CN111655842B - 淋巴细胞生产方法 - Google Patents
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Abstract
在本发明中，通过在新型重组纤连蛋白片段的存在下培养淋巴细胞，来有效地生长淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明涉及可用于医学领域的淋巴细胞的生产方法。
活体主要通过免疫反应来保护免于外来物质。免疫***由各种细胞以及通过细胞产生的可溶性因子组成。在这些细胞中，淋巴细胞，其为白细胞的一种亚型，起着特别关键的作用。淋巴细胞主要分成三种类型：T细胞（有时称为T淋巴细胞）、B细胞（有时称为B淋巴细胞）和天然杀伤细胞（有时称为NK细胞）。
进一步地，T细胞细分类成辅助性T细胞，其表达CD（簇指名）4，并且主要参与辅助抗体产生和诱导各种免疫反应；细胞毒性T细胞（也称为细胞毒性T淋巴细胞或杀伤性T细胞），其表达CD8并且主要显示出细胞毒性活性；以及其它T细胞。
对于生产淋巴细胞的方法，可以将细胞外基质如基质胶、层粘连蛋白或纤连蛋白用作培养淋巴细胞的底物。
例如，在专利文献1中公开了使用纤连蛋白片段生产淋巴细胞的方法的研究。专利文献1中公开的方法包括在重组纤连蛋白片段如CH-296的存在下，培养祖细胞以有效地诱导、维持或扩增细胞毒性T细胞。然而，这种方法生产细胞毒性T细胞，并且不能有效地生产其它类型的淋巴细胞。
如上所述，尚未建立使用纤连蛋白片段生产各种类型的淋巴细胞的技术。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO2005/019450
发明概述
本发明解决的问题
为了解决用于生产淋巴细胞的常规方法的问题，本发明的目的是提供使用纤连蛋白片段生产各种类型的淋巴细胞的方法。
问题的解决方案
本发明人进行了大量研究以实现上述目的。结果，本发明人发现，通过在新型重组纤连蛋白片段的存在下培养淋巴细胞，淋巴细胞得到有效增殖。因此，完成了本发明。
具体地，本发明涉及：
[1]一种生产淋巴细胞的方法，该方法包括在以下的存在下培养淋巴细胞的步骤：
（a）包含人纤连蛋白III-1至3重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-1至3重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽；
（b）包含人纤连蛋白III-8至10重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-8至10重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽；和
（c）包含人纤连蛋白III-12至14重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-12至14重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽；
[2]根据[1]的方法，其中在含有在同一分子内的重组多肽（a）、（b）和（c）的重组多肽的存在下培养淋巴细胞；
[3]根据[2]的方法，其中所述重组多肽是包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列的重组多肽，或者包含通过1个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于SEQ IDNO：19的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽；
[4]根据[2]的方法，其中所述重组多肽是包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列的重组多肽，或者包含通过1个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于SEQ IDNO：31的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽；
[5]根据[1]至[4]中任一项的方法，其中在重组多肽和抗CD3抗体的存在下培养淋巴细胞；
[6]根据[1]至[5]中任一项的方法，其中在重组多肽的存在下培养淋巴细胞的步骤在其中用重组多肽包被的固相与淋巴细胞接触的状态下执行；
[7]根据[6]的方法，其中所述固相是细胞培养装置或细胞培养载体；
[8]根据[6]的方法，其中所述固相是皿、板、瓶、袋、珠、膜或载玻片；和
[9]根据[1]至[8]中任一项的方法，其中所述淋巴细胞是人衍生的淋巴细胞。
发明效果
本发明提供了用于生产淋巴细胞的方法。根据本发明的方法，可以有效地增殖淋巴细胞，可以维持淋巴细胞功能，并且可以有效地诱导淋巴细胞。例如，通过本发明获得的淋巴细胞适用于再生医学。因此，预计本发明的方法对医学领域做出巨大贡献。
附图简述
图1是显示纤连蛋白的结构域结构的示意图。
图2显示了通过本发明的方法获得的淋巴细胞中的幼稚细胞比率的实例。在该图中，“-”指示阴性对照，其使用未用重组多肽包被的板进行培养。
用于实施本发明的方式
在下文中，将详细说明本发明。
<纤连蛋白>
衍生自人和哺乳动物的纤连蛋白已得到充分研究。下文描述了主要关于衍生自人的血浆纤连蛋白的发现。
纤连蛋白是存在于血液、细胞表面、细胞外基质等中的具有约250 kDa（单体）的分子量的巨大糖蛋白。纤连蛋白已知具有各种功能，例如细胞粘附。纤连蛋白由结构域结构组成（参见图1），并且其氨基酸序列含有三种相似的序列。三种相似的序列称为I型重复、II型重复和III型重复。其中，III型重复由87至96个氨基酸残基组成，并且所述重复之间的氨基酸序列同源性为17至40%。纤连蛋白中存在15个III型重复。其中，第1个、第2个和第3个重复（下文分别称为III-1、III-2和III-3）包含在自缔合结构域中，第4个、第5个和第6个重复（下文分别称为III-4、III-5和III-6）包含在DNA结合结构域，第8个、第9个和第10个重复（下文分别称为III-8、III-9和III-10）包含在细胞结合结构域中，并且第12个、第13个和第14个重复（下文分别称为III-12、III-13和III-14）包含在肝素结合结构域中。III-10含有与整联蛋白α5β1（也称为VLA-5）具有结合活性的区域，并且核心序列为RGD。另外，在接近于纤连蛋白的C末端的位置处存在称为IIICS的区域。IIICS含有称为CS-1的由25个氨基酸组成的序列，并且该序列显示与整联蛋白α4β1（也称为VLA-4）的结合活性。
