CN102586185A - 一种k562细胞扩增激活nk细胞的方法 - Google Patents

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徐以兵
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Abstract

本发明属于免疫学领域，具体是指使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞(NK)的方法。本发明是以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；然后培养K562细胞一段时间，最后经物理、化学方式得到纯化的K562细胞，再对NK细胞进行培养。本发明扩增激活的NK细胞可以提高病人的免疫力，抵抗病毒和细菌；而且效率高。本发明在医学上具有广泛用途。

Description

一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体是指使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞(NK)的方法。
技术背景
NK细胞治疗对肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等肿瘤治疗有明显疗效。目前NK细胞治疗在美国主要用来和手术、化疗和放疗联合使用。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞非常困难。传统使用的高剂量白介素2激活生长倍数有限，端粒酶活性降低，扩增后的NK细胞杀伤功能低下。本公司之前的发明采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合物解决了这一问题。用该方法扩增的NK细胞纯度和活性显著增强，数量上可以达到临床治疗的需要。然而在肿瘤微环境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs(肿瘤相关巨噬细胞)和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅转染跨膜IL-21和CD137复合物的K562细胞激活扩增的NK细胞虽然对肿瘤细胞有很强的杀伤能力，对肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能力却很弱。本发明在转染跨膜IL-21和CD137K562细胞的基础上，转染了CD14、CD19和CD86。K562细胞上转染的CD14有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤相关巨噬细胞；转染CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤B细胞；转染CD86有助于提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和微环境中的B细胞的杀伤作用。
本发明提供体外扩增和激活NK的方法比用仅转染跨膜IL-21和CD137的K562细胞激活扩增NK细胞的方法，扩增的效率高2.4倍，扩增后的NK细胞对肿瘤相关巨噬细胞的杀伤能力提高了2.7倍。动物实验结果表明：与用仅转染跨膜IL-21和CD137的K562细胞激活扩增的NK细胞相比，采用本发明扩增的NK细胞显著提高了对小鼠体内肿瘤的杀伤能力。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提出一种更具有发展潜力的方法，实现NK细胞的扩增。
本发明是通过下述技术方案得以实现的：
一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；
(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即可以得到在细胞膜上的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽；
(3)经培养后的K562细胞膜上具有表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的细胞，通过强酸，强碱、和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞；或对K562细胞的依次用硫酸铵或乙醇沉淀，强酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素进行纯化收集；
(4)将上述离心收集的K562细胞与NK细胞、或NK细胞和外周血单核细胞的组合、或是NK细胞与淋巴细胞的组合、或是外周血单核细胞和其它淋巴细胞的组合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137与白细胞的组合进行共同培养、或在纯化分离K562细胞后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞，直至NK细胞代表总数的50％以上。
作为优选，上述方法的步骤(4)中的培养液为：Eagle′s培养液加入10％人血清或10％小牛血清，或RPMI 1640加入10％人血清或10％小牛血清，或F-10(Ham′s)Nutrient mixtures加入10％人血清或10％小牛血清。
作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在50pM～1nM；为了更好实现本发明，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在500pM～800pM。
作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137是经过纯化处理的蛋白质，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％。
作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137组成的淋巴细胞在K562细胞中的表达剂量比例是，K562细胞∶淋巴细胞＝1～10∶1。作为更佳选择，上述方法的淋巴细胞中加入跨膜白介素21-CD137复合物，且K562细胞∶淋巴细胞＝1∶1、2∶1、3∶1、或4∶1。
作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137扩增的NK细胞过程是通过溶于生理盐水溶液的方法进行。
本发明中跨膜IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137转染的K562细胞对外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞扩增和激活有重要的作用。扩增和激活后产生的NK细胞有重要的医疗作用。本发明利用的方法可以得到的足够数量和功能的NK细胞，是理想的识别和摧毁肿瘤微环境中的肿瘤细胞、CD14+单核细胞和CD19+B细胞，增强病人免疫反应的方法。肿瘤的类型参考前专利(专利申请号：CN201110075736)。NK细胞还可以识别和杀伤病原体感染的细胞，其中包括但不限于：乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒。
本发明中的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137、CD8α和白介素2是该蛋白质的全部多肽，其中也包括这些蛋白质中具备功能的多肽成分。本发明中的外周血单核细胞来自于外周血，脐带血和骨髓，是脱离人体的组织。本发明中用于扩增的细胞可以是NK细胞；也可以是NK细胞和外周血单核细胞的不同组合；也可以是NK细胞或外周血单核细胞和别的淋巴细胞的不同组合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137混合物注射进人体血管后所作用的血液中所有白细胞的总和。本发明中的白介素2、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137来源于人，但不仅仅限于人，如注射或处理的对象是其它物种，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物种的白介素2、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137。
