。
实施例30：比较NK细胞和外周血衍生的CD3阴性CD56阳性细胞在扩增培养后的活性
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和 RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例3-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）制备RN-T AIC
按与实施例18-（3）相同的方式，制备RN-T-AIC。
（4）纯化外周血CD3阴性CD56阳性细胞
按与实施例29-（4）相同的方式，纯化CD3阴性CD56阳性细胞。
（5）使用OK-432和AIC扩增培养NK细胞群
使用PBMC或纯化的CD3阴性CD56阳性细胞实施NK细胞群的扩增培养。按与实施例28-（4）相同的方式实施使用PBMC的扩增培养。按与实施例29-（5）相同的方式实施使用纯化的CD3阴性CD56阳性细胞的扩增培养，除了仅实施AIC添加条件以外。
（6）在扩增培养后测量细胞数
在实施例30-（5）中的NK细胞群的扩增培养中，在开始培养后第18天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表51中。
[表51]
| 开始培养的细胞条件 | 扩增培养率 |
| PBMC | ×124.4 |
| CD3+CD56- | ×127.0 |
如表51所示清楚的是，在使用OK-432和AIC的NK细胞群的扩增培养中，当培养开始细胞是PBMC或纯化的CD3阴性CD56阳性细胞时，获得等价的扩增培养率。
（7）分析表面抗原
按与实施例14-（4）相同的方式，使用实施例30-（4）的纯化的外周血CD3阴性CD56阳性细胞和实施例30-（5）的培养后的细胞，分析T细胞含有率、NK细胞含有率和CD16阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表52中。
[表52]
如表52所示清楚的是，在使用OK-432和AIC的NK细胞群的扩增培养中，在使用PBMC或纯化的CD3阴性CD56阳性细胞作为培养开始细胞的任一情况下，获得了相等地表现高纯度和高CD16阳性率的高功能性NK细胞。此外，在开始培养后第18天的细胞具有比CD3阴性CD56阳性细胞在培养前更高的CD16表达率，并且显示通过本发明扩增培养的细胞群是功能上优秀的细胞群。
（8）测量细胞毒性活性
使用实施例30-（4）的纯化的外周血CD3阴性CD56阳性细胞和实施例30-（5）的培养后的细胞，以与实施例14-（5）相同的方式测量细胞毒性活性。结果显示在表53中。
[表53]
如表53所示清楚的是，在使用PBMC或纯化的CD3阴性CD56阳性细胞作为培养开始细胞的任一情况下，与纯化的外周血CD3阴性CD56阳性细胞相比，通过使用OK-432和AIC扩增培养NK细胞群获得的细胞群对各种靶细胞表现出更高的细胞毒性活性。对于表达I类MHC的细胞株A549显著地确认了活性差异，并且确认了这些细胞群是对多种癌细胞株发挥细胞毒性活性的高功能性NK细胞。此外清楚的是，通过使用纯化的CD3阴性CD56阳性细胞作为培养开始细胞获得表现出进一步更高的细胞毒性活性的NK细胞群。
换言之清楚的是，本发明是具有增强外周血CD3阴性CD56阳性细胞的功能性的效果的培养方法。
实施例31：比较使用OK-432和AIC的NK细胞培养和各种NK细胞培养方法
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例12-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养，除了培养期为15天以外。
（3）使用RN-T制备AIC
使用实施例31-（2）中制备的RN-T，按与实施例5-（3）相同的方式制备AIC，除了将使用开始培养后第8天的RN-T制备的RN-T AIC按2×106细胞/mL悬浮在0.8HCellGro中、和将使用开始培养后第15天的RN-T制备的RN-T AIC按1×106细胞/mL悬浮在0.8HCellGro中以外。
（4）使用OK-432和AIC扩增培养NK细胞群
按与实施例17-（1）相同的方式实施使用NK细胞的扩增培养，除了在开始培养后第7天将每个孔的1.4 mL细胞液转移到新的T25细胞培养瓶、并用0.8HCellGro稀释6倍以外。在第11天和第14天实施相同的传代培养操作，继续培养直到第16天。在开始培养后第11天和第14天的细胞液稀释分别是用0.8HGT-T502稀释5倍、和用0.3HGT-T502稀释3倍。在开始培养后第7天，添加实施例31-（3）中制备的两种RN-T AIC各2.5 ×106细胞/瓶。继续培养直到开始培养后第16天。在本实施例和实施例32中，后文将本方法称为A’’方法。
（5）制备固定了抗人CD16抗体的摇瓶