人纤连蛋白III-1至14和CS-1的氨基酸序列分别在本说明书的序列表中显示为SEQ ID NO：1至14和15。
1. 本发明的淋巴细胞的生产方法
本发明的淋巴细胞的生产方法的特征在于包括在作为重组纤连蛋白片段的多肽的存在下培养淋巴细胞的步骤。
取决于标记物分子的表达和/或功能中的差异，将淋巴细胞分类成各种类型。淋巴细胞的三个主要类型是T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK细胞）。
外周中存在的大多数成熟的T细胞表达CD4或CD8作为细胞表面标记物分子。表达CD4的T细胞充当辅助性T细胞，其诱导其它T细胞的功能性表达，或者诱导B细胞的分化和成熟以及抗体产生。另一方面，CD8阳性T细胞充当细胞毒性T细胞，其破坏病毒感染的细胞等等。另外，存在具有NK细胞和T细胞两者的特性的NKT细胞，以及表达CD25分子并压制其它T细胞的活性的调节性T细胞（也称为Treg）。近年来，已经知道存在无需经过胸腺而分化且成熟的外周T细胞。
在B细胞中，通过每个细胞产生的抗体类型是固定的。仅当出现适合于B细胞的抗体类型的病原体时，每个B细胞才活化并起始抗体产生。
另外，NK细胞是一类细胞毒性淋巴细胞，其充当先天免疫的主要因子，并且对于排斥肿瘤细胞和病毒感染的细胞是特别重要的。
本发明中使用的淋巴细胞可以是如上所述的任何淋巴细胞。在本发明的一个优选实施方案中，淋巴细胞优选为T细胞，更优选为表达CD4的淋巴细胞，且甚至更优选为辅助性T细胞。
本发明的方法不仅适用于纯化的淋巴细胞，还适用于多种类型的淋巴细胞的混合物、含有淋巴细胞和其它细胞的细胞群体等等。例如，如下文实施例中所述，可以通过将本发明的方法应用于衍生自外周血的单核细胞群体来产生淋巴细胞。
本发明中使用的淋巴细胞的来源并无特别限制，并且可以使用衍生自任何生物，优选哺乳动物的淋巴细胞。生物的年龄和性别并无特别限制。在一个实施方案中，使用衍生自灵长类动物（例如，黑猩猩、日本猴和人）的细胞。最优选地，使用衍生自人的细胞，但本发明并不限于此。
在通过本发明的方法生产淋巴细胞用于施用于人的目的的情况下，优选地，使从具有与受体的类型相同或相似的组织相容性抗原类型的供体收集的细胞经受淋巴细胞的产生。例如，使从受体自身收集的人外周血单核细胞（PBMC）经受淋巴细胞的产生。
本发明的淋巴细胞的生产方法的特征在于包括在下述重组多肽的存在下培养淋巴细胞的步骤（下文有时称为本发明的培养步骤）。
在本发明的淋巴细胞的生产方法中，在多肽（a）、多肽（b）和多肽（c）的存在下培养淋巴细胞。在本发明的淋巴细胞的生产方法中，可以在两种多肽（其为包含在同一分子中的多肽（a）和多肽（b）的多肽以及多肽（c））的混合物的存在下，在两种多肽（其为包含在同一分子中的多肽（b）和多肽（c）的多肽以及多肽（a））的混合物的存在下，在两种多肽（其为包含在同一分子中的多肽（a）和多肽（c）的多肽以及多肽（b））的混合物的存在下，在两种多肽（其为包含在同一分子中的多肽（a）和多肽（b）的多肽、以及包含在同一分子中的多肽（b）和多肽（c）的多肽）的混合物的存在下，或者在一种多肽（其包含在同一分子中的多肽（a）、多肽（b）和多肽（c））的存在下，培养淋巴细胞。然而，包含在同一分子中的多肽（a）、多肽（b）和多肽（c）的上述一种多肽不同于全长纤连蛋白。
多肽（a）是包含人纤连蛋白III-1至3重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-1至3重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽。即，多肽（a）是包含III-1、III-2和III-3重复的全部的多肽。
多肽（b）是包含人纤连蛋白III-8至10重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-8至10重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽。即，多肽（b）是包含III-8、III-9和III-10的全部的多肽。
多肽（c）是包含人纤连蛋白III-12至14重复的重组多肽，或者包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加而不同于III-12至14重复的氨基酸序列的氨基酸序列的重组多肽。即，多肽（c）是包含III-12、III-13和III-14的全部的多肽。
包含在同一分子中的多肽（a）和多肽（b）的多肽的实例包括120 kDa的纤连蛋白片段（120k-fr）。120k-fr是分子量约120 kDa的多肽，其按顺序从N末端侧包含III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-8、III-9和III-10。120k-fr的预测的氨基酸序列（932个氨基酸残基）在本说明书的序列表中显示为SEQ ID NO：16。通过制备编码120k-fr的氨基酸序列的DNA，并且将其与适当的宿主-载体***组合，120k-fr可以作为重组多肽生产。也可以使用商购可得的120k-fr。
包含在同一分子中的多肽（b）和多肽（c）的多肽的实例包括CH-271和CH-296。
CH-271是分子量约60 kDa（549个氨基酸残基）的重组多肽，其按顺序从N末端侧包含III-8、III-9、III-10、III-12、III-13和III-14。CH-271的氨基酸序列在本说明书的序列表中显示为SEQ ID NO：17。
CH-296是分子量约63 kDa（574个氨基酸残基）的重组多肽，其按顺序从N末端侧包含III-8、III-9、III-10、III-12、III-13、III-14和CS-1。CH-296的氨基酸序列在本说明书的序列表中显示为SEQ ID NO：18。CH-296作为RetroNectin（注册商标，由TAKARA BIO INC.制造）商购可得。
例如，可以通过使用与CH-271或CH-296组合的120k-fr，来进行本发明的淋巴细胞的生产方法。
包含在同一分子中的多肽（a）、多肽（b）和多肽（c）的多肽也可以用于本发明的淋巴细胞的生产方法。包含在同一分子中的多肽（a）、多肽（b）和多肽（c）的多肽的实例包括但不限于如下所述的FCH-296。