除非另有说明，本发明中所有的技术和科学词汇的含义是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的含义。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以找到，例如，Benjamin Lewin，Genes VIII，Oxford University Press，2004(ISBN 0-13-145140-5)。
为了确保长期，高收益的生产重组白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137，本发明采用了蛋白稳定表达***。构建蛋白稳定表达***是本行业内的具有普通技能的人士所通常采用的技术，具体方法可详见(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562细胞系转录了稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，这个载体中含有病毒启动子和选择标记基因，如抗生素抗性基因。CD8α是一种在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白。外源表达载体进入宿主细胞后，用恰当的方法激活启动子，培养细胞一段时间后即可以得到在细胞膜上高水平表达的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽。这些方法是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的方法。
在K562细胞膜上高水平表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的细胞可以通过高速离心的方法收集，K562细胞可以通过这些技术包括但不限于下面所列的方法处理：强酸，强碱和辐照。处理后的细胞可以直接与外周血淋巴细胞(PBMC)或NK细胞共同培养，激活扩增NK细胞，也可以纯化分离后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞。
在细胞膜上高水平表达的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137可以通过本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的技术来纯化和分离。这些技术包括但不限于下面所列的方法：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素。如有必要，蛋白质复性的方案可用来帮助纯化表达的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色谱法(HPLC)可作最后的纯化步骤进一步纯化蛋白质。本发明中在宿主细胞内表达的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137会有一部分分泌到细胞培养上清液中。本行业内的具有普通技能的人士都可以根据普通的生物化学技术来验证。分泌到细胞培养上清液中的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137也可以通过上述方法纯化和分离。
细胞膜为跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137提供了固相支撑，这固相支撑包括但不仅仅限于金属、玻璃、塑料、聚合物、颗粒、微小颗粒、磷脂、磷脂双分子层、细胞膜和类似物。重要的是固相的表面能够粘附上述蛋白质。
跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137也可以通过标准的操纵核苷酸编码序列的方法来生产。例如，用特定的，非特定的定点突变或其他分子生物学技术来生产功能等同的，但一级结构不相同的多肽。简单的一个或多个氨基酸修改如果不影响蛋白质的生化特性，这些通过氨基酸保守替换产生的蛋白质也在本发明保护的范围之内。
本发明中转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞扩增的NK细胞，可以用来进行自体移植，也可以进行异体移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原与捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和扩增的细胞可以通过静脉滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些应用中，细胞系(例如，NK细胞系，NKT细胞系)也可以通过转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞进行激活和扩增。扩增的细胞系用于制备治疗疾病的药物也是本发明的保护范围。
淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞可从来源于包含有大量淋巴细胞和前体细胞的任何组织。例如，外周血(包括脐带血)，骨髓，脾脏和***。淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞通常取自于外周血或骨髓。在其他应用中(例如，实验研究)，脾脏和/或***也是合适的来源。
例如，淋巴细胞可以通过抽外周血和/或骨髓来获得。淋巴细胞可以进一步经过纯化得到NK细胞和NKT细胞。纯化NK细胞，NKT细胞的步骤和工艺是本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴细胞可以通过密度梯度离心的方式来分离血液或骨髓中的血红细胞，淋巴细胞和其他细胞。NK细胞和NKT细胞可以利用抗体介导的亲和制备方法进一步纯化，例如抗体结合磁珠法。纯化淋巴细胞并不要求纯化的淋巴细胞绝对纯，而是指纯化的细胞比其在来源组织中所占的比例更高。通常情况下，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％，或者60％，或者更高。纯化的NK细胞和NKT细胞悬浮在一个合适的生理缓冲溶液中，然后悬浮生长于但不局限于下列培养液中，Eagle′s培养液加入10％人血清，RPMI 1640加入10％人血清，F-10(Ham′s)Nutrient mixtures加入10％人血清。人血清也可以用10％胎牛血清取代，但人血清对NK细胞的扩增效果更好。
淋巴细胞和/或纯化的淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞悬浮生长于细胞培养液中，加入辐照后转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2培养，每周加入新的转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞。通常情况下为了降低成本和避免感染，本发明采用最小的剂量来扩增NK淋巴细胞。白介素2的剂量在50单位/毫升到1000单位/毫升之间。在某些情况下，白介素2复合物的剂量至少在500单位/毫升以上。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，激活浓度约为500单位/毫升或1000单位/毫升。另外，跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137直接注射入人体，用来在体内扩增NK细胞时，所用剂量在0.5皮摩到0.5钠摩之间。转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞的采用剂量按照跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137在K562中的表达剂量来确定。在某些情况下，按照K562∶外周血单核细胞＝1∶1，2∶1，3∶1，4∶1或以上加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，按照K562∶外周血单核细胞＝10∶1或以上加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞。在体外扩增的NK细胞可以移植给单核细胞的捐助人本身或者受捐助人，以加强天生或抗原特异性免疫反应。通常情况下，扩增的NK细胞通过溶于生理盐水溶液的方法静脉滴注。