向T25细胞培养瓶加入各0.57 mL/瓶的含有LEAF纯化的抗人CD16（由BioLegend, Inc.生产；在后文中称为抗人CD16抗体）的DPBS，所述抗人CD16具有1 μg/mL的终浓度，并制备必需的瓶数，在37℃、存在5% CO2的情况下温育过夜。在使用前立即用DPBS洗涤固定了抗人CD16抗体的摇瓶2次。
（6）使用OK-432和抗人CD16抗体扩增培养NK细胞群
（参考出版物：JP-A 2007-297291，JP-B 4275680）
将按与实施例1-（1）相同的方式制备的PBMC按1×106细胞/mL悬浮在含有5%人AB型血清的AIM V培养基（由Invitrogen Corporation生产，在后文中称为5HAIM V）中，并向实施例31-（5）中制备的固定了抗人CD16抗体的摇瓶添加各1.7 mL/瓶的悬浮液。向每个瓶添加终浓度为0.01 KE/mL的OK-432，并向每个瓶添加终浓度为700 U/mL的IL-2，在这些瓶中，在39℃、存在5% CO2的情况下开始培养（培养第0天），条件是在第1天和之后，这些瓶在37℃、存在5% CO2的情况下培养。在第4天，回收每个瓶的所有量的细胞液，在320×g和室温下离心，之后，移去上清液。在用5HAIM V将从每个瓶回收的细胞悬浮至1×106细胞/mL后，将所有的量添加到新的T25细胞培养瓶。在第6天，用5HAIM V将每个瓶的细胞液稀释至0.1×106细胞/mL，使得共计1.3 mL/瓶，并将稀释液添加到新的T25细胞培养瓶。在第11天，向每个瓶添加2.6 mL的5HAIM V，使得共计3.9 mL/瓶。除了开始培养后第4天外，在第6天和第11天、第14天，向每个瓶添加终浓度为700 U/mL的IL-2，继续培养直到第16天。在本实施例中，后文将本方法称为D方法。
（7）制备固定了抗人CD52抗体和抗人CD3抗体的平板
向24孔细胞培养板中加入各0.5 mL/孔的含有终浓度为0.1 μg/mL的抗人CD3抗体和终浓度为20 μg/mL的大鼠抗人CD52（由AbD Serotec生产；在后文中称为抗人CD52抗体）的DPBS，产生必需的孔数，允许平板在4℃静置过夜。在使用前立即用DPBS洗涤固定了抗人CD52抗体/抗人CD3抗体的平板2次。
（8）使用抗人CD3抗体和抗人CD52抗体扩增培养NK细胞群
（参考出版物：JP-A 2006-340698）
在将按与实施例1-（1）相同的方式制备的PBMC按1×106细胞/mL悬浮在KBM540（由KOHJIN BIO Co., Ltd.生产）中之后，向实施例31-（5）中制备的固定了抗人CD52抗体/抗人CD3抗体的平板添加各1 mL/孔的悬浮液。在第3天，向每个瓶添加各1 mL的KBM540，使得共计2 mL/瓶。在第5天，将每个瓶的1 mL细胞液转移到新的6孔细胞培养板（由Becton, Dickinson and Company生产，或由Corning Incorporated生产），并用KBM540稀释11倍。在第9天和第14天实施相同的传代培养操作，每个细胞液的稀释度为用KBM540稀释2倍。除开始培养后第3天、第5天、第9天和第14天外，在第7天和第11天，向每个瓶添加终浓度为700 U/mL的IL-2，并继续培养直到第16天。在本实施例中，后文将本方法称为E方法。
（9）测量细胞数
在实施例31-（4）、实施例31-（5）和实施例31-（8）的NK细胞群的扩增培养中，在开始培养后第16天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，将该数目与开始培养时的细胞数比较，计算扩增培养率。结果显示在表54中。
[表54]
| 培养方法 | 扩增培养率 |
| NK培养开始后第16天 | |
| A’’方法 | ×158.6 |
| D方法 | × 33.3 |
| E方法 | ×174.9 |
（10）分析培养后的细胞群的表面抗原
按与实施例14-（4）相同的方式，对于实施例31-（4）、实施例31-（6）和实施例31-（8）中制备的开始培养后第16天的细胞，分析CD3-阳性CD56阴性细胞（T细胞）、CD3-阴性CD56阳性细胞（NK细胞）和CD16阳性CD56阳性细胞含有率，以及CD56阳性NKG2D阳性细胞含有率，除了还使用FITC标记的小鼠抗人CD69抗体（由eBioscience, Inc.生产）和FITC标记的小鼠抗人CXCR3抗体（由R&D Systems, Inc.生产）分析CD69阳性CD56阳性细胞含有率和CXCR3阳性CD56阳性细胞含有率以外。结果显示在表55中。
[表55]