FCH-296是分子量约96 kDa（881个氨基酸残基）的重组多肽，其按顺序从N末端侧包含III-1、III-2、III-3、III-8、III-9、III-10、III-12、III-13、III-14和CS-1。FCH-296的氨基酸序列在本说明书的序列表中显示为SEQ ID NO：19。SEQ ID NO：19的氨基酸1至298对应于多肽（a），SEQ ID NO：19的氨基酸299至307对应于GS接头，SEQ ID NO：19的氨基酸308至585对应于多肽（b），并且SEQ ID NO：19的氨基酸586至856对应于多肽（c），并且SEQ IDNO：19的氨基酸857至881对应于CS-1。同时，SEQ ID NO：19的氨基酸94至111形成除III型重复外的区域，所述区域存在于III-1和III-2之间。
用于本发明中的多肽（a）至（c）各自可以包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加，而不同于III-1至3重复的氨基酸序列、III-8至10重复的氨基酸序列、或III-12至14重复的氨基酸序列的氨基酸序列，只要该多肽是功能上等价的，或者保留了使淋巴细胞增殖的功能、维持淋巴细胞的功能的功能、或诱导淋巴细胞的功能。如本文使用的，“一个或几个”在1至15的范围内，优选在1至10的范围内，更优选在1至5的范围内，且特别优选在1至3的范围内，但并无特别限制。例如，该多肽包括但不特别限于包含代替III-1（SEQ ID NO：1）的以下氨基酸序列的多肽：具有III-1的N末端9个氨基酸的缺失的氨基酸序列（SEQ ID NO：21），具有III-1的N末端6个氨基酸的缺失的氨基酸序列（SEQ ID NO：22），具有III-1的N末端5个氨基酸的缺失的氨基酸序列（SEQ ID NO：23），或具有III-1的N末端3个氨基酸的缺失的氨基酸序列（SEQ ID NO：24）。进一步地，包含多肽（a）至（c）的多肽的实例包括这样的多肽，其包含通过一个或几个氨基酸的取代、缺失、***或添加，而不同于FCH-296的氨基酸序列（SEQ ID NO：19）的氨基酸序列。其更具体的实例包括但不限于具有N末端9个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：25），具有N末端6个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQID NO：26），具有N末端5个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：27），具有N末端3个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：28），具有N末端3个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：29），具有N末端6个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：30），具有N末端9个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：31），具有N末端11个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：32），具有N末端12个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：33），具有N末端14个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：34），具有N末端15个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：35），具有N末端HKRHEEGH的***的FCH-296（SEQ ID NO：36），具有N末端HKRH的***的FCH-296（SEQ ID NO：37），具有N末端HH的***的FCH-296（SEQ ID NO：38），具有N末端HHH的***的FCH-296（SEQID NO：39），以及具有N末端His标签的FCH-296（SEQ ID NO：20）。如本文使用的，表述“具有N末端（数目）个氨基酸的***的FCH-296”，意指从编码FCH-296的氨基酸序列的核酸转录且翻译成的多肽，由编码所述数目的氨基酸的核苷酸序列组成的核酸紧在起始密码子后***所述核酸中。具有N末端氨基酸的***的FCH-296还包括这样的多肽，由起始密码子编码的甲硫氨酸通过翻译后修饰从其中去除。例如，“具有N末端3个氨基酸的***的FCH-296”包括从编码FCH-296的氨基酸序列的核酸转录且翻译成的多肽，由编码三个氨基酸的核苷酸序列组成的核酸紧在起始密码子后***所述核酸中，以及由起始密码子编码的甲硫氨酸通过翻译后修饰从其中去除的多肽。类似地，如本文使用的，表述“具有N末端（数目）个氨基酸的缺失的FCH-296”，意指从编码FCH-296的氨基酸序列的核酸转录且翻译成的多肽，由紧在起始密码子之后的编码所述数目的氨基酸的核苷酸序列组成的核酸从其中缺失。具有N末端氨基酸的缺失的FCH-296还包括这样的多肽，由起始密码子编码的甲硫氨酸通过翻译后修饰从其中去除。例如，“具有N末端3个氨基酸的缺失的FCH-296”包括从编码FCH-296的氨基酸序列的核酸转录且翻译成的多肽，由紧在起始密码子之后的编码三个氨基酸的核苷酸序列组成的核酸从其中缺失，以及由起始密码子编码的甲硫氨酸通过翻译后修饰从其中去除的多肽。类似地，如本文使用的，“具有N末端His标签的FCH-296”包括从编码FCH-296的氨基酸序列的核酸转录且翻译成的多肽，由编码His标签的核苷酸序列组成的核酸紧在起始密码子后***其中，以及由起始密码子编码的甲硫氨酸通过翻译后修饰从其中去除的多肽。
用于本发明中的多肽（a）至（c）各自可以包含与III-1至3重复的氨基酸序列、III-8至10重复的氨基酸序列、或III-12至14重复的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列，只要该多肽是功能上等价的，或者保留了使淋巴细胞增殖的功能、维持淋巴细胞的功能的功能、或诱导淋巴细胞的功能。其实例包括但不特别限于具有与III-1至3重复的氨基酸序列、III-8至10重复的氨基酸序列、或III-12至14重复的氨基酸序列具有80%或更高，优选90%或更高，且特别优选95%或更高同一性的氨基酸序列的多肽。