有益效果：本发明通过转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2培养扩增激活的NK提高病人的免疫力来帮助病人抵抗肿瘤，抵抗病毒和细菌。
附图说明
图1NK细胞体外扩增线性图，显示NK淋巴细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下线性增长，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增NK细胞作为对照；
图2PBMC细胞体外扩增线性图，显示淋巴细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下线性增长，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增淋巴细胞作为对照；
图3PBMC细胞体外扩增前后流示仪数据图，PBMC细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下培养14天后NK细胞(CD56+，CD16+和CD56+/CD16+)的比例显著增长，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC细胞作为对照；
图4NK细胞杀伤肿瘤细胞图，人PBMC细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下，培养14天后NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤作用，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照；
图5NK细胞杀伤TAM细胞，人PBMC细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下，培养14天后NK细胞对TAM细胞的杀伤作用，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照；
图6扩增激活后人NK细胞对小鼠体内PC3肿瘤细胞系的杀伤作用图，转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下，培养14天后NK细胞对小鼠体内的PC3细胞有较强的杀伤作用，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照图；
图7转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增PBMC中的NK细胞图，培养14天后NK细胞显著提高肿瘤小鼠的存活率和延长小鼠平均寿命，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照图。
具体实施方式
下面对本发明的实施作具体说明：
以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即可以得到在细胞膜上的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽；经培养后的K562细胞膜上具有表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的细胞，通过强酸，强碱、和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞；或对K562细胞的依次用硫酸铵或乙醇沉淀，强酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素进行纯化收集；将上述离心收集的K562细胞与NK细胞、或NK细胞和外周血单核细胞的组合、或是NK细胞与淋巴细胞的组合、或是外周血单核细胞和其它淋巴细胞的组合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137与白细胞的组合进行共同培养、或在纯化分离K562细胞后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞，直至NK细胞代表总数的50％以上。
实施例1扩增NK细胞。
取NK细胞(2x107)培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞(辐照，100Gy)和白介素2(50单位/毫升)后培养7天。7天后离心，用等量的培养液重悬，加入经过辐照的转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞，再培养7天，如图1所示。高剂量白介素2(200单位/毫升)作为对照组。如图1所示，NK细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加。细胞数量的增加可以通过***胸苷的方法来测定。胸苷***之后细胞继续培养12小时，然后再开始测量细胞数量的变化。在K562∶NK淋巴细胞＝1∶1浓度的作用下NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长了2200倍。在加入滋养细胞后，NK细胞在50单位/毫升的白介素2作用下即可开始增长。转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞对于促进NK细胞生长的作用明显强于转染跨膜白介素2和CD137的K562滋养细胞(14天时约强2.4倍)。
实施例2跨膜白介素21-CD137复合物扩增未经纯化的外周血淋巴细胞
转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞不仅可以扩增纯化的NK细胞，还可以扩增未经过纯化的淋巴细胞。健康捐献人的PBMC培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞(辐照，100Gy)和低剂量白介素2后共同培养7天。7天后离心，用等量的培养液重悬，加入经过100Gy辐照的滋养细胞，再培养7天，如图2所示。转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞作为对照。NK细胞在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加。NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长了2100倍。转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞对于促进外周血淋巴细胞中NK细胞生长的作用明显强于转染跨膜白介素2和CD137的K562滋养细胞(14天时，2.1倍)。
在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下，第14天时95％的淋巴细胞变成NK细胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)，如图3所示。对照组细胞在转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞作用下，外周血淋巴细胞有91％细胞变成NK细胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。