如表54所示，在使用OK-432和AIC的扩增培养方法（A’’方法）中，扩增培养率等于使用抗人CD3抗体和抗人CD52抗体的扩增培养方法（E方法）的扩增培养率，并且相比使用OK-432和抗人CD16抗体的扩增培养方法（D方法）更高。如表55所示，A’’方法中培养后的NK细胞率显著高，且NK细胞以进一步更高的比例表达CD16、NKG2D、CD69和CXCR3。CD69也已知是活化诱导分子（AIM），其在白细胞活化的最初阶段表达，并涉及NK细胞的靶向细胞溶解作用。CXCR3是趋化因子CXCL9和CXCL10的配体，并认为其表现出高的向表达这些趋化因子的癌细胞迁移的能力和高的在这些细胞中积累的能力。因此，确认了通过A’’方法获得的NK细胞含有高比例的高比率表达CD16、NKG2D、CD69和CXCR3的高功能性NK细胞，同时，含有高比例的被认为具有高的向癌细胞迁移的能力和高的在活体内局部积累的能力的NK细胞，并且清楚的是，NK细胞是预期产生非常优秀的抗肿瘤活性的NK细胞群。
（11）测量细胞毒性活性
对于实施例31-（4）、实施例31-（6）和实施例31-（8）中制备的开始培养后第16天的细胞，以与实施例14-（5）相同的方式测量细胞毒性活性。细胞毒性活性的测量结果显示在表56中。
[表56]
如表56所示清楚的是，通过A’’方法获得的细胞群对各种靶细胞表现出高的细胞毒性活性。不仅在已知是NK细胞敏感性细胞株的K562上、而且在表达I类MHC的细胞株A549上也确认了所述活性，并且确认了该细胞群是对多种癌细胞系发挥细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
换言之清楚的是，相比已知的NK细胞培养方法，例如D方法和E方法，本发明的A’’方法是可以以良好纯度获得表现出CD3阴性CD56阳性CD16阳性表型并具有更高的细胞毒性的细胞群的培养方法。
实施例32：比较使用OK-432和AIC的NK细胞培养和各种NK细胞培养方法（比较在相同的基础培养基条件下的初始刺激）
（1）制备抗人CD3抗体和RetroNectin固定化平板
按与实施例18-（1）相同的方式，制备固定了抗人CD3抗体和RetroNectin的平板。
（2）扩增培养抗CD3抗体/RetroNectin刺激的T细胞
按与实施例31-（2）相同的方式，实施RN-T的扩增培养。
（3）使用RN-T制备AIC
按与实施例31-（3）相同的方式，制备AIC。
（4）扩增培养NK细胞群（使用OK-432和AIC的NK细胞培养）
按实施例31-（4）相同的方式，实施NK细胞的扩增培养（A’’方法）。
（5）制备固定了抗人CD16抗体的平板
向12孔细胞培养板中加入各0.217 mL/孔的含有终浓度为1 μg/mL的抗人CD16抗体的DPBS，制备必需的孔数，并在37℃、存在5% CO2的情况下温育平板过夜。在使用前立即用DPBS洗涤固定了抗人CD16抗体的平板2次。
（6）使用OK-432和抗人CD16抗体扩增培养NK细胞群
（参考出版物：JP-A 2007-297291，JP-B 4275680）
将按与实施例1-（1）相同的方式制备的PBMC按1×106细胞/mL悬浮在0.8HCellGro中之后，向实施例32-（5）中制备的固定了抗人CD16抗体的平板添加各1.9 mL/孔的悬浮液。向每个孔添加终浓度为0.05 KE/mL的OK-432，向每个孔添加终浓度为200 U/mL的IL-2，并在39℃、存在5% CO2的情况下开始培养（培养第0天），条件是在第1天和之后，在37℃、存在5% CO2的情况下实施培养。在第2天，向每孔加入各1.9 mL的0.8HCellGro，使得总计3.8 mL/孔。在第4天，回收每个孔的所有量的细胞液，在320×g和室温离心，之后去除上清液。在从每个孔回收细胞后，用3.8 mL的0.8HCellGro悬浮细胞，将所有量添加到新的12孔细胞培养板。在第7天，用0.8 HCellGro将每个瓶的1.4 mL细胞液稀释6倍，添加到新的T25细胞培养瓶。除了开始培养后第2天、第4天和第7天外，在第11天和第14天，向每个瓶添加终浓度为200 U/mL的IL-2，继续培养直到第16天。在本实施例中，后文将本方法称为D’方法。
（7）制备固定了抗人CD52抗体和抗人CD3抗体的平板
向24孔细胞培养板中加入各0.95 mL/孔的含有终浓度为0.1 μg/mL的抗人CD3抗体和终浓度为20 μg/mL的抗人CD52抗体的DPBS，产生必需的孔数，允许平板在4℃静置过夜。在使用前立即用DPBS洗涤固定了抗人CD52抗体/抗人CD3抗体的平板2次。
（8）使用抗人CD3抗体和抗人CD52抗体扩增培养NK细胞群
（参考出版物：JP-A 2006-340698）
将按与实施例1-（1）相同的方式制备的PBMC按1×106细胞/mL用0.8HCellGro悬浮后，向实施例32-（7）中制备的固定了抗人CD52抗体/抗人CD3抗体的平板添加各1.9 mL/孔的悬浮液。在第3天，向每个孔添加各1.9 mL的0.8HCellGro，使得共计3.8 mL/孔。在第5天，用0.8HCellGro将每个瓶1.4 mL细胞液稀释6倍，添加到新的T25细胞培养瓶中。在第9天、第11天和第14天实施相同的传代培养操作，并继续培养直到第16天。在开始培养后第9天、第11天和第14天的细胞液稀释度分别是用0.8HCellGro稀释2倍、用0.8HGT-T502稀释5倍和用0.3HGT-T502稀释3倍。除开始培养后第3天、第5天、第9天、第11天和第14天外，在第7天，向每个瓶添加终浓度为200 U/mL的IL-2，并继续培养直到第16天。在本实施例中，后文将本方法称为E’方法。