氨基酸的取代、缺失、***或添加（下文有时称为“氨基酸取代等”）可以优选地进行至这样的程度，即在可以维持原始多肽的功能的范围内，可以改变多肽的物理化学性质等。例如，氨基酸取代等优选在基本上不改变原始多肽的特性（例如疏水性、亲水性、电荷、pK等等）的范围内是保守的。例如，氨基酸取代是在以下各组内的取代：1. 甘氨酸和丙氨酸；2. 缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；3. 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；4. 丝氨酸和苏氨酸；5. 赖氨酸和精氨酸；以及6. 苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸缺失、添加或***优选在基本上不改变多肽的靶位点周围的特性的范围内，具有与所述靶位点周围的特性相似的特性的氨基酸的缺失、添加或***。
氨基酸取代等可以是由于物种差异或个体差异而天然存在的，或者可以是人工引入的。人工引入可以通过已知的方法进行，所述方法并无特别限制。例如，可以通过已知方法将核苷酸的取代、缺失、添加或***引入编码多肽的核酸内，并且因此获得的核酸可以用于产生这样的多肽，其包含具有在多肽的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的取代等的氨基酸序列。
如本文使用的，术语“功能上等价的”或“等价功能”意指与氨基酸取代等未引入其内的相应多肽是功能上等价的或是等价功能的。即，它意指当使用待比较的多肽进行以后描述的淋巴细胞产生时，获得与使用氨基酸取代等未引入其内的相应多肽时相同的淋巴细胞的细胞增殖率，或者维持与使用氨基酸取代等未引入其内的相应多肽时相同的淋巴细胞功能，或者获得与使用氨基酸取代等未引入其内的相应多肽时相同的淋巴细胞的诱导率。即，可以根据以后描述的实施例中所述的方法，通过评估其特性来适当地确认多肽的功能。
本发明中使用的多肽可以含有除上述III型重复外的肽或氨基酸残基和/或除上述III型重复外的纤连蛋白中存在的区域，例如CS-1，只要该多肽未丧失其在培养淋巴细胞方面的效用。例如，可以将任何肽或氨基酸残基引入除上述III型重复外的区域内。在本发明中使用的此类多肽的实例包括含有氨基酸残基或肽作为***在重复之间的接头的多肽，以及可用于重组多肽的纯化的肽（标签）加入其中的多肽。接头的实例包括但不限于甘氨酸-丝氨酸接头（GS接头）。标签的实例包括但不限于聚组氨酸标签（His标签）、Flag标签和谷胱甘肽S-转移酶标签（GST标签）。用于本发明中的多肽的实例包括但不限于具有在N末端处的His标签的FCH-296多肽（SEQ ID NO：20）。
在本发明的培养步骤中，以高细胞增殖率培养淋巴细胞。本发明的淋巴细胞的生产方法是非常有用的，因为与使用作为已知的纤连蛋白片段的CH-296的方法相比，它具有更高的细胞增殖率。
对于多肽的制备，关于纤连蛋白的信息在以下中可见：Kimiduka F.等人，J.Biochem.，第110卷，第284-291页（1991），Kornbrihtt A. R.等人，EMBO J.，第4卷，第7期，1755-1759（1985），Sekiguchi K.等人，Biochemistry，第25卷，第17期，4936-4941（1986）等等。另外，在Genbank登录号NM_002026和NP_002017中公开了编码纤连蛋白的核苷酸序列和纤连蛋白的氨基酸序列。
通过重组DNA技术生产在本发明中使用的多肽。从重组体生产或处理的观点来看，本发明中使用的多肽的分子量优选为150 kDa或更少、140 kDa或更少、130 kDa或更少、120kDa或更少、110 kDa或更少、或者100 kDa或更少。如本文使用的，多肽可以是化学修饰的，例如乙酰化的。
在本发明的合适方面，淋巴细胞的培养在其中用多肽包被的固相与淋巴细胞接触的状态下进行。固相的实例包括用于细胞培养的容器或载体（微珠等等）。用多肽包被的固相具有稳定地保留淋巴细胞的能力，并且可用于培养细胞。培养容器可以由任何材料制成，只要它不抑制细胞维持、存活、分化、成熟和自我更新，并且可以具有任何形状，只要它不抑制细胞维持、存活、分化、成熟和自我复制。培养容器的材料的实例包括玻璃、合成树脂(包括非织造织物)、天然树脂、金属等等。培养容器的形状的实例包括多棱柱例如三棱柱、立方体和长方体，圆柱体，多棱锥例如三棱锥和四棱锥，圆锥体，以及任何形状例如葫芦形、球形、半球形、圆形、椭圆形、半圆形等等。
用于培养淋巴细胞的细胞培养装置的实例包括但不限于：皿、板、瓶、袋、膜、载玻片、大型培养罐、生物反应器、中空纤维型培养装置等等。优选地，使用板，并且更优选地，使用细胞培养板。
袋的实例包括用于细胞培养的CO2透气袋。当在工业上生产大量淋巴细胞时，可以使用大型培养罐。培养可以在开放***或封闭***中进行。从获得的淋巴细胞的安全性的观点来看，优选在封闭***中进行培养。
固相的包被，即，将多肽固定到固相表面上可以通过已知方法进行。例如，可以通过与WO 97/18318和WO 00/09168中所述的纤连蛋白片段固定相同的方法进行包被。在其中多肽固定到固相上的情况下，在通过本发明的方法获得淋巴细胞后，仅仅通过分开细胞和固相，容易地分开细胞和本发明的多肽。相应地，可以预防淋巴细胞被多肽等污染。
更具体地，通过将多肽溶解于无菌蒸馏水、缓冲液、生理盐水等等中，来制备包被溶液，并且该包被溶液可以用于固定。优选地，可以使用利用磷酸盐缓冲盐水（PBS），特别优选地Dulbecco's PBS（D-PBS）作为溶剂获得的包被溶液。
包被溶液中多肽的摩尔浓度并无特别限制，但其实例包括1至10,000 nM，优选10至2000 nM，并且更优选30至1000 nM。当FCH-296用作多肽时，上述摩尔浓度表示为0.1至1000 μg/mL，优选1至200 μg/mL，并且更优选3至100 μg/mL的重量浓度。
在本发明的合适实施方案中，包被溶液进一步含有抗CD3抗体。在该实施方案中使用的包被溶液中包含的抗CD3抗体的浓度为例如0.5至100 μg/mL，优选1至20 μg/mL，或更优选2至10 μg/mL的最终浓度。包被溶液可以进一步含有其它成分等等，只要不损害本发明的效果。
可以通过将包被溶液加入培养容器中，并且将其保持适当的时间段来进行包被。可以适当地确定用于保持包被溶液的条件，但条件的实例包括在室温下1小时的条件和在4℃下过夜的条件。