实施例3扩增后的NK细胞对肿瘤细胞和TAMs(肿瘤相关巨噬细胞)的裂解作用
在转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞对肿瘤细胞的裂解作用
以前的研究表明给患肿瘤的小鼠注射白介素2能够增强小鼠的抗肿瘤能力，延缓小鼠的寿命。本实施例采用转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞与肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞共同培养的方法，来研究用扩增的NK细胞进行抗肿瘤的可行性。本实施例采用转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞注射小鼠体内治疗小鼠体内肿瘤的方法，来研究扩增的NK细胞抗肿瘤的效果。
将健康捐献者的淋巴细胞中分离出来后，加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞生长14天。K562和肿瘤相关巨噬细胞被用来作为裂解的靶细胞。K562是B细胞肿瘤细胞系，该细胞系是血液肿瘤细胞系。IL-4，IL-10和IL-13处理后的单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞被用来作为裂解的靶细胞。扩增的NK细胞和靶细胞按照适当的比例共同培养6小时后检测存活的靶细胞。转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞作为对照组。
转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞与对照组NK细胞对K562靶细胞的杀伤作用相当，而对肿瘤相关巨噬细胞的杀伤作用则显著增强，p＜0.05，如图5所示。
体外用Lentivirus***构建Fluc报告基因稳定表达的PC3细胞系。Fluc Lentivirus***购自System Biosciences(美国，加州)，具体构建方法详见产品介绍。PC3-Fluc细胞静脉注射进严重免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)，21天后荧光检测器检测肿瘤的生长情况，随机分组。扩增后的NK细胞按照1x107细胞/每只小鼠自尾静脉注射，一周两次。连续治疗四周后停止治疗，观察治疗效果。图6显示治疗14天后肿瘤报告基因的荧光信号。转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用。转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞比对照组NK细胞PC3肿瘤细胞的杀伤作用强。图7显示，对照组的NK细胞对延长小鼠的存活率有一定的作用。而与对照组相比，转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞显著提高了对肿瘤的治愈率，显著延长了小鼠的存活率。这提示转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞可以用于临床的肿瘤治疗。
在本发明的实施例中提供了一个可以用来制成药物的方案，按照这个方案制成的药物可以有下面所描述的多种用途。这个方案包括白介素2、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137。利用本方案扩增的NK细胞适用于需要增强病人免疫力的各种情景。例如，扩增NK细胞对***特别有效，如急性髓细胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，***肿瘤，恶性黑色素瘤和肾细胞恶性肿瘤，但不仅仅限于上述肿瘤。例如，扩增NK细胞对治疗细菌，真菌或寄生虫内感染特别有效。扩增的NK细胞对治疗病毒感染特别有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不仅仅限于上述病毒感染。扩增的NK细胞可以显著提高抗原的作用效果。
本发明中转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞可用来扩增NK细胞，也可以移植病人。体外扩增的NK细胞可移植病人。例如，跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137和低剂量白介素2扩增激活NK细胞的方法比用仅转染跨膜IL-21和CD137的K562细胞激活扩增NK细胞的方法，扩增的效率高2.4倍。两个星期后，NK细胞的纯度可以达到95％，细胞的数量可以达到1.0x1010以上，满足临床治疗的需求，如图4所示。

Claims (8)

1.一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；
(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即可以得到在细胞膜上的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽；
(3)经培养后的K562细胞膜上具有表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的细胞，通过强酸，强碱、和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞；或对K562细胞的依次用硫酸铵或乙醇沉淀，强酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素进行纯化收集；
(4)将上述离心收集的K562细胞与NK细胞、或NK细胞和外周血单核细胞的组合、或是NK细胞与淋巴细胞的组合、或是外周血单核细胞和其它淋巴细胞的组合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137与白细胞的组合进行共同培养、或在纯化分离K562细胞后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞，直至NK细胞代表总数的50％以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中的培养液为：Eagle′s培养液加入10％人血清或10％小牛血清，或RPMI 1640加入10％人血清或10％小牛血清，或F-10(Ham′s)Nutrient mixtures加入10％人血清或10％小牛血清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在50pM～1nM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在500pM～800pM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137是经过纯化处理的蛋白质，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137组成的淋巴细胞在K562细胞中的表达剂量比例是，K562细胞∶淋巴细胞＝1～10∶1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的淋巴细胞中加入跨膜白介素21-CD137复合物，且K562细胞∶淋巴细胞＝1∶1、2∶1、3∶1、或4∶1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137扩增的NK细胞过程是通过溶于生理盐水溶液的方法进行。
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