（9）分析培养后的细胞群的表面抗原
按与实施例31-（10）相同的方式，对于实施例32-（4）、实施例32-（6）和实施例32-（8）中制备的开始培养后第16天的细胞，分析CD3-阳性CD56阴性细胞（T细胞）、CD3-阴性CD56阳性细胞（NK细胞）、CD16阳性CD56阳性细胞含有率、CD56阳性NKG2D阳性细胞含有率、CD69阳性CD56阳性细胞含有率和CXCR3阳性CD56阳性细胞含有率。结果显示在表57中。
[表57]
如表57所示，A’’方法中的培养后的NK细胞比率显著高，而NK细胞以进一步更高的比例表达CD16、NKG2D、CD69和CXCR3。确认了通过A’’方法获得的NK细胞含有高比例的表达CD16、NKG2D、CD69和CXCR3的高功能性NK细胞，同时含有高比例的被认为具有高的向癌细胞迁移的能力和高的在活体内局部积累的能力的NK细胞，并且清楚的是，NK细胞是预期发挥非常优秀的抗肿瘤活性的NK细胞群。
（10）测量细胞毒性活性
对于实施例32-（4）、实施例32-（6）和实施例32-（8）中制备的开始培养后第16天的细胞，以与实施例14-（5）相同的方式测量细胞毒性活性，除了在E/T比为3、1和0.3下实施测量以外。细胞毒性活性的测量结果显示在表58中。
[表58]
如表58所示清楚的是，通过A’’方法获得的细胞群对各种靶细胞表现出高的细胞毒性活性。不仅在已知是NK细胞敏感性细胞株的K562上、而且在表达I类MHC的细胞株A549上也确认了所述活性，并确认了该细胞群是对多种癌细胞系发挥细胞毒性活性的高功能性NK细胞。
换言之清楚的是，相比已知的NK细胞培养方法，例如D’方法和E’方法，本发明的A’’方法是可以以良好纯度获得表现出CD3阴性CD56阳性CD16阳性表型并具有更高的细胞毒性的细胞群的培养方法。因而，即使在相同的培养基条件下，本发明的培养方法（NK细胞刺激方法）也比已知的NK细胞培养方法（NK细胞刺激方法）优秀得多。提示本发明可以提供治疗效果可预期的免疫疗法。
工业实用性
根据本发明，提供了扩增培养NK细胞的方法。该方法具有高的细胞增殖率，并且含有通过本方法获得的NK细胞的细胞群在细胞毒性活性方面是优异的，且在包括过继性免疫疗法在内的医学领域内非常有用。
Claims (12)
1.用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的细胞群的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物应答修饰剂是细菌来源的制剂。
3.根据权利要求2的方法，其中所述生物应答修饰剂是选自OK-432、BCG、化脓性链球菌（Streptcoccus pyogenes）、短棒杆菌（Corynebacterium parvum）及其细胞壁骨架的细菌来源的制剂。
4.根据权利要求1-3的任一项的方法，其中所述已经受消除增殖能力处理的细胞是选自已经受消除增殖能力处理的外周血单核细胞、T细胞、T细胞子集和B细胞的细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中所述已经受消除增殖能力处理的细胞是已经受消除增殖能力处理的人工扩增培养的T细胞。
6.根据权利要求1-5的任一项的方法，其中所述已经受消除增殖能力处理的细胞是源自与天然杀伤细胞或者能够分化成天然杀伤细胞的细胞相同的个体的细胞。
7.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中在存在已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下扩增培养的步骤包括实施多次的细胞添加。
8.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中所述外周血单核细胞用作天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞。
9.通过根据权利要求1-8的任一项方法获得的细胞群。
10.含有根据权利要求9的细胞群的药物。
11.根据权利要求9的细胞群，其用于治疗疾病。
12.治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用有效量的根据权利要求9的细胞群的步骤。
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