用纤连蛋白片段包被的容器可以照原样使用，或者可以贮存于低温下，例如在0至10℃的温度下直至使用。紧在使用前，从培养容器中去除包被溶液，并且用例如D-PBS洗涤培养容器两次，然后根据需要用细胞培养基洗涤一次，然后使培养容器经受细胞培养。
本发明的淋巴细胞的生产方法通过在用于淋巴细胞产生的整个培养期间或培养期间的任何部分中，在所述多肽的存在下进行培养步骤来执行。即，本发明包括任何方法，所述方法包括本发明的培养步骤作为淋巴细胞生产过程的一部分。例如，本发明中包括这样的方法，所述方法包括使用不包含淋巴细胞的细胞群体来开始淋巴细胞生产过程，在淋巴细胞生产过程开始后诱导淋巴细胞，并且在所述多肽的存在下培养淋巴细胞。
本发明的培养步骤包括淋巴细胞的诱导，淋巴细胞的维持和/或淋巴细胞的扩增培养。因此，例如，本发明提供了生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，诱导、维持和扩增培养淋巴细胞；生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，诱导和维持淋巴细胞；生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，维持和扩增培养淋巴细胞；生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，诱导淋巴细胞；生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，维持淋巴细胞；以及生产淋巴细胞的方法，其包括在上述重组多肽（a）、（b）和（c）的存在下，扩增培养淋巴细胞。在本发明的淋巴细胞的生产方法中，可以通过适当地调整待经受该方法的淋巴细胞的类型、培养条件等以培养淋巴细胞，来生产可用于再生医学等的淋巴细胞。如本文使用的，淋巴细胞意指含有淋巴细胞的细胞群体。
为了诱导淋巴细胞的目的，在本发明的培养步骤中，在培养开始时使用的细胞类型和用于诱导淋巴细胞的方法并无特别限制。在培养开始时的细胞可以是多能干细胞例如iPS细胞或ES细胞、进一步分化的细胞例如造血干细胞、淋巴细胞的前体细胞或幼稚细胞。用于诱导淋巴细胞的方法可以是已知方法，其并无特别限制。
为了维持且扩增培养淋巴细胞的目的，在本发明的培养步骤中在培养开始时的细胞浓度并无特别限制，但它为例如0.005至20 x 105个细胞/mL，优选0.02至5 x 105个细胞/mL，或更优选0.05至2 x 105个细胞/mL。
用于培养淋巴细胞的各种培养基可以用于本发明的培养步骤中。优选实例包括不含异源组分的培养基，所述异种组分例如胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）或胎牛血清（fetal calf serum, FCS）或绵羊血清、无血清培养基、不含未知组分的培养基（成分确定的培养基）等等。可以适当地制备不含异源组分的此类无异种培养基，但已知培养基或商购可得的培养基可以照原样使用或进行修改。例如，GT-T551培养基（由TAKARA BIO INC.制造）可以用作商购可得的无异种培养基。
在本发明的合适实施方案中，培养基进一步含有白介素2（IL-2）。在该实施方案中使用的IL-2的浓度为例如10至1000 IU/mL，优选50至500 IU/mL，或更优选100至300 IU/mL的最终浓度。培养基可以进一步含有其它组分，只要不损害本发明的效果。
用于细胞的培养条件并无特别限制，并且可以采用普通的细胞培养条件。培养条件的实例包括但不限于在37℃的温度，95%的湿度和5%的CO2浓度下的培养条件。其实例包括在30至40℃的温度，90至98%的湿度和3至7%的CO2浓度下的培养条件。然而，可以采用上述范围之外的温度、湿度和CO2浓度，只要可以实现所需的淋巴细胞增殖。在培养过程中，优选以适当的时间间隔，用新鲜培养基稀释细胞培养基，用新鲜培养基替换所述培养基，或者需要时，用新鲜的培养容器替换培养容器。可以适当地确定使用的培养基以及同时使用的其它组分等等。
在本发明的合适方面，为了维持且扩增培养淋巴细胞的目的，淋巴细胞在用本发明中使用的多肽包被的容器中的适当培养基中进行培养。例如，将它们培养5天或更长时间，优选10天或更长时间，同时执行培养基替换和传代。通过这种培养，可以使淋巴细胞增殖。
通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞可以基于标记物分子的表达进行分类。标记物分子的表达可以例如通过使用识别标记物分子的抗体来确定。
关于淋巴细胞的标记物分子的实例包括但不限于CD3、CD4和CD8。CD3是在成熟的T淋巴细胞上表达的糖蛋白，并且是细胞表面抗原之一。CD4在辅助性T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等等上表达。一般地，CD3阳性和CD4阳性细胞（CD3+ CD4+）是辅助性T细胞。另一方面，CD8在细胞毒性T细胞和一些NK细胞上表达。一般地，CD3阳性和CD8阳性细胞（CD3+ CD8+）是细胞毒性T细胞。
通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞高度表达CD4。例如，20%或更多、25%或更多、30%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或者95%或更多的通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞表达CD4。与在不存在多肽（a）至（c）的情况下的培养（阴性对照）相比，通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞具有高比例的CD4表达细胞。在通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞中的CD4表达细胞的比例，是在不存在多肽（a）至（c）时培养（阴性对照）的情况下的CD4表达细胞比例的例如1.3或更多倍、1.5或更多倍、1.7或更多倍、2或更多倍、2.3或更多倍、2.5或更多倍、2.7或更多倍、或者3或更多倍。
关于淋巴细胞的标记物分子的其它实例包括CD45RA和CCR7。一般地，CD45RA阳性和CCR7阳性（CD45RA+ CCR7+）表型称为幼稚细胞表型，CD45RA阴性和CCR7阳性（CD45RA-CCR7+）表型称为中央记忆细胞表型，而CD45RA阴性和CCR7阴性（CD45RA- CCR7-）表型称为效应记忆细胞表型。
通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞具有高比例的CD45RA阳性和CCR7阳性（CD45RA+ CCR7+）细胞，即幼稚细胞。例如，25%或更多、30%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或者95%或更多的通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞表达CD45RA和CCR7。与在不存在多肽（a）至（c）的情况下的培养（阴性对照）相比，通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞具有高比例的CD45RA和CCR7表达细胞。在通过本发明的生产方法获得的淋巴细胞中的CD45RA和CCR7表达细胞的比例，是在不存在多肽（a）至（c）时培养（阴性对照）的情况下的CD45RA和CCR7表达细胞比例的例如1.3或更多倍、1.5或更多倍、1.7或更多倍、2或更多倍、2.3或更多倍、2.5或更多倍、2.7或更多倍、或者3或更多倍。
进一步地，可以从通过本发明的生产方法获得的细胞群体中分离所需的淋巴细胞，并且从而可以获得与其它细胞分开的淋巴细胞。识别所需淋巴细胞特有的分子的抗体可用于分离且纯化根据本发明获得的淋巴细胞。因此分离的淋巴细胞可以通过已知方法建立为细胞系。即，作为本发明的一个方面，提供了生产淋巴细胞的方法，其包括用于生产含有本发明的淋巴细胞的细胞群体的过程步骤；以及从所获得的细胞群体中分离淋巴细胞的步骤。
通过本发明获得的淋巴细胞还可以用于例如关于淋巴细胞的研究、对于各种疾病的药物筛选、药物候选化合物的功效和安全性的评估等等。根据本发明，因为可以通过单次操作获得许多淋巴细胞，所以与常规方法不同，能够获得可再现的研究结果，而不受细胞批次之间的差异影响。
本发明提供了用于医学的淋巴细胞，以及用于药物组合物制造的淋巴细胞。淋巴细胞是通过本发明生产的细胞群体。含有淋巴细胞的药物组合物适用于免疫疗法中。例如，作为活性成分的通过本发明生产的淋巴细胞，可以通过任选地将其与其它成分（适合于肠胃外施用的已知有机或无机载体、活化剂、稳定剂等）混合，而配制成输注剂或注射剂。可以根据已知的免疫疗法适当地确定治疗剂中本发明的细胞群体的含量、治疗剂的剂量、以及关于治疗剂的使用的各种条件。此外，用治疗剂的免疫疗法可以与包括已知药物的施用的药物疗法、放射疗法或外科手术组合使用。
细胞群体的施用对于其有效的疾病的实例包括但不限于癌症、白血病、恶性肿瘤、肝炎和传染病（例如流感、结核、人免疫缺陷病毒感染、AIDS、MRSA感染、VRE感染和深部真菌病）。细胞群体的施用可特别用于治疗由HIV感染CD4阳性T细胞引起的HIV感染和AIDS（获得性免疫缺陷综合症）。进一步地，通过本发明的方法生产的淋巴细胞可以与以下组合使用：在骨髓移植、照射等后的免疫缺陷状态下的传染病预防，或者为了缓解复发性白血病的目的的常规疗法如供体淋巴细胞输注，抗癌药物治疗，放射疗法，抗体疗法，高温疗法或其它免疫疗法。进一步地，还能够将所需的外源基因引入淋巴细胞内，并且从而产生可用于治疗或预防各种疾病的淋巴细胞，其由于外源基因的表达而显示出效应。
实施例
通过下述实施例更具体地描述本发明，本发明的范围并不限于此。
实施例1：FCH-296的制备
通过下述程序制备具有在N末端处的His标签的FCH-296多肽，所述His标签由甲硫氨酸残基和6个组氨酸残基组成。
人工合成编码所述多肽的DNA，并且掺入表达质粒内。用该质粒转化大肠杆菌，并且在允许多肽表达的条件下培养所得到的转化体。用超声破碎机（由KUBOTA Corporation制造）破碎从培养物中收集的微生物细胞，以获得无细胞提取物。使用该提取物作为原材料，通过Ni-Chelating Sepharose（由GE Healthcare制造）、羟磷灰石（40 μm，由Bio-RadLaboratories，Inc.制造）以及SP-Sepharose（由GE Healthcare制造）的一系列柱色谱，来纯化FCH-296。通过SDS-PAGE/CBB染色进行在纯化过程中的FCH-296确认。所获得的样品的缓冲液替换为缓冲液[0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4]，以获得6 mL的FCH-296样品。
FCH-296样品用SDS-PAGE/CBB染色显示单一条带。如通过使用BCA蛋白质定量试剂盒（由Pierce制造）测量的，FCH-296样品的蛋白质浓度为1.21 mg/mL（由分子量计算为12.4μM）。
实施例2：用抗人CD3抗体和FCH-296包被
在以后描述的实施例中使用的培养装置上，固定了抗人CD3抗体（OKT3，由TAKARABIO INC.制造）、以及实施例1中制备的具有His标签的FCH-296。固定通过以下进行：将0.4mL/孔的D-PBS（C-40232；由PromoCell GmbH制造）加入24孔细胞培养板（由Falcon制造），所述D-PBS含有最终浓度为5 μg/mL的抗人CD3抗体和最终浓度为25 μg/mL的具有His标签的FCH-296，然后允许该板在37℃下在5% CO2培养箱中静置5小时或更长时间。紧在使用前，从固定的板中去除溶液，并且用0.5 mL/孔的D-PBS将板洗涤两次。作为对照，以相同的方式制备用D-PBS包被的板，所述D-PBS含有最终浓度为25 μg/mL的CH-296（RetroNectin：由TAKARA BIO INC.制造）和最终浓度为5 μg/mL的抗人CD3抗体。作为阴性对照，使用未包被的板。
实施例3：淋巴细胞（TC0033）的培养
（1）细胞群体的扩增培养
根据常规方法从获得知情同意书的人健康供体（TC0033）制备人外周血单核细胞（PBMC），然后以1 x 105个细胞/mL悬浮于GT-T551培养基（由TAKARA BIO INC.制造；下文称为GT-T551CM）中，所述GT-T551培养基含有最终浓度为200 IU/mL的IL-2（Proleukin，由Nipro制造）。细胞以2.8 x 105个细胞/孔接种到板上（N = 2），并且在37℃和5% CO2下进行培养（第0天）。
细胞在第4天和第7天时进行传代培养。在第4天时，在未包被的12孔细胞培养板（由Corning制造）中混合2.612 mL/孔的GT-T551CM和0.358 mL/孔的细胞悬浮液，并且继续培养。在第7天时，在未包被的12孔细胞培养板中混合1.485 mL/孔的GT-T551CM和1.485mL/孔的细胞悬浮液，并且继续培养。在第4天和第7天（其为细胞传代培养日）时，以及在第10天（其为终止培养日）时，通过台盼蓝染色计数每个测试组中的细胞数目。表1显示了相对于在第0天时的细胞数目，在第4天、第7天和第10天时的细胞数目。
[表1]
与阴性对照和用CH-296包被的板相比，在用FCH-296包被的板上发现了高细胞增殖率。
（2）细胞表面标记物的分析
用含有0.1%牛血清白蛋白（由SIGMA制造）的PBS（下文称为0.1% BSA/PBS）洗涤实施例3-（1）中获得的在第10天时的细胞群体。将细胞群体悬浮于0.1% BSA/PBS中，并且与FITC标记的小鼠抗人CD8抗体、RD-1标记的小鼠抗人CD4抗体和PC-5标记的小鼠抗人CD3抗体的抗体混合物（由Beckman Coulter，Inc.制造）反应。然后，细胞群体用0.1% BSA/PBS洗涤两次，并且再次悬浮于0.1% BSA/PBS中。使因此获得的细胞群体经受流式细胞术（FC-500，由Beckman Coulter，Inc.制造），并且计算每个细胞群体中的CD3阳性和CD4阳性细胞（CD3+ CD4+）比例。细胞表面标记物测量的结果显示于表2中。在所有测试组中，所有细胞中的CD3阳性细胞比例都是94%或更多。
[表2]
与阴性对照和用CH-296包被的板相比，在用FCH-296包被的板上发现高比例的CD3+CD4+。一般地，CD3+CD4+代表辅助性T细胞。根据表1和表2的结果，显示了辅助性T细胞在用FCH-296包被的板上有效地增殖。
实施例4：来自多个供体（TC0033和TC0071）的淋巴细胞的培养
（1）细胞群体的扩增培养
由与实施例3相同的人健康供体（TC0033）和不同的人健康供体（TC0071）制备PBMC，然后以与实施例3-（1）相同的方式进行培养。表3显示了相对于在第0天时的细胞数目，在第4天、第7天和第10天时的细胞数目。
[表3]
在供体TC0033和TC0071的两种情况下，在用FCH-296包被的板上均发现了高细胞增殖率。
（2）细胞表面标记物的分析
以与实施例3-（2）相同的方式测量实施例4-（1）中获得的在第10天时的细胞群体的细胞表面标记物。结果显示于表4中。在所有测试组中，所有细胞中的CD3阳性细胞比例都是94%或更多。
[表4]
在供体TC0033和TC0071的两种情况下，在用FCH-296包被的板上均发现了高比例的CD3+CD4+。一般地，CD3+CD4+代表辅助性T细胞。根据表3和表4的结果，显示了不管供体如何，辅助性T细胞在用FCH-296包被的板上有效地增殖。
实施例5：CD45RA阳性和CCR7阳性细胞（幼稚细胞）比例的测量
（1）细胞群体的扩增培养
从人健康供体（TC0033和TC0071）制备的PBMC以1 x 105个细胞/mL悬浮于含有最终浓度为200 IU/mL的IL-2的GT-T551CM中。细胞以2.8 x 105个细胞/孔接种到板上（N =2），然后在37℃和5% CO2下进行培养（第0天）。对于从第0天到第4天的培养，使用由抗人CD3抗体、以及FCH-296多肽（具有His标签，SEQ ID NO：20）或具有在N末端处的9个氨基酸***的FCH-296多肽（SEQ ID NO：31）包被的板。细胞在第4天和第7天时进行传代培养。在第4天时，在未包被的12孔细胞培养板中混合2.612 mL/孔的GT-T551CM和0.358 mL/孔的细胞悬浮液，并且继续培养。在第7天时，在未包被的12孔细胞培养板中混合1.485 mL/孔的GT-T551CM和1.485 mL/孔的细胞悬浮液，并且继续培养。作为阴性对照，从培养的第0天开始，使用未包被的板。使用普通柱如SP Sepharose（注册商标）Fast Flow（由GE Healthcare制造），通过常规方法制备具有在N末端处的9个氨基酸***的FCH-296多肽。
（2）细胞表面标记物的分析
以与实施例3-（2）相同的方式测量在第10天时的细胞群体的细胞表面标记物。结果显示于表5中。在所有测试组中，所有细胞中的CD3阳性细胞比例都是94%或更多。
[表5]
在供体TC0033和TC0071的两种情况下，在用FCH-296多肽或具有在N末端处的9个氨基酸***的FCH-296多肽（表5中的“FCH-296的N末端9 a.a.***”）包被的板上均发现了高比例的CD3+CD4+。
（3）幼稚细胞比例的分析
用含有0.1%牛血清白蛋白（由SIGMA制造）的PBS（下文称为0.1% BSA/PBS）洗涤实施例5-（1）中获得的在第10天时的细胞群体。将细胞群体悬浮于0.1% BSA/PBS中，并且与RD-1标记的IgG1小鼠抗人2H4（CD45RA）抗体（由Beckman Coulter，Inc.制造）、以及FITC标记的IgG2A小鼠抗人CCR7抗体（由R & D制造）反应。然后，细胞群体用0.1% BSA/PBS洗涤两次，并且再次悬浮于0.1% BSA/PBS中。使因此获得的细胞群体经受流式细胞术，并且计算每个细胞群体中的幼稚细胞（CD45RA+ CCR7+）比例。测量结果显示于图2中。
在供体TC0033和TC0071的两种情况下，在用FCH-296或“FCH-296的N末端9 a.a.***”包被的板上均发现了高比例的幼稚细胞（CD45RA+ CCR7+）。
实施例6：具有各种N末端序列的FCH-296的评估
制备了具有各种N末端序列的各种FCH-296。即，制备了具有N末端9个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：25）、具有N末端6个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：26）、具有N末端5个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：27）、具有N末端3个氨基酸的缺失的FCH-296（SEQ ID NO：28），FCH-296（SEQ ID NO: 19）、具有N末端3个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：29）、具有N末端6个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：30）、具有N末端11个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：32）、具有N末端12个氨基酸的***的FCH-296（SEQ IDNO：33）、具有N末端14个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：34）、具有N末端15个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：35）、具有N末端HKRHEEGH的***的FCH-296（SEQ ID NO：36）、具有N末端HKRH的***的FCH-296（SEQ ID NO：37）、具有N末端HH的***的FCH-296（SEQ IDNO：38）以及具有N末端HHH的***的FCH-296（SEQ ID NO：39）。
使用上文描述的具有各种N末端序列的FCH-296代替FCH-296（具有His标签，SEQID NO：20）和具有N末端9个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO: 31），进行实施例2至5中所述的实验。具有各种N末端序列的FCH-296具有与FCH-296（具有His-tag，SEQ ID NO：20）和具有N末端9个氨基酸的***的FCH-296（SEQ ID NO：31）相同的效应。
工业适用性
根据本发明，提供了在短时间段内生产大量淋巴细胞的方法。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1；命名为III-1的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：2；命名为III-2的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：3；命名为III-3的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：4；命名为III-4的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：5；命名为III-5的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：6；命名为III-6的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：7；命名为III-7的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：8；命名为III-8的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：9；命名为III-9的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：10；命名为III-10的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：11；命名为III-11的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：12；命名为III-12的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：13；命名为III-13的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：14；命名为III-14的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：15；命名为CS-1的纤连蛋白的部分区域
SEQ ID NO：16；命名为120k-fr的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：17；命名为CH-271的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：18；命名为CH-296（RetroNectin）的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：19；命名为FCH-296的纤连蛋白片段
SEQ ID NO：20；His标签FCH-296
SEQ ID NO：21；III-1的N末端9a.a.缺失
SEQ ID NO：22；III-1的N末端6a.a.缺失
SEQ ID NO：23；III-1的N末端5a.a.缺失
SEQ ID NO：24；III-1的N末端3a.a.缺失
SEQ ID NO：25；FCH-296的N末端9a.a.缺失
SEQ ID NO：26；FCH-296的N末端6a.a.缺失
SEQ ID NO：27；FCH-296的N末端5a.a.缺失
SEQ ID NO：28；FCH-296的N末端3a.a.缺失
SEQ ID NO：29；FCH-296的N末端3a.a.***
SEQ ID NO：30；FCH-296的N末端6a.a.***
SEQ ID NO：31；FCH-296的N末端9a.a.***
SEQ ID NO：32；FCH-296的N末端11a.a.***
SEQ ID NO：33；FCH-296的N末端12a.a.***
SEQ ID NO：34；FCH-296的N末端14a.a.***
SEQ ID NO：35；FCH-296的N末端15a.a.***
SEQ ID NO：36；FCH-296的N末端HKRHEEGH***
SEQ ID NO：37；FCH-296的N末端HKRH***
SEQ ID NO：38；FCH-296的N末端HH***
SEQ ID NO：39；FCH-296的N末端HHH***
Claims (4)
1.一种生产淋巴细胞的方法，该方法包括在由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：31所示的氨基酸序列组成的重组多肽和抗CD3抗体的存在下培养淋巴细胞的步骤，其中所述步骤在用所述重组多肽包被的固相与淋巴细胞接触的状态下执行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述固相是细胞培养装置或细胞培养载体。
3.根据权利要求1的方法，其中所述固相是皿、板、瓶、袋、珠、膜或载玻片。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述淋巴细胞是人衍生的淋巴细胞。